췌장 선암의 종양 미세 환경을 조사하기위한 근위액 분리
2020년 11월 5일
췌장액은 인간 췌장암에 대한 바이오마커의 귀중한 공급원입니다. 여기서는 수술 중 수집 절차 방법을 설명합니다. 쥐 모델에서 이 절차를 채택하는 문제를 극복하기 위해 대체 샘플인 종양 간질액을 제안하고 여기에서 분리를 위한 두 가지 프로토콜을 설명합니다.
인간과 생쥐 모두에서 근위액을 분리하기 위해 여기에 설명된 방법은 췌장암의 미세환경을 연구하여 질병의 새로운 바이오마커를 식별하는 데 적용할 수 있습니다. 이 간단한 프로토콜을 사용하여 췌장액의 임상 결과를 PDAC의 쥐 모델로 변환하여 기계론적 연구를 수행할 수 있습니다. 췌장액은 아직 개발되지 않은 체액으로, 수술 전 진단과 환자 프로파일링에 도움이 되는 귀중한 바이오마커의 공급원으로 유망한 것으로 나타났습니다.
저는 프로토콜의 첫 번째 부분을 시연하고, 우리 연구실의 박사후 연구원인 Marialuisa Barbagallo가 프로토콜의 두 번째 부분을 시연할 것입니다. 이미징 중에 얻은 측정값을 사용하여 췌관의 위치를 추정합니다. 그런 다음 췌장의 앞쪽 표면을 촉진하여 정확한 위치를 확인합니다.
아래에서 십이지장에 있는 췌장 머리를 잡고 왼손으로 들어 올려 첫 번째 숫자로 췌관의 위치를 표시합니다. 오른손을 사용하여 25게이지 바늘이 달린 3ml 주사기를 왼쪽 엄지 손가락 바로 말단의 췌장에 삽입합니다. 침투 깊이와 바늘의 경사 정도는 수술 전 측정과 덕트 벽을 관통했다는 인식에 따라 결정하십시오.
주사기로 주스를 빼냅니다. 주스를 회수할 수 없는 경우 췌관을 캐뉼레이션하기 위해 바늘을 재배치하십시오. 췌장액이 회수되면 멸균 필드 밖으로 옮기고 3ml EDTA 진공 시험관으로 옮깁니다.
샘플이 실험실로 옮겨질 때까지 튜브를 섭씨 4도로 유지합니다. 췌장액을 처리하려면 400G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포나 부스러기를 제거합니다. 상등액을 회수하고 분취한 다음 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 80도에서 보관합니다.
종양 간질액(TIF)을 분리하려면 원심분리를 통해 종양을 반으로 자르고 PBS로 두 부분을 헹구고 여과지에 부드럽게 닦아내고 종양에서 증발하지 않도록 가능한 한 빨리 움직입니다. 즉시 종양을 50ml 원추형 튜브에 부착된 20마이크로미터 나일론 세포 여과기로 옮깁니다. 튜브를 400G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.
튜브 바닥에서 TIF를 회수한 다음 분취하고 즉시 드라이아이스에 얼립니다. 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 80도에서 보관하십시오. 용출액을 사용하여 TIF를 분리하려면 가위나 메스로 종양을 작은 조각으로 자르고 차가운 PBS로 조심스럽게 헹굽니다.
종양 조각을 1.5ml 튜브로 옮기고 Protease Inhibitor Cocktail과 함께 PBS 500μl를 첨가하여 분석물질의 분해를 방지합니다. 조직을 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양하고 이산화탄소를 5%로 배양합니다. 상등액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 일련의 원심분리 단계를 수행하여 샘플에서 세포를 제거합니다.
각 원심분리 후 상층액을 회수하여 새 튜브로 옮깁니다. 마지막 원심분리 후 즉시 TIF 샘플을 드라이아이스에서 분취하고 동결합니다. 추가 분석이 있을 때까지 섭씨 80도에서 보관하십시오.
이 프로토콜은 PDAC 및 기타 양성 췌장 질환이 있는 환자로부터 췌장액을 얻는 데 사용되었습니다. 거대분자의 광범위한 NMR 신호를 필터링한 후 저분자량 대사 산물의 신호가 분명했습니다. 지도식 OPLS-DA 분석은 췌장액의 대사 프로필이 82.4%의 정확도로 PDAC 환자와 비 PDAC 환자를 구별할 수 있음을 보여주었습니다. 흥미롭게도, 동일한 환자의 혈장 샘플에 대해 수행된 대사체 분석은 동일한 변별력을 나타내지 않았습니다.
종양 간질액 함량이 종양 미세환경의 변화를 안정적으로 반영한다는 것을 입증하기 위해 해당작용 속도가 반대인 두 개의 췌장암 세포주를 마우스에 피하 주입했습니다. 종양을 절제한 후, 포도당과 젖산의 농도를 정량화하였다. 고도의 해당작용성 종양에서 유래한 종양 간질액은 저해당작용성 종양에 비해 포도당이 적고 젖산이 더 많았다.
본 연구에서는 대사체학 분석을 수행하였다. 그러나 이 근위부는 질량 분석 및 microRNA 프로파일링과 같은 다른 많은 다운스트림 응용 분야에 적합합니다.
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개요
본 논문은 췌장암의 가치 있는 바이오마커 공급원인 췌장액을 수술 중 수집하는 방법을 제시합니다. 또한, 대안적 시료인 종양 간질액과 마우스 모델에서 이를 분리하기 위한 프로토콜을 소개합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 종양학
- 바이오마커 발굴
배경
- 췌장액은 바이오마커 소스로서 연구가 부족한 상태입니다.
