Name: 마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 배우세요 초음파 유도 자궁 내 렌티바이러스 주사를 이용한 마우스 피부와 구강의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을. 이 기술은 수백 개 유전자의 종양 억제 기능을 동시에 평가하여 머리 목 암 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 캐나다 보건 연구소 (CIHR 365252), Krembil 재단 및 온타리오 연구 우수 라운드 8 (RE08-065)의 프로젝트 보조금에 의해 지원되었습니다. 삼패스 쿠마르 로가나단은 캐나다 암 학회 펠로우십(BC-F-16#31919)의 수혜자입니다.

<ol><li>Beronja, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-mediated+gene+function+analysis+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi-mediated gene function analysis in skin.</a> Methods in Molecular Biology. 961, 351-361 (2013).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16, 821-827 (2010).</li>
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<li>Beronja, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+screens+in+mice+identify+physiological+regulators+of+oncogenic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNAi screens in mice identify physiological regulators of oncogenic growth.</a> Nature. 501, 185-190 (2013).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367, 1264-1269 (2020).</li>
<li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 269-282 (2018).</li>
<li>Green, A. C., Olsen, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutaneous+squamous+cell+carcinoma%3A+an+epidemiological+review%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Cutaneous squamous cell carcinoma: an epidemiological review.</a> British Journal of Dermatology. 177, 373-381 (2017).</li>
<li>Campbell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pathway+network%2C+and+immunologic+features+distinguishing+squamous+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">pathway network, and immunologic features distinguishing squamous carcinomas.</a> Cell Reports. 23, 194-212 (2018).</li>
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<li>Schramek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo+RNAi+screen+unveils+myosin+IIa+as+a+tumor+suppressor+of+squamous+cell+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo RNAi screen unveils myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas.</a> Science. 343, 309-313 (2014).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10, 25(2009).</li>
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<li>Chow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+direct+in+vivo+CRISPR+screen+identifies+functional+suppressors+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma.</a> Nature Neuroscience. 20, 1329-1341 (2017).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+functional+cancer+genome+atlas+of+tumor+suppressors+in+mouse+liver+using+AAV-CRISPR%E2%80%93mediated+direct+in+vivo+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening.</a> Science Advances. 4, 5508(2018).</li>
<li>Chan, K., Tong, A. H. Y., Brown, K. R., Mero, P., Moffat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+CRISPR-based+genetic+screens+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pooled CRISPR-based genetic screens in mammalian cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (151), e59780(2019).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163, 1515-1526 (2015).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

CRISPR/Cas9 게놈 편집은 유전자 기능 및 세포 과정을 조사하기 위하여 시험관 내 및 생체 내 연구 결과에서 널리 이용되었습니다. 대부분의 생체 내 연구는 CRISPR/Cas9 유전자 편집 세포를 동물 모델(동종 이식 또는 xenograft)으로 이식합니다. 이것은 암 유전학 및 세포 기능을 공부하는 강력한 도구이지만, 여전히 기본 조직 미세 환경이 부족하고 상처 및 / 또는 면역 반응을 유도 할 수 있습니다.
이러한 과제를 극복하기 위해, 여러 그룹은 지난 몇 년 동안 여러 멀티플렉스 자동 마우스 모델을 생성하는 생체 내 CRISPR 접근방식에서직접 개척했다15,16,17,18. 이 프로젝트는 일반적으로 아데노 관련 바이러스 (AAV)에 의존하...

