Name: 단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 배우세요 단일 분자 RNA 형광 원위교잡법(smFISH)을 활용한 단일 세포 수준 전사 활성 알레일 분석 방법입니다. 이 기술은 유전자 발현 역학과 세포 간 변이를 정량적으로 연구하는 데 활용됩니다.

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MAM, FS 및 MGM은 NIEHS (프로젝트 4, P42ES027704, PI, Rusyn)에 의해 투자됩니다. MAM, FS, RMM, MGM 및 PKS는 고급 현미경 및 이미지 정보학을 위한 CPRIT 자금GCC 센터(RP170719)에 의해 지원됩니다. 이미징은 또한 NIH (DK56338, CA125123), CPRIT (RP150578), 댄 L. 던컨 포괄적 인 암 센터, 화학 유전체학을위한 존 S. 던 걸프 해안 컨소시엄의 자금조달과 베일러 의과 대학의 통합 현미경 코어에 의해 지원됩니다.

최적의 결과를 보장하기 위해 이 프로토콜의 습식 실험실 부분에는 모든 단계에서 표준 RNase 가 없는 주의해야 합니다. 예를 들어, 여과 된 파이펫 팁, 멸균 용기 및 RNase 가없는 버퍼의 사용은 매우 권장됩니다. 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체와 같은 RNase 억제제도 사용하며, 특히 낮은 풍부도 표적 RNA를 위해 제안된다.
1. 세포 배양 및 실험 설정
<ol><li>Fhenol-red 무료 (호르몬 자극 실험에만 필요) 덜벡코의 수정 된 독수리의 매체 (DMEM)와 T75 조직 배양 플라스크에서 준수 MCF-7 유방암 세포 (ATCC #HTB-22)를 유지 10% 태아 소 혈청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 2 mM L-glutamine, 1 nM 나트륨 피루바테, 50 I.U./mL 페니실린 및 50 μg/mL 연쇄 절제술.</li>
	<li>산에 새겨진 폴리 D-리신 코팅 둥근 커버립(0.16 ~ 0.19 mm 두께, 12mm 직경)을 24개의 멀티웰 조직 배양 플레이트에 넣습니다. 참고: 표준 프로토콜에 따라 멸균 PBS(Ca++ 및 Mg++)로재구성된 폴리 D-lysine의 1 mg/mL 용액으로 커버립과 코트를 산에 식히기 위해 1 M HCl을 사용합니다.</li>
	<li>세포에서 성장 매체를 제거하고 멸균 PBS (Ca++ 및 Mg++없이 인산염 완충식식염)로 한 번 세척하십시오. 트립신-EDTA 0.25% 용액의 2-3 mL를 사용하여 MCF-7 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면 동일한 양의 성장 매체로 트립신-EDTA 0.25% 용액을 중화시합니다.</li>
	<li>미디어 서스펜션의 세포를 15mL 원상 튜브로 옮기고, 세포를 배출하기 위해 391 x g에서 1분 동안 회전합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 원문 관으로부터 미디어를 조심스럽게 제거하고 적절한 양의 치료 매체에서 세포를 다시 중단한다. 참고: 치료 매체는 페놀 레드 프리 DMEM5% 숯-dextran 박탈 및 투석 FBS, 2m L-글루타민, 1 nM 나트륨 피루바테, 50 I.U./mL 페니실린 및 50 μg/mL 연쇄 절제술로 보충됩니다. 이 매체는 혈청 성분이 주로 미디어를 제거 숯에 의해 스테로이드의 고갈으로 스테로이드 호르몬 자극 실험에 필수적이다, 투석을 통해 성장 인자를 감소.</li>
	<li>500 μL의 처리 매체에서 잘 당 60,000에서 70,000 세포에서 24 멀티웰 플레이트에서 커버립에 세포를 시드. 이 실험을 위해, 세포 합류는 처리 개시시 약 70-80%이어야 합니다. 세포 유형, 성장 속도 및 실험 의 길이에 따라 세포 파종 밀도를 최적화하여 연결성을 방지하여 이미지 분석을 복잡하게 만듭니다. 참고: 최상의 이미징 및 이미지 분석을 위해 세포 응집을 피하십시오. 이를 위해, 우물에 분배하기 전에 세포를 파이프팅(또는 잠시 소용돌이)하여 세포의 알리쿼트(aliquot)를 철저히 섞는다. 도금 된 세포를 인큐베이터에 다시 넣기 전에 세포가 조직 배양 후드에 약 20 분 동안 정착하게하면 세포 응집을 줄이는 데 도움이됩니다.</li>
