고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

현재 프로토콜은 망막 변성에 대한 세포 치료 접근법 개발을 목표로 하는 대형 동물 모델에서 전체 망막 오가노이드의 망막하 전달을 자세히 보여줍니다. 이 기술의 주요 장점은 오가노이드를 표적 조직인 망막에 직접 전달할 수 있다는 것입니다. 이 기술은 연령 관련 황반변성, 색소성 망막염 또는 leber 선천성 무모증과 같은 진행성 실명 망막 퇴행성 상태를 치료하는 것을 목표로 합니다.

절차를 시연하는 것은 Dr.Peterson Jones가 될 것입니다. 오가노이드의 망막하 이식의 경우, Stevens 건절개술 가위를 사용하여 생후 4개월 된 하룻밤 금식 마취된 고양이에게 0.5-1센티미터의 측면 안과 절개술을 시행하고, 적절한 크기의 Barraquer 눈꺼풀 검경을 절개 부위에 배치하여 수술 보조원이 시술 전반에 걸쳐 정기적으로 각막에 BSS를 관개하여 눈꺼풀을 열어 둡니다. 0.5 Castroviejo 각막 묶음 겸자와 작은 모기 지혈제를 사용하여 윤부 옆의 구근 결막을 부드럽게 잡습니다.

4시와 8시 방향에서 윤부 바로 옆의 결막에 두 개의 6-0 실크 봉합사를 배치하여 눈을 일차 시선으로 유지하고 세 번째 눈꺼풀을 집어넣습니다. 작은 모기 지혈제로 봉합사의 끝을 고정하여 조작을 돕고, 윤부의 두께를 부분적으로 통해 윤부의 12시 위치에 다른 봉합사를 놓고 눈을 관통하지 않도록주의하십시오. 봉합사를 느슨하게 매듭을 짓고 끝을 짧게 자르고 4시 방향에서 윤부 바로 옆의 결막에 스테이 봉합사를 놓아 눈과 일차 시선을 유지합니다.

10시에서 2시 사이에 구근 결막을 반사하고 건절개술 가위를 사용하여 윤부에서 2-3mm 떨어진 결막을 절개합니다. 결막을 훼손하고 장부 캡슐을 제거하여 윤부에서 3-5mm 떨어진 2시 및 10시 유리체 절제술 포트 부위에서 공막을 노출시킵니다. 캘리퍼스를 사용하여 경화술 부위를 식별하고 고양이에서 두드러질 수 있는 주요 공막 혈관을 피하십시오.

오른손잡이 외과의를 위한 10시 방향 기구 포트에서 3mm 영역을 계획하고, 제안된 경화술 부위에 묶지 않고 6-0 또는 7-0 폴리글락틴 십자형 패턴 봉합사를 미리 배치합니다. 봉합사가 제자리에 있으면 조수가 12시 방향 스테이 봉합사를 잡고 지구본을 제자리에 유지하도록 하고 0.12mm Castroviejo 집게를 사용하여 경화 절개술 부위 옆에 조직을 고정합니다. 투관침을 사용하여 렌즈와의 접촉을 피하기 위해 시신경을 향해 기울어진 2시 및 10시 위치에서 공막을 통해 23게이지 유리체 절제술 포트를 삽입하고 묶는 집게를 사용하여 관개 포트를 부드럽게 밀어 팁이 유리체 내에서 시각화될 수 있는지 여부를 결정합니다.

조수가 Machemer 확대 유리체 절제술 렌즈를 각막에 배치하여 눈의 뒤쪽 부분을 시각화하고 기구 포트를 통해 23게이지 유리체 절제술 프로브 커터를 배치하여 부분 코어 유리체 절제술을 수행하도록 합니다. 다음으로, 1 밀리리터의 트리암시놀론 용액을 함유 한 1 밀리리터 주사기의 바늘을 기기 포트에 넣고 250 내지 500 마이크로 리터의 결정 현탁액을 주입한다. 용액이 전달되면 유리체 절제술 프로브를 기구 포트를 통해 전진시켜 포트가 망막 표면에서 반대쪽을 향하도록 하여 시신경두에 가깝게 합니다.