- 췌장액은 수술 전 진단을 돕는 잠재력을 가지고 있습니다.
- 췌장암의 미세환경을 이해하는 것은 매우 중요합니다.
- 인체 연구 결과를 마우스 모델로 옮겨 적용함으로써 연구를 강화할 수 있습니다.
연구 목적
- 바이오마커 식별을 위해 췌장액과 종양 간질액을 분리하기 위함입니다.
- 인간 및 마우스 모델 모두에 적용 가능한 프로토콜을 제공하기 위함입니다.
- 췌장암의 기전 연구를 용이하게 하기 위함입니다.
사용된 방법
- 수술 중 췌장액 수집.
- 종양 간질액 분리.
- 췌관 위치 파악을 위한 영상 기법.
- 정확한 식별을 위한 췌장 촉진.
주요 결과
- 체액 분리를 위한 프로토콜을 입증함.
- 바이오마커 공급원으로서 췌장액의 잠재력을 강조함.
- 임상 결과의 마우스 모델 전이 가능성을 보여줌.
- 향후 기전 연구를 위한 토대를 제공함.
결론
- 췌장액과 종양 간질액은 바이오마커 연구에 유용합니다.
- 해당 프로토콜은 췌장암에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
- 이러한 액체들의 잠재력을 충분히 탐구하기 위해 추가적인 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
근위부 액체 분리는 췌장선암의 미세환경을 직접적으로 조사할 수 있게 하여, 임상적 관찰과 전임상 기전 연구를 잇는 바이오마커 발굴 경로를 제공합니다. 인간 및 마우스 시스템 모두에서 췌장액과 종양 간질액을 수집할 수 있는 기술적으로 접근 가능한 방법을 제공함으로써, 본 프로토콜은 미세환경 변화에 초점을 맞춘 표적 검증 및 분석법 개발 노력을 지원합니다. 이러한 접근 방식은 기질 및 종양 세포 간의 상호작용을 반영하는 질병 관련 액체를 확보함으로써 초기 발굴 단계에서의 예측 신뢰도를 높이며, 췌장암 신약 개발 프로그램의 추진 여부(go/no-go) 결정에 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 종양 미세환경 바이오마커가 농축된 액체를 분리함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 함.
- 운영적 가치: 근접 액체 바이오마커를 사용하여 기능적 타겟 검증을 위한 질환 관련 시스템을 제공함.
- 과학적 가치: TIF 내 글루코스 및 젖산 정량을 통한 당분해 종양 표현형의 비교 분석으로 메커니즘적 위험 완화를 지원함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 질량 분석 및 microRNA 프로파일링과 같은 후속 응용 분석을 위해 검증된 생체 시료를 준비합니다.
- 운영적 가치: 분석 확장성에 적합한 표준화되고 재현 가능한 분리 프로토콜(원심 분리 및 용출)을 제공합니다.
- 과학적 가치: 판별력 있는 스크리닝 가능 바이오마커 검출(OPLS-DA에서 82.4% 정확도)이 가능한 정량적 대사체 판독 값을 산출합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 인간 췌장액 연구 결과를 마우스 TIF 모델로 변환함으로써 질병 관련 시스템의 연속성을 확립합니다.
- 운영적 가치: 미세환경 변화를 반영하는 피하 종양 모델로부터 TIF를 분리하여 전임상 검증을 용이하게 합니다.
- 전략적 가치: 액체 생체지표 프로파일을 종양 표현형과 연결함으로써 리스크가 조정된 개발 진행 결정을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 초기 표적 검증부터 리드 화합물 발굴에 이르는 발견 연속체에 통합되어, 기전 연구 및 바이오마커 기반 스크리닝 캠페인에 정보를 제공하는 미세환경 프로파일링을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: PDAC에서 기질-종양 상호작용을 반영하는 체액을 분리하여 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 정량적인 대사산물 및 핵산 결과물을 생성하는 표준화된 TIF 및 췌장액 분리를 통해 분석 준비를 가능하게 합니다.
- 분석: 비교 조건 분석 및 표현형 스크리닝을 위한 측정 가능한 바이오마커(포도당, 젖산, 대사산물)를 제공합니다.
- 중개 연구: 마우스 모델에서 TIF가 종양의 당분해 상태를 반영함을 입증함으로써 발견 단계와 전임상 단계의 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: 인간 및 마우스 시스템 전반에 걸쳐 근접 체액 분리를 위한 재사용 가능한 역량을 구축하여 모델 전이 장벽을 낮춥니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: PDAC 내 미세환경 바이오마커 검출 및 타겟 검증을 통한 예측 신뢰도 확보.
- 운용적 가치: 간단한 원심분리 및 용출 기술을 이용한 TIF 분리를 통해 표준화 및 재현성 구현.
- 전략적 가치: 체액 바이오마커와 종양 표현형을 연계하여 go/no-go 결정을 개선함으로써 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 바이오마커 판별 체액 프로파일(PDAC 대 비 PDAC에서 82.4% 정확도)에 기반한 위험 조정 우선순위 설정.
실행 시 고려 사항
- 근위부 액체 분리를 위해 외과적 액체 처리 및 종양 절제에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 췌장액 및 TIF 처리를 위해 원심분리 장비(400 G, 4°C)와 멸균 액체 처리 공정이 필요합니다.
- 시료의 무결성을 위해 외과, 병리 및 분석 팀 간의 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 조직 크기와 후속 응용 분야에 따라 원심분리 또는 용출을 통한 마우스 TIF 분리를 위한 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 마우스 췌장액 수집의 기술적 어려움으로 인해 TIF를 대용물로 사용해야 하는 등의 실질적인 제한 사항이 포함됩니다.