	<li>성장 매체의 박탈/투석혈에 남아 있는 임의의 신호 분자로 인해 세포 주기 동기화 및 배경 감소를 보장하기 위하여 처리의 앞에 적어도 이틀 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>치료 매체에서 48시간 배양 후, MCF-7 세포를 10nM 17β-estradiol(E2) 및 차량 제어(DMSO)로 24시간 동안 치료 매체에 희석시 치료한다. 이 치료는 최대 반응을 유도 하기 위해 E2의 포화 복용량을 사용 하 여. 다른 표적 유전자, 세포 모델 및 치료 유형에 대한 조건을 경험적으로 결정하기 위해 시간 과정 및 용량 반응 실험을 수행하십시오. 예를 들어 최근 간행물7을참조하십시오.</li>
</ol>2. 버퍼 준비
<ol><li>고정 버퍼를 준비하려면 정제된 단황 포름알데히드(전자 현미경 공급업체가 16% 파라포름알데히드로 판매)에서 멸균 PBS Ca++/Mg ++(인산염 완충식식염플러스 Ca+++ Mg+++)에서 4%로 희석합니다. 바나딜 리보뉴클레오시드 복합체(VRC)를 고정 버퍼에 추가하여 RNA 분해를 지연시키는 2mM의 최종 농도를 가한다.<ol>
<li>24 멀티웰 플레이트의 웰당 고정300-500 μL을 요구하여 고정 버퍼의 총 양을 계산합니다. 고정 단계에서 필요할 때까지 4% 포름알데히드를 얼음 위에 보관합니다. 참고: 각 실험에 대해 고정 버퍼를 새로 만듭니다. 주의: 포름알데히드는 피부를 통해 흡수되는 테라토겐입니다. 이 화학 물질을 기관 규정에 따라 적절한 PPE와 함께 연기 후드에 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>투과성 단계의 경우 뉴클레아제 프리 워터에서 70% 에탄올을 준비한다. 대체 옵션은 멸균 PBS Ca++/Mg++ VRC 2mM의 트리톤 X100 0.5% 트리톤-X100입니다. 우물당 500μL의 버퍼를 활용하여 필요한 총 충류 버퍼를 계산합니다.</li>
	<li>혼성화 완충제의 9mL을 준비하려면, 2mL의 스톡 50% dextran 황산염, 20x SSC(식염수 질나트륨 구연산) 버퍼 1mL을 6mL의 뉴클레아제 프리 워터에 첨가한다. 소용돌이는 혼성화 버퍼를 철저히 혼합합니다. 이 버퍼는 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>2배식식염수(SSC) 버퍼가 필요한 5개의 별도 세척 단계가 있습니다. 세척 단계당 커버슬립당 500μL의 버퍼를 예상하여 필요한 2배 SSC 버퍼의 최종 부피를 계산합니다. 핵이 없는 물에 필요한 양의 재고 20배 SSC 버퍼를 희석시. 2mM VRC를 추가하여 추가 예방 조치로 단계를 세척할 수 있습니다. 이 버퍼는 처리 단계의 기간 동안 실온에서 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>3. RNA 물고기에 대한 고정
<ol><li>치료 후, 우물에서 미디어를 제거하고 멸균, 차가운 PBS Ca++/ Mg++한 번 세척. 낮은 준수 세포 모델이 사용되는 경우, 액체를 흡인하기 위해 진공을 사용하지 마십시오. 수동 파이펫을 사용하여 우물 의 측면에서 미디어를 조심스럽게 제거하고 초기 세척 단계를 생략하십시오. 얼음 위에 30분 동안 500 μL 고정 버퍼를 추가합니다. 참고: 시료가 RNA 분해되기 쉬운 경우 이 시점에서 세척 단계에 2mM VRC가 있는 멸균 PBS를 사용하십시오.</li>
	<li>고정을 제거하고 제도적 규정에 따라 화학 폐기물에 폐기하십시오. 차가운 멸균 PBS Ca ++ /Mg+++로세포를 3분간 두 번 씻으십시오.</li>
	<li>PBS를 제거하고 각 우물에 70% 에탄올의 500 μL을 추가합니다. 파라핀 플라스틱 필름으로 24 개의 우물 판을 밀봉하십시오. 회전기에 4°C에서 최소 4시간 동안 놓습니다. 하룻밤 사이에 70%의 에탄올에 샘플을 두는 것이 가장 좋습니다. 프로토콜은 이 시점에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 70% 에탄올에서 최대 1주일 동안 저장할 수 있습니다. 참고: PBS의 0.5% Triton-X100은 2mM VRC 솔루션을 대체할 수 있습니다. 이 투과화 버퍼의 500 μL에서 회전자의 실온에서 20분 동안 샘플을 배양합니다. 이 permeabilization 버퍼를 활용하는 경우 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지할 수 없으며 혼성화 단계를 통해 계속해야 합니다.</li>
</ol>4. RNA 물고기에 대한 혼성화
<ol><li>투과성 버퍼를 제거하고 회전기의 실온에서 5분 동안 2x SSC 버퍼의 500 μL과 10% 포르미미드로 1회 세척합니다.</li>