고진공을 사용하여 망막에서 유리체 표면을 분리하고, 기구 포트를 통해 망막 표면을 향해 인젝터를 삽입하고, 캐뉼라 팁을 밀어냅니다. 망막 표면의 끝을 부드럽게 누르고 조수가 주사기 플런저를 약간 빠르게 눌러 망막 박리를 시작하도록 하여 주입 압력을 줄여 원하는 크기가 될 때까지 망막 박리가 천천히 증가할 수 있도록 합니다. 인젝터의 41게이지 캐뉼라를 사용하여 망막 가위가 삽입될 때까지 박리를 약간 확대하고 10시 방향 공막 포트를 제거합니다.

그런 다음 시신경을 향한 직선 2.850mm 슬릿 나이프를 사용하여 이 부위의 경화술을 확대하기 위해 수정체를 만지지 않도록 합니다. 이식 부위에서 유래한 망막 신경 섬유의 손상을 방지하기 위해 시신경에서 멀리 떨어진 안검의 망막 절개술을 하고 출혈 위험을 줄이기 위해 주요 망막 혈관 절단을 피하십시오. 오가노이드를 이식하려면 확대된 경화술을 통해 오가노이드가 로드된 유리 모세관을 망막 절개술 부위 쪽으로 삽입하고 모세혈관 끝을 사용하여 망막 절개술을 약간 열어 망막하 안검 개구부에 접근할 수 있도록 합니다.

조수가 인젝터의 플런저를 다시 천천히 눌러 오가노이드를 망막하 안검에 주입하도록 합니다. BSS는 오가노이드, 장기를 진행하고 망막 절개술을 개방해야 합니다. 모든 오가노이드가 전달되면 유리 모세관을 몇 초 동안 제자리에 두었다가 갑자기 체액이 방출되지 않도록 주의하면서 눈에서 모세관을 천천히 제거합니다.

모세 혈관이 제거되면 십자 패턴으로 미리 배치 된 봉합사를 사용하여 경화술을 닫습니다. 조수가 주입 포트를 제거하고 경화 절개술 봉합사를 신속하게 묶고 간단한 연속 패턴으로 폴리글락틴 봉합사로 복막을 닫습니다. 6-0 폴리글락틴 봉합사와 8자형 피부 봉합사로 측면 안과 절개술을 봉합하여 외측 안각을 수행하고 단순 중단된 피부 봉합사를 사용하여 나머지 상처를 봉합합니다.

그런 다음 적절한 수술 후 스테로이드와 항생제 칵테일을 투여하십시오. 인간 만능 줄기 세포 유래 망막 오가노이드 로딩은 주사 장치의 유리 캐뉼라 내에서 그리고 수술 중에 직접 시각화하여 확인할 수 있습니다. 망막하 공간 내 오가노이드의 존재는 수술 후 안과 검사와 안저 영상으로 확인할 수 있습니다.

안락사 전에 오가노이드의 위치를 평가하기 위해 공초점 스캐닝 레이저 검안경 및 스펙트럼 영역 광간섭 단층 촬영 이미징도 수행할 수 있습니다. 이러한 기술은 수상자 눈의 신경 망막과 망막 색소 상피 사이의 망막하 공간에서 망막 오가노이드의 지속성을 입증하는 데 사용할 수 있습니다. 조직학적 및 면역조직화학적 분석은 면역억제 동물에서 큰 눈의 망막하 공간 내에서 이종 발생 그래프의 생존을 설명하는 데 사용할 수 있습니다.

훈련된 수의사 안과 의사 또는 인간의 눈과 비교하여 고양이 눈의 종 차이에 익숙한 유리체 망막 외과 의사와 같이 유리체 망막 수술에 숙련된 사람만이 이 절차를 수행해야 합니다. 이 비디오에 제시된 기술은 유리체 망막 수술 기술을 클리닉으로 번역하는 데 사용되는 다른 대형 동물 모델에도 적용할 수 있어야 합니다.