게놈 이후 시대에 암 연구를 위한 도전의 한은 인과 유전자 돌연변이를 위한 게놈 데이터의 광대 한 양을 채굴하고 치료적으로 표적으로 할 수 있는 유전자 네트워크에 있는 노드를 확인하는 것입니다. 생물 정보 학적 분석은 이러한 목표를 향해 대단히 도움이되었지만, 시험관 및 생체 내 모델에서 효율적인 확립은 생물학적 시스템과 질병 상태의 복잡성을 해독하고 약물 개발을 가능하게하는 전제 조건입니다. 기존의 형질전환 마우스 모델은 생체 암 유전학 연구를 위해 광범위하게 사용되었지만, 그들의 비용, 시간 및 노동 집약적 인 성격은 현대 유전체학에 의해 해명 된 수백 개의 putative cancer 유전자의 체계적인 분석을 크게 금지했습니다. 이 병목 현상을 극복하기 위하여는, 우리는 한 마우스의 피부와 구강에 있는 유전자의 수백의 기능 손실 돌연변이를 동시에 유도하고 연구하기 위하여 CRISPR/Cas9 (정규로 간격짧은 Palindromic 반복군집실) 유전자 편집 기술3와 자궁 주입 방법론1,2에서 이전에 확립된 초음파 유도를 결합했습니다.
여기에서 기술된 방법론은 배아일 E9.5에서 살아있는 마우스 배아의 양수 구멍으로 설계한 렌즈바이러스의 초음파 유도 주입을 이용합니다. CRISPR/Cas9 성분이 함유된 렌티바이러스 화물은 단일 층 표면 엑토더름을 트랜스듀싱하여 나중에 피부와 구강의 상피를 초래합니다. 피부는 외부 표피로 구성되며 지하 막과 진피가 뒤따릅니다. 표피는 지하 막과의 접촉을 유지하고 증식 및 줄기 세포 용량을 가진 내부, 기저 층으로 구성된 계층화 된 상형입니다. 기저층은 가시, 세분화 및 층 각막 층2,4와같은 위의 차별화된 층을 야기한다. 리니지 추적 연구는 생체 내 CRISPR /Cas9 방법으로이 직접 성인기 전반에 걸쳐 지속되는 기저 층 내에서 조직 거주자 줄기 세포를 유전적으로 조작하는 것으로 나타났습니다. 렌티바이러스는 클론 밀도에서 E9.5 표면 ectoderm을 트랜스듀싱하기 위해 적정화될 수 있으므로, 이 방법은 수천 개의 이산 유전자 녹아웃 클론을 수용하는 모자이크 마우스를 생성하는 데 사용될 수 있다. 차세대 시퀀싱은 그 클론 내에서 CRISPR/Cas9 매개 유전자 절제의 효과를 복합화 된 방식으로5로분석하는 데 사용될 수 있다.
우리는 최근에 인간 머리와 목 편평상피세포암 (HNSCC)5에있는 재발하는 돌연변이를 보여주는 484개의 유전자의 기능을 평가하기 위하여 이 방법을 이용했습니다. HNSCC는 40-50%의 높은 사망률을 가진 파괴적인 암이고 세계6번째로 일반적인 암입니다. HNSCC는 상부 기도 또는 구강의 점막 안대기에서 발생하고 담배 와 알코올 소비 또는 인간 유두종 바이러스 (HPV) 감염과 관련이 있습니다. 피부 편평상피 세포 암 (SCC)은 피부 종양이며 인간7에서두 번째로 흔한 암을 나타낸다. 분리SCC 및 HNSCC는 조직학적 및 분자학적매우 유사하며, TP53, PIK3CA, NOTCH1 및 HRAS8에서변경을 나타내는 경우의 높은 비율을 가진다. 고주파에서 돌연변이된 유전자의 소수만이 있는 동안, 저주파에서 돌연변이된 유전자의 수백이 있습니다 (&5%), 일반적으로 긴 꼬리 분포로 불리는 현상. 긴 꼬리 유전자의 대다수가 생물학적 또는 임상 적 검증이 부족하기 때문에, 우리는 p53, Pik3ca 또는 Hras에서 민감하게 돌연변이를 가진 종양 경향이 마우스에서 이러한 유전자의 기능 상실을 모델링하기 위해 생체 내 CRISPR 스크리닝 기술을 사용하고 p53, Pik3ca 또는 Hras와 협력하는 몇 가지 새로운 종양 억제 유전자를 확인하여 종양발달을유발합니다 5.
여기서, 우리는 멀티플렉스 sgRNA 렌티바이러스 CRISPR sgRNA 라이브러리를 생성하고 마우스 표면 ectoderm에서 CRISPR/Cas9 유전자 녹아웃 스크린을 수행하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 참고로, 이러한 방법론은 CRISPR 활성화(CRISPRa) 및 CRISPR 불활성화(CRISPRi)와 같은 다른 유전자 조작 기술을 통합하거나 유전자 기능을 연구하기 위해 마우스의 다른 장기 시스템을 표적으로 변형하도록 조정할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>0.45 미크론 필터</td><td>Sigma</td><td>S2HVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>12k 또는 92k oligo chip</td><td>Customarray Inc. (Genscript)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>293NT</td><td>Systems Biosciences</td><td>LV900A-1</td><td></td></tr><tr><td>알칼리성 포스파타제</td><td>NEB</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>Amplicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>NEB</td><td>9804S</td><td></td></tr><tr><td>BsmBI</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>크롬 장 봉합사</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA cleanup kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4008</td><td></td></tr><tr><td>DNAesy 혈액 및 조직 DNA 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Endura 전기 유능 세포</td><td>Lucigen</td><td>60242-1</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세 혈관</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G / X</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>고속 원심 분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>MLS-50</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천</td><td>Wisent 기술</td><td>800-011-LG</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Sigma</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>미니 프렙 플라스미드 키트</td><td>Frogga Bio</td><td>PDH300</td><td></td></tr><tr><td>마우스 산소 마취 시스템</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II 마이크로매니퓰레이터</td><td>Drummond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 3.1 ( BsmBI)용 버퍼)</td> <td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>바늘 깎이</td> 셔터 <td>기기</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>올리고 정리 키트</td><td>Zymo 연구</td><td>D4060</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 정제 일루미나 시퀀싱 프라이머</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEI (폴리에틸렌 이민)</td> <td>시그마</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>퍼모 플라스트 모델링 점토</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>중앙 개구부가 있는 페트리디쉬</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Q5 중합효소 2x 마스터 믹스</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 형광 정량</td><td>Invitrogen</td><td>Q33327</td><td></td></tr><tr><td>반원형 실리콘 플러그</td><td>코닝</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실리콘 멤브레인</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2000 초음파 시스템</td><td>Visual Sonics</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 vivo crispr/cas9 스크리닝