	<li>완전한 혼성화 버퍼를 준비합니다. 커버슬립당 완전한 혼성화 버퍼약 30μL를 계산합니다. 하이브리드화 버퍼에 폼아미드를 추가하여 필요한 백분율에 도달합니다. 예를 들어, 완전한 혼성화 버퍼의 500 μL이 필요한 경우, 이전에 만들어진 혼성화 버퍼의 450 μL과 분자 등급 폼아미드의 50 μL으로 구성되어 10% vol/vol에 도달하게 됩니다. 소용돌이가 짧게 섞어. 주의: 포르마미드는 피부를 통해 흡수되는 테라토겐입니다. 기관 규정에 따라 적절한 PPE와 함께 연기 후드에이 화학 물질을 사용합니다.</li>
	<li>GREB1 인트론(Atto 647N으로 레이블이 지정) 및 GREB1 엑손(Quasar 570으로 레이블) 프로브1:300을 혼성화 버퍼에서 희석시 희석시. 파이펫팅을 통해 섞으세요. 이 버퍼를 빛으로부터 보호하고 즉시 사용하십시오. 참고 : 프로브는 스토시 외7에상세한대로 설계 및 제조되었다. 프로브는 일반적으로 제조 업체 프로토콜(14)에따라 RNAse-free TE 버퍼로 재구성되어야하는 말린 올리고뉴클레오티드 프로브 풀로 제공됩니다. 따라서 이러한 프로브의 재고 용액은 12.5 μM이었습니다. 프로브의 작동 농도는 42 nM입니다.</li>
	<li>하룻밤 혼성화 단계를 위해 가습 챔버를 준비합니다. 노출되지 않은 파라핀 플라스틱 필름 조각을 표면 데쿤타미넌트로 청소한 유리 페트리 접시에 놓고 RNases를 제거합니다. 두 개의 종이 타월을 멸균물로 포화시키고 페트리 접시 가장자리를 따라 배치하여 건조가 특정 라벨링을 파괴할 수 있기 때문에 습도를 제공합니다.</li>
	<li>파라핀 플라스틱 필름의 깨끗한 측면에 하이브리드화 버퍼에 프로브의 30 μL을 점팅하여 프로브를 알리쿼트합니다. 커버립이 서로 접촉하지 않도록 프로브의 알리쿼트를 배포합니다.</li>
	<li>살균 된 집게를 사용하여, 부드럽게 유리 페트리 접시에 프로브에 커버립 셀 측면을 뒤집습니다. 기포를 피하고 커버립에 압력을 가하지 마십시오. 참고: 후속 단계에 필요한 대로 2x SSC 버퍼로 조직 배양 판을 버리지 마십시오.</li>
	<li>파라핀 플라스틱 필름으로 유리 페트리 접시를 밀봉하고 형광에 빛이 노출되는 것을 방지하기 위해 호일로 접시를 덮습니다. 평평한 비회전 표면에 37 °C에서 최대 16 시간 까지 하룻밤 동안 배양하십시오. 잠복기시간은 경험적으로 다양할 수 있지만 최소 4시간이 권장됩니다. 참고: 커버립은 혼성화 버퍼에서 배양할 때 미끄러지기 쉬어 커버슬립의 건조 한 반점과 시료를 손상시킬 수 있습니다.</li>
</ol>5. 이미징용 샘플 준비 
<ol><li>다음 날, 집게를 사용하여 가습 챔버에서 커버립을 제거하고 셀 측이 위로 24 우물 플레이트로 돌려놓습니다. 신선한 2x SSC 버퍼 500 μL과 10% 폼아미드를 추가하여 과도한 프로브와 비특이적 혼성화를 씻어냅니다. 참고: 이 시점부터 샘플을 빛으로부터 보호합니다.</li>
	<li>가열 된 회전기에서 각각 37 ° C에서 2 x SSC 버퍼500 μL과 10 % 포르마이드로 셀을 두 번 씻으하십시오.</li>
	<li>2x SSC 버퍼에서 1 μg/mL에서 DAPI를 사용하는 카운터스테인 DNA는 회전기의 실온에서 10분 동안 완충합니다.</li>
	<li>실온에서 2x SSC 버퍼로 1회 세척합니다.</li>
	<li>커버립을 종이 타월로 2배 SSC 버퍼를 제거하고 핵자유수로 빠르게 세척하여 과도한 염을 제거한 후 경화되지 않는 마운팅 미디어를 사용하여 유리 슬라이드에 커버립을 장착합니다. 마지막으로, 명확한 매니큐어로 커버립을 밀봉.</li>
</ol>6. 고해상도 현미경 검사및 이미지 처리
<ol><li>60x 또는 100x 오일 목표와 sCMOS 카메라를 사용하여 광야 피불화 현미경의 샘플을 이미지합니다. 이 실험에 사용되는 특정 현미경 및 목표에 대한 재료 테이블을 참조하십시오.<ol>
<li>시료가 완전히 처리되는 즉시 완전한 이미징을 통해 신호의 시간 의존적 저하를 방지합니다. 참고: 굴절률(RI)이 1.516인 침수 오일이 이 실험에 사용된다. RI 불일치로 인해 이미지 감소에 영향을 주는 포인트 스프레드 함수의 수차가 발생하므로 오일 RI를 특정 샘플과 일치시키기 위해 경험적 테스트를 수행해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지는 0.10827 μm의 측면 픽셀 크기로 캡처됩니다.</li>
	<li>가장 높은 강도(즉, 양양성 컨트롤)를 가질 것으로 예상되는 시료를 사용하여 각 채널(DAPI, TRITC, CY5 필터)에 대한 광원(즉, 백분율 전송)과 노출 시간(DAPI, TRITC, CY5 필터)으로부터의 조명 양을 최적화합니다. 이 실험에서, E2 처리된 견본은 GREB1 프로브 세트 둘 다에 대해 더 높은 세기를 가질 것으로 예상됩니다. 일반적으로 GREB1 인트론 및 엑손 프로브의 백분율 전송은 50 ~ 100 %이며 노출 시간은 0.25 - 0.60 초 범위입니다.</li>
