단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

SM FISH는 특정 RNase의 수준과 국소화를 정확하게 정량화합니다. 이 방법은 RNA의 대립유전자 변이에 의한 세포 대 세포 및 대립유전자를 분석하는 데 특히 유용합니다. 유전자 전사는 세포 생물학에서 필수적인 과정이며, SM FISH는 단일 세포 수준에서 외부 자극에 대한 반응으로 RNA 함량을 조사하고 공간 정보를 제공할

에스트로겐 수용체 작용제 치료 후 칼슘과 마그네슘이 함유된 냉간 멸균 PBS로 세포를 세척하고 얼음 위에서 30분 동안 500마이크로리터의 고정 완충액으로 세포를 고정합니다. 배양이 끝나면 칼슘과 마그네슘이 함유된 냉간 멸균 PBS로 세포를 3분 동안 두 번 세척한 후 각 웰에 70% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 24웰 플레이트를 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉하고 플레이트를 섭씨 4도의 회전기에 최소 4시간에서 최대 16시간 동안 놓습니다.

RNA FISH hybridization의 경우, 배양 종료 시 10% 포름아미드가 보충된 500마이크로리터의 2X SSC 완충액으로 세포를 회전자에서 실온에서 5분 동안 한 번 세척합니다. 배양하는 동안 노출되지 않은 파핀 플라스틱 필름 조각을 유리 페트리 접시에 넣고 RNA 표면으로 세척한 오염을 제거하고 접시 가장자리를 따라 물에 적신 종이 타월을 멸균합니다. 배양이 끝나면 GREB1 인트론 및 GREB1 엑손 프로브 버퍼에 새로 준비된 30마이크로리터 방울을 균일한 간격으로 파라핀 플라스틱 필름의 깨끗한 면에 놓고 멸균 집게를 사용하여 세포면의 커버 슬립 하나를 기포 없이 각 방울에 부드럽게 놓습니다.

파라핀 플라스틱 필름으로 접시를 밀봉한 후 접시를 호일로 덮고 평평하고 회전하지 않는 표면에서 섭씨 37도의 온도에서 밤새 접시를 배양합니다. 다음날 아침, 집게를 사용하여 커버 슬립을 24웰 플레이트 셀 쪽이 위로 향하게 하여 가열된 회전기에서 섭씨 37도에서 세척당 10%포름아미드가 보충된 500마이크로리터의 신선한 2X SSC 완충액에서 15분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 2X SSC 완충액에 있는 DAPI 1밀리리터당 1마이크로그램으로 DNA를 로테이터에서 실온에서 10분 동안 대조염색한 후 실온에서 2X SSC 완충액으로 5분 세척합니다.

종이 타월을 사용하여 과도한 2X SSC 버퍼를 제거하고 샘플을 뉴클레아제가 없는 물로 헹구어 과도한 염을 제거합니다. 그런 다음 비경화 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 샘플 이미징의 경우, 예상되는 강도가 가장 높은 슬라이드를 sCOMS 카메라의 60배 또는 100배 오일 대물렌즈가 장착된 광시야 에피형광 현미경 스테이지에 로드하고 이멀젼 오일 한 방울을 대물렌즈에 놓습니다.

Zstack 획득의 경우 DAPI 채널의 샘플에 초점을 맞추고 DAPI 염색 핵이 초점에서 벗어나는 거리에서 Zstack의 상단과 하단을 선택합니다. 슬라이드를 사용하여 광원의 조명량과 각 채널의 노출 시간을 최적화하고 사진 표백 및/또는 카메라 픽셀 채도를 방지하는 조건에서 모든 슬라이드에서 이미지를 획득합니다. 획득 후 적극적인 복원 알고리즘의 10 사이클을 사용하여 이미지를 디컨볼루션하고 사용된 카메라의 비트 심도에 따라 모든 프로젝션 이미지를 저장합니다.

이미지 분석을 위해 먼저 GitHub에서 Jupiter Notebook을 다운로드하고 Python Anaconda Distribution 버전 3.6 이상을 설치합니다. Anaconda 프롬프트를 열고 설치 명령을 입력하여 Anaconda용 SimpleITK를 설치합니다. Anaconda Navigator를 열고 Jupiter Notebook을 시작합니다.

디렉토리와 파일을 보여주는 웹 브라우저가 열립니다. 디렉터리 구조를 탐색하여 GitHub에서 다운로드한 Jupiter Notebook이 포함된 디렉터리에 도달합니다. 그런 다음 Notebook을 열고 Shift 및 Enter 키를 눌러 각 셀을 실행합니다.

이 대표적인 실험에서는 부착된 유방암 세포를 에스트로겐 수용체 작용제 또는 비히클로 24시간 동안 처리했습니다. GREB1, 인트론 및 엑소닉 염기서열에 대해 스펙트럼으로 분리된 프로브 세트를 통해 초기 및 성숙 mRNA를 동시에 시각화하고 정량화할 수 있었습니다. 중요한 것은, 에스트로겐 반응 시간 과정의 일부로 나타난 각 세포의 전사 활성 대립유전자의 수를 표시할 수 있다는 것입니다.

겹치는 인트론 및 엑손 스폿을 계수한 결과, E2 처리된 세포는 비히클 처리된 세포에 비해 2개 이상의 활성 GREB1 대립유전자를 나타내는 세포 분획이 4배 증가한 것으로 확인되었습니다. 초기 mRNA에서 인트론을 접합하여 엑손 염기서열로만 구성된 성숙한 mRNA를 생성함에 따라 세포당 성숙한 mRNA의 수는 녹색 반점의 수를 정량화하여 계산할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 데이터를 플로팅하면 성숙한 GREB1 mRNA 세포의 분포 변화와 E2 처리 후 세포 집단의 응집체 폴드 변화를 관찰할 수 있습니다.

C-FISH는 여러 RNA 종을 순차적으로 조사할 수 있고, MERFISH는 다중화를 대규모로 증가시키는 바코드 기술이며, iFISH는 RNA와 단백질을 동시에 연구하는 데 사용됩니다.