	<li>또한 광표백 및/또는 카메라 픽셀의 채도를 방지하는 조건에서 이미지를 수집합니다. 우리의 경험에 따르면 배경과 신호 강도 사이에 최소 ~ 10 배 차이가 있어야합니다. 몇 픽셀/필드의 포화는 샘플의 비특이적 신호(즉, 커버슬립의 먼지, 셀 외부의 프로브 골재)로 인해 발생할 수 있지만 포화 영역이 수량에 포함되지 않은 경우에만 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>z 스택의 인수를 설정하려면 DAPI 채널의 샘플에 초점을 맞춥니다. DAPI 염색 핵이 초점이 되는 거리에서 z 스택의 상단과 하단을 선택합니다. 우리가 사용한 z 스택 단계 크기는 슬라이스 당 0.25 μm이고 총 z 스택은 전체 셀 (MCF-7 셀에서 약 10 μm)에 걸쳐야합니다. 그러나 z 스택 단계 크기는 사용되는 목표에 따라 변경되며 나이퀴스트 샘플링 기준을 따라야 합니다. 참고: 인트론은 일반적으로 핵에만 존재합니다. 그러나, 엑소는 핵과 세포질에 둘 다 있습니다. 따라서, 전술한 바와 같이 z-스택을 설정하면 z-스택이 전체 셀을 포괄함에 따라 대부분의 인트론 및 엑손 라벨을 캡처합니다.</li>
	<li>전형적으로, 예비 실험에서 정량적 분석을 위한 최소 200개의 세포를 이미지하여 세포 간의 반응 및 변화의 크기의 스냅샷을 캡처한다.</li>
	<li>일부 이미지 된 세포는 최종 분석에서 제외됩니다 (즉, 드롭 아웃 속도) 그들은 분석 파이프 라인에 의해 필터링될 것이기 때문에 (즉, 이미지의 테두리를 만지는 세포, 세포, 세포/ 소세포). 참고: 이미지 영역을 선택할 때 고려해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. DAPI 표지, 핵 형광에 의해 정의된 바와 같이 균일하게 퍼지는 비겹침 세포가 있는 지역을 선택합니다. 또한 부분 세포 수를 계산하지 않도록 이미지 영역의 가장자리를 따라 핵 수가 가장 적은 영역을 선택하십시오. 자동화되고 편견없는 이미징은 통계 적 분석을 필요로하는 실험에 항상 선호됩니다.</li>
	<li>수집 후 10사이클(예: 반복 횟수)을 사용하여 공격적인 복원 알고리즘을 사용하여 이미지를 데온볼브합니다. 이미지 분석을 위한 최대 강도 투영을 생성합니다(특정 3D 분석이 필요한 경우 이 단계를 생략하십시오). 사용된 카메라의 비트 깊이에 따라 모든 프로젝션 이미지를 저장합니다. 우리의 경우 16 비트 TIFF 그레이 스케일 이미지가 저장되었습니다. RGB 이미지는 비트 깊이가 감소하여 정보 손실이 발생합니다. 따라서 RGB 이미지는 이미지 분석에 적합하지 않습니다.</li>
</ol>7. 이미지 분석 
<ol><li>지침을 읽고 github(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis)에서jupyter 노트북을 다운로드합니다.</li>
	<li>파이썬 아나콘다 배포(https://www.anaconda.com/distribution/)버전 3.6 이상 설치합니다.</li>
	<li>아나콘다 프롬프트를 열고 설치 명령을 입력하여 아나콘다(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk)에대한 간단한 ITK를 설치합니다.</li>
	<li>아나콘다 네비게이터를 열고 주피터 노트북을 출시합니다. 디렉터리 및 파일을 보여주는 웹 브라우저를 엽니다. 디렉토리 구조를 탐색하여 github에서 다운로드한 주피터 노트북이 포함된 디렉토리에 도달합니다.</li>
	<li>프림을 열고 시프트를 누르고 동시에 입력하여 각 셀을 실행합니다.</li>
	<li>노트북에 제공된 각 기능 및 단계의 세부 사항을 따릅니다. 다른 이미지 집합의 경우 일부 매개 변수 값을 변경해야 할 수 있습니다. 참고: 간단히 말해서 핵은 블록 크기가 251픽셀인 로컬 임계값을 사용하여 DAPI 채널에서 분할되고 구멍이 채워지고 100픽셀 미만의 물체가 제거되었습니다. 터치 핵은 분수령 알고리즘을 사용하여 분할되었다. 핵 마스크는 100픽셀로 팽창하고 분수령을 사용하여 핵을 분지로 사용하여 접촉하는 물체를 분리하는 데 사용되었습니다. 정상 상태 RNA(엑슨)를 식별하기 위해 오츠 임계값이 사용되었습니다. 전사 활성 알레일(intron)의 경우, 먼저 가우시안 블러(sigma=1)가 적용된 다음 최대 엔트로피 임계값이 사용되었습니다.</li>
</ol>

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<li>Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+RNA+ISH%2C+RNA+FISH+and+protein-RNA+double+labeling+%28IF%2FFISH%29+in+Drosophila+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries.</a> Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).</li>
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</ol>

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설명된 smFISH 방법론은 이전에 게시된 프로토콜7,12,14를기반으로 합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 습식 실험실에서 최적화 된 중요한 단계를 설명 (파종 밀도 포함, 고정 시간, 과구화, 및 프로브 농도), 이미징 및 이미지 분석에, 유전자 전사의 단일 세포 분석을 수행에 관심이 실험실을위한 전체 실험 파이프 라인을 제공.
단일 세포 분석을 용이하게 하기 위해 셀이 하위 conconfluent이며 세포 경계없이 셀 테두리가 추정되도록 겹치지 않는 것이 중요합니다. 실험 기간 동안 세포 밀도를 최적화하기 위해 광범위한 파종 밀도에 걸친 세포 증식 분석서를 완료하는 것이 좋습니다.
성공적인 smFISH 실험에 최적의 고정 시간을 결정하는 것은 매우 중요합니다. ...

유전자 전사 및 번역은 DNA 서열에서 RNA로 단백질 1로 가는 생물학의 중앙 교리에 관여하는 2개의 중요한프로세스입니다. 이 연구에서는 전사 중에 메신저 RNA (mRNA)의 생산에 중점을 둡니다. 초기 RNA 분자는 비 코딩 인트론과 코딩 엑손을 모두 포함한다. 인트론은 mRNA가 리보솜2,3에서번역을 위해 세포질로 이동하기 전에 공동 전사적으로 접합된다.
전통적으로, mRNA의 측정은 RT-qPCR 또는 북부 블로팅과 같은 고전적인 소사와 세포의 대량 인구 (수억)에서 수행됩니다. 매우 강력하지만, 이러한 방법은 세포 간 변이(phenotypic 이질성), 전사 활성 적 진상화 수의 식별, 그리고 아마도 더 중요한 것은 공간 정보가 부족하기 때문에 제한적입니다. 최근에는 단세포 RNA 염기서열분석(RNA)을 허용하는 게놈 와이드 기술이 이미징 방법과 시퀀싱4사이의 격차를 해소하기 시작했다. 그러나, RNAseq는 상대적으로 낮은 검출 효율성으로 고통받고 처리 단계는 공간 정보의 완전한 손실을초래5. 단하나 세포 RNAEq는 동종 세포의 인구 들 사이에서 표현성 이질성에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 시투 혼성화 (RNA-FISH)에서 RNA 형광은 공간 수준에서 표적 유전자 발현의 보다 완전한 탐구를 용이하게 할 수 있으며, 골자별 기준6,7.
RNA FISH는 고정 된 세포에서 표적 RNA 분자의 검출 및 국소화를 허용하는 기술이다. 이전, 고된 방법과 는 달리, 현재의 최첨단 RNA-FISH는 표적 RNA 서열에 상보적인 상업적으로 이용가능한 핵산 프로브를 이용하고, 이들 프로브는 왓슨 크릭 베이스 페어링8에의해 그들의 표적에 혼성화된다. 초기 시투 혼성화 기술은 1969년에 Gall 및 Pardue에 의해 확립된 유사한 프로토콜을 포함했으며, 시료는 표적 RNA9에특별히 혼성화된 핵산 프로브로 처리되었다. 원래 분석은 방사성 또는 색탐지를 사용하여 수행되었다; 그러나, 1980년대에, DNA FISH 및 이후 RNA FISH에 대한 시투 혼성화(FISH) 프로토콜의 형광개발은 보다 민감한 검출을 향한 경로를 열어,10,11을멀티플렉스화할 수 있는 가능성을 열어놓았다.
RNA FISH의 추가 발달은 단일 RNA 분자(smFISH)12,13을검출하고 정량화하는 능력을 주도하였다. 직접 검출은 프로브 자체가 형광으로 표시되는 방법입니다. smFISH의 과제는 형광 신호의 검출을 구별되는 회절 제한 반점으로 쉽게 감지할 수 있는 충분한 혼성 화 프로브/대상이 필요하다는 것입니다. 이 문제를 해결하기 위해,표적 RNA8,12,14의다양한 부위에 보편화된 짧은 단하나 좌초 DNA 올리고뉴클레오티드의 프로브 세트를 사용할 수 있다. 여러 프로브의 결합은 국소 형광 밀도를 증가시켜 RNA를 형광 현미경 검사법에 의한 뚜렷한 고강도 지점으로 볼 수 있게 합니다. 이 방법은 프로브 세트 풀에서 올리고뉴클레오티드의 오프타겟 결합이 실제 신호와 스퓨리어스 올리고뉴클레오티드 결합을 구별하기 위해 스팟 크기와 강도를 정량적으로 분석함으로써 진정한 RNA 스팟 신호와 구별될 수 있기 때문에 유리하다12.
mRNA를 검출하는 대체 방법은 고전적인 BAC 클론 기반닉 번역 방법 및 최근에 개발된 분기 DNA 시스템이다. BAC-복제, 닉 번역 방법에서, 표지되는 DNA는 효소-별명이 있고 새로운 뉴클레오티드가 노출된 3'끝에 추가된다. DNA 중합체의 활성은 원하는프로브(15,16)의결과로 표지된 뉴클레오티드를 추가한다. 분지 된 DNA 기술은 RNA 표적에 쌍으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하고 이 프로브는 다중 신호 증폭 분자를 사용하여 증폭된다. 이 방법은 신호 대 잡음 비율을 크게 향상시킬 수 있지만 형광 반점이 크기와강도(17)에서격렬하게 다를 수 있기 때문에 증폭이 정확한 수량을 왜곡할 수 있다.
이 프로토콜의 모델 시스템으로, 이는 칼리프 슈퍼펀드 연구 프로그램 참여의 일환으로 갤버스턴 베이/휴스턴 선박 채널에서 내분비 방해 화학물질의 효과를 정량화하기 위해, ER 작용제, 17β-estradiol(E2)7,18, 189로하룻밤 치료된 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 세포주 MCF-7을 사용하였다. E2는 프로토타입 ER 표적 유전자, GREB17,20,21,22를포함하는 많은 ER 표적유전자를조절한다. 여기에 설명된 smFISH 프로토콜은 GREB1을 대상으로 하는 두 개의 스펙트럼 분리 프로브 세트 세트를 활용합니다. 하나는 엑손과 다른 인트론에 혼성화하여 성숙하고 초기 RNA7을측정할 수 있게 한다. 그런 다음 에피플루오레이션 현미경 검사법을 사용하여 감쇠가 부착된 샘플을 이미지smFISH에 사용한 다음 이미지 분석 루틴을 적용하여 활성 알레및 성숙한 RNA의 수를 정량화합니다.

<table><tbody><tr><td>17&베타; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td>CAS 번호 50-28-2</td></tr><tr><td>Ambion SSC(20X) 버퍼, Rnase가 없는</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM, L-글루타민 및 4.5g/L 포도</td>당 <td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td>에서 제조, 피<td>루브산 나트륨 없음</td></tr><tr><td>, 덱스트란 황산염, 50% 용액 멸균</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3730-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수 Ca++/Mg++</td><td>Corning</td><td>21030CV</td><td>Calbiochem</td></tr><tr><td>Ethanol에서 제조, 200프루프(100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>Decon Laboratories</td></tr><tr><td>Fetal에서 제조 소 혈청(FBS), 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-753-2978</td><td>Gemini Bio Products에서 제조</td></tr><tr><td>GE Healthcare DeltaVision LIVE 고해상도 디콘볼루션 현미경</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3053802</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil 1.516</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29162940</td><td>GE에서 제조 헬스케어 생명과학</td></tr><tr><td>L-글루타민 솔루션</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005Cl</td><td>코닝</td></tr><tr><td>MCF-7 세포</td>에서 제조 <td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>분자 등급 포름아미드</td><td>프로메가</td><td>PAH5051</td><td></td></tr><tr><td>올림푸스 60x/1.42 NA 대물렌즈</td><td>올림푸스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>52858-076</td><td>VWR</td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 16% 용액, EM 등급</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신 용액</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3001Cl</td><td>Corning</td></tr><tr><td>Ribonucleoside Vanadyl Complex</td><td>VWR</td><td>101229-716</td><td>New England Biosciences</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Ambion</td><td>9780 제조</td><td></td></tr><tr><td>피루브산나트륨, 100 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-360-070</td><td>Gibco</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 용액 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 안티페이드 마운팅 미디엄 10mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9265087</td><td>Vector Laboratories에서 제조</td></tr></tbody></table>

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

유전자 전사는 세포 생물학에 필수적인 프로세스이고, 세포가 내부 및 외부 단서를 해석하고 반응할 수 있습니다. mRNA 수준을 측정하는 전통적인 벌크 인구 방법 (북부 얼룩, PCR 및 RNAeq)는 반응에 있는 세포 대 세포 변이에 정보를 제공하는 기능이 부족합니다. 정확한 단일 세포 및 동종 가시화 및 정량화는 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 RNA 형광을 통해 가능하다. RNA-FISH는 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브를 가진 표적 RNA를 혼성화하여 수행됩니다. 이들은 중간/고 처리량 양식으로 이미지될 수 있으며, 이미지 분석 파이프라인을 통해 성숙및 초기 RNA 모두에 대한 정량적 데이터를 단일 셀 수준에서 제공할 수 있습니다. 고정, 투과성, 혼성화 및 이미징 단계는 여기에 설명된 모델 시스템을 사용하여 수년 동안 실험실에서 최적화되어 왔으며, 이로 인해 smFISH 라벨링의 성공적이고 견고한 단일 셀 분석이 초래됩니다. 샘플 준비 및 처리의 주요 목표는 높은 신호 대 잡음 비율을 특징으로 하는 고품질 이미지를 생성하여 거짓 긍정을 줄이고 보다 정확한 데이터를 제공하는 것입니다. 여기서는 특정 샘플에 맞게 조정하기 위한 제안 및 최적화 단계와 함께 샘플 준비에서 데이터 분석에 이르는 파이프라인을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

예를 들어, smFISH를 통한 호르몬 반응을 분석하기 위해, NIEHS 슈퍼펀드 연구 프로그램7에참여하는 맥락에서 환경재해에 내분비가 화학물질을 방해하는 내분비의 존재를 결정하기 위해 높은 처리량 분석에서 사용되는 에스트로겐 수용체(ER) 모델을 선택했다. 본 실험에서, 신봉성 MCF-7 유방암 세포는 ER 작용제 17β-estradiol (E2, 10 nM) 또는 차량(DMSO)으로 24시간 동안 치료되었다. GREB1 내성(아토 647N, 도 1의빨간색) 및 엑소닉(Quasar 570, 그림 1의녹색) 시퀀스를 상대로 분별 분리 프로브 세트는 초기 및 성숙한 mRNA의 동시 시각화 및 정량화를 허용합니다. 중요하게도, 에스트로겐 반응 시간 과정7의일부로 나타난 각 세포에서 전사 활성 적 진상화 의 수를 표시한다.
<p clas...

단일 분자 RNA 형광은 시투 혼성화(smFISH)에서 단일 세포 수준에서 특정 RNA의 수준 및 국소화를 정확하게 정량화하는 방법이다. 여기서는 특정 RNA의 단일 세포 정량화를 위한 습식 벤치 처리, 이미징 및 이미지 분석을 위한 검증된 실험실 프로토콜을 보고합니다.

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

SM FISH는 특정 RNase의 수준과 국소화를 정확하게 정량화합니다. 이 방법은 RNA의 대립유전자 변이에 의한 세포 대 세포 및 대립유전자를 분석하는 데 특히 유용합니다. 유전자 전사는 세포 생물학에서 필수적인 과정이며, SM FISH는 단일 세포 수준에서 외부 자극에 대한 반응으로 RNA 함량을 조사하고 공간 정보를 제공할 수 있습니다.에스트로겐 수용체 작용제 치료 후 칼슘과 마그네슘이 함유된 냉간 멸균 PBS로 세포를 세척하고 얼음 위에서 30분 동안 500마이크로리터의 고정 완충액으로 세포를 고정합니다. 배양이 끝나면 칼슘과 마그네슘이 함유된 냉간 멸균 PBS로 세포를 3분 동안 두 번 세척한 후 각 웰에 70% 에탄올 500마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 24웰 플레이트를 파라핀 플라스틱 필름으로 밀봉하고 플레이트를 섭씨 4도의 회전기에 최소 4시간에서 최대 16시간 동안 놓습니다.RNA FISH hybridization의 경우, 배양 종료 시 10% 포름아미드가 보충된 500마이크로리터의 2X SSC 완충액으로 세포를 회전자에서 실온에서 5분 동안 한 번 세척합니다. 배양하는 동안 노출되지 않은 파핀 플라스틱 필름 조각을 유리 페트리 접시에 넣고 RNA 표면으로 세척한 오염을 제거하고 접시 가장자리를 따라 물에 적신 종이 타월을 멸균합니다. 배양이 끝나면 GREB1 인트론 및 GREB1 엑손 프로브 버퍼에 새로 준비된 30마이크로리터 방울을 균일한 간격으로 파라핀 플라스틱 필름의 깨끗한 면에 놓고 멸균 집게를 사용하여 세포면의 커버 슬립 하나를 기포 없이 각 방울에 부드럽게 놓습니다.파라핀 플라스틱 필름으로 접시를 밀봉한 후 접시를 호일로 덮고 평평하고 회전하지 않는 표면에서 섭씨 37도의 온도에서 밤새 접시를 배양합니다. 다음날 아침, 집게를 사용하여 커버 슬립을 24웰 플레이트 셀 쪽이 위로 향하게 하여 가열된 회전기에서 섭씨 37도에서 세척당 10%포름아미드가 보충된 500마이크로리터의 신선한 2X SSC 완충액에서 15분 동안 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 2X SSC 완충액에 있는 DAPI 1밀리리터당 1마이크로그램으로 DNA를 로테이터에서 실온에서 10분 동안 대조염색한 후 실온에서 2X SSC 완충액으로 5분 세척합니다.종이 타월을 사용하여 과도한 2X SSC 버퍼를 제거하고 샘플을 뉴클레아제가 없는 물로 헹구어 과도한 염을 제거합니다. 그런 다음 비경화 장착 매체를 사용하여 커버 슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 투명 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉합니다. 샘플 이미징의 경우, 예상되는 강도가 가장 높은 슬라이드를 sCOMS 카메라의 60배 또는 100배 오일 대물렌즈가 장착된 광시야 에피형광 현미경 스테이지에 로드하고 이멀젼 오일 한 방울을 대물렌즈에 놓습니다.Zstack 획득의 경우 DAPI 채널의 샘플에 초점을 맞추고 DAPI 염색 핵이 초점에서 벗어나는 거리에서 Zstack의 상단과 하단을 선택합니다. 슬라이드를 사용하여 광원의 조명량과 각 채널의 노출 시간을 최적화하고 사진 표백 및/또는 카메라 픽셀 채도를 방지하는 조건에서 모든 슬라이드에서 이미지를 획득합니다. 획득 후 적극적인 복원 알고리즘의 10 사이클을 사용하여 이미지를 디컨볼루션하고 사용된 카메라의 비트 심도에 따라 모든 프로젝션 이미지를 저장합니다.이미지 분석을 위해 먼저 GitHub에서 Jupiter Notebook을 다운로드하고 Python Anaconda Distribution 버전 3.6 이상을 설치합니다. Anaconda 프롬프트를 열고 설치 명령을 입력하여 Anaconda용 SimpleITK를 설치합니다. Anaconda Navigator를 열고 Jupiter Notebook을 시작합니다.디렉토리와 파일을 보여주는 웹 브라우저가 열립니다. 디렉터리 구조를 탐색하여 GitHub에서 다운로드한 Jupiter Notebook이 포함된 디렉터리에 도달합니다. 그런 다음 Notebook을 열고 Shift 및 Enter 키를 눌러 각 셀을 실행합니다.이 대표적인 실험에서는 부착된 유방암 세포를 에스트로겐 수용체 작용제 또는 비히클로 24시간 동안 처리했습니다. GREB1, 인트론 및 엑소닉 염기서열에 대해 스펙트럼으로 분리된 프로브 세트를 통해 초기 및 성숙 mRNA를 동시에 시각화하고 정량화할 수 있었습니다. 중요한 것은, 에스트로겐 반응 시간 과정의 일부로 나타난 각 세포의 전사 활성 대립유전자의 수를 표시할 수 있다는 것입니다.겹치는 인트론 및 엑손 스폿을 계수한 결과, E2 처리된 세포는 비히클 처리된 세포에 비해 2개 이상의 활성 GREB1 대립유전자를 나타내는 세포 분획이 4배 증가한 것으로 확인되었습니다. 초기 mRNA에서 인트론을 접합하여 엑손 염기서열로만 구성된 성숙한 mRNA를 생성함에 따라 세포당 성숙한 mRNA의 수는 녹색 반점의 수를 정량화하여 계산할 수 있습니다. 그런 다음 이러한 데이터를 플로팅하면 성숙한 GREB1 mRNA 세포의 분포 변화와 E2 처리 후 세포 집단의 응집체 폴드 변화를 관찰할 수 있습니다.C-FISH는 여러 RNA 종을 순차적으로 조사할 수 있고, MERFISH는 다중화를 대규모로 증가시키는 바코드 기술이며, iFISH는 RNA와 단백질을 동시에 연구하는 데 사용됩니다.

single-cell-analysis-transcriptionally-active-alleles-single-molecule

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 문서에서 우리는 쥐를 기본의 연결을 문화와 아르나의 증폭을 사용하여 후속 transcriptome 분석에서 단일 세포의 수확을위한 간단한 방법을 설명합니다. 이러한 접근 방식은 모든 세포 유형에 generalizable있다.

단일 셀 Transcriptome 분석

RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 (물고기)

우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.

직접 레이블이 프로브를 사용하여 강력한 3D DNA 물고기

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 단일 세포를 분리하고, 관심 세포를 농축하고, 미세유체 기반 단세포 다중 시스템에서 제브라피시 세포를 포획하고, 단일 세포에서 유전자 발현을 평가하는 방법을 설명합니다.

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이 프로토콜 칩 seq, 4sU-seq, seq-총 RNA, 리보솜 세포 선 및 1 차 셀에 대 한 프로 파일링의 조합 사용을 설명 합니다. 전사-요소 바인딩, 드 노 보 전사, RNA 가공, 회전율 및 시간이 지남에, 번역 활성화 및 급변 셀에서 이벤트의 전체 과정을 표시 하 고 변경 내용을 추적을 수 있습니다.

바인딩, 전사, 번역, 및 회전율 세포 활성화 중 글로벌 이벤트를 표시 하는 녹음 방송 요인의 실시간 분석

이 단일 분자 형광 교 잡 프로토콜 제자리에서 식물 성장 및 감수 분열 동안에 싹 트는 효 모 RNA 분자의 수를 계량 최적화 됩니다.

단일 분자 형광에서 제자리 교 잡 (smFISH) 신진 효 모 무성 한 성장 및 감수 분열 분석

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

CUT&amp;RUN 및 그 변이체는 크로마틴에 대한 단백질 점유율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 단일 세포 uliCUT&amp;RUN을 사용하여 크로마틴에 대한 단백질 국소화를 결정하는 방법을 설명합니다.

표적 하에서 초저 입력 절단을 이용한 크로마틴에 대한 단일 세포 인자 국소화 및 뉴클레아제를 이용한 방출

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

초파리 는 근육 형성을 조절하는 주요 분자를 연구하기 위한 잘 정립된 모델입니다. 그러나 현재의 방법은 mRNA 전사 역학 및 세포융합 내 공간 분포를 결정하기에 충분하지 않습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 RNA 형광 in situ hybridization 방법을 최적화하여 단일 분자 규모에서 mRNA를 검출하고 정량화할 수 있습니다.

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila (초파리의 단일 분자 스케일에서 근육 전사 역학 연구)

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

배우세요 단일 분자 RNA 형광 원위교잡법(smFISH)을 활용한 단일 세포 수준 전사 활성 알레일 분석 방법입니다. 이 기술은 유전자 발현 역학과 세포 간 변이를 정량적으로 연구하는 데 활용됩니다.

단일 분자 물고기에 의한 전사 활성 알레일의 단일 세포 분석

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