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening to Simultaneously Evaluate Gene Function in Mouse Skin and Oral Cavity

유전자 변형 마우스 모델 (GEMM)은 유전자 기능을 평가하고, 인간 질병을 모델링하고, 치료 방법을 평가하기 위한 전임상 모델로 봉사하는 데 중요한 역할을해 왔습니다. 그러나, 그들의 시간, 노동 및 비용 집약적인 성격은 유전자 기능의 체계적인 분석을 위한 그들의 유틸리티를 제한합니다. 최근 게놈 편집 기술의 발전은 이러한 한계를 극복하고 멀티플렉스및 신속한 방식으로 특정 마우스 기관 내에서 직접 특정 유전자 변류의 빠른 생성을 허용합니다. 여기서, 우리는 CRISPR/Cas9 기반 방법(정기적으로 간격이 있는 짧은 Palindromic 반복군)을 기술하여 마우스의 피부와 구강의 상피 내에서 수천 개의 유전자 녹아웃 클론을 생성하고 종양 억제기 유전자에 대한 생체 내 CRISPR 화면에서 직접 수행하는 데 필요한 단계를 자세히 설명하는   프로토콜을 제공합니다. 이러한 접근법은 조직 항상성 동안 또는 다양한 질병 환경에서 유전자의 생물학적 기능을 연구하기 위해 CRISPR 활성화 또는 CRISPR 불활성화와 같은 다른 기관 또는 기타 CRISPR/Cas9 기술에 적용될 수 있다.

도 1A는 단일 12k 또는 92k 올리고 칩에서 비용 효율적인 방식으로 여러 사용자 정의 CRISPR 라이브러리를 멀티플렉싱하기 위한 올리고뉴클레오티드의 설계를 나타낸다. sgRNA(파란색 코드)를 선택하면 올리고뉴클레오티드는 제한 부위(주황색 BsmBI) 및 라이브러리 특정 PCR 프라이머 쌍(녹색 색 코딩)으로 설계되었습니다. 여러 라이브러리는 단일 올리고 칩에서 멀티플렉스를 위한 프라이머 쌍의 고유한 조합을 사용하여 설계할 수 있습니다. PCR이 특정 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 라이브러리를 증폭할 때, 항상 물만 음의 제어를 포함하고 아가로즈 젤에 대한 모든 반응을 실행합니다. 네거티브 컨트롤 레인에는 100bp의 대역이 없어야 하며, 라이브러리 증폭 차선에는 단일 100bp 대역이 있어야 합니다. 밴드가 없는 경우 PCR 프라이머 쌍을 적절하게 선택해야 합니다. 도 1B는 복제된 라이브러리의 품질 관리 단계와 ...

여기서 우리는 면역 능력 마우스의 피부와 구강에 있는 몇몇 유전자의 기능을 동시에 평가하기 위하여 자궁 배아 렌즈바이러스 주사에서 초음파 유도를 사용하여 생체 내 CRISPR/Cas9 검열 방법론을 기술합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

Genetically modified mouse models (GEMM) have been instrumental in assessing gene function, modeling human diseases, and serving as preclinical model to ...

이 프로토콜은 연구자들이 기존 녹아웃 마우스 모델의 일부만 비용으로 두경부암에서 수백 개의 유전자의 종양 억제 기능을 동시에 조사할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술은 유연하며 피부에서 유전자의 기능을 연구하기 위해 유전자 발현을 다루도록 조정할 수 있습니다. 표적 CRISPR 라이브러리 프로토콜은 다른 암 유형에도 적용할 수 있습니다.마취된 동물의 복부 쪽을 가열된 수술 스테이지에 놓고 수술 테이프를 사용하여 발을 제자리에 고정합니다. 수술이 완료될 때까지 이소플루란과 산소를 지속적으로 공급하기 위해 노즈콘 마취관을 적용합니다. E9.5 임신을 확인하기 위해 소량의 제모 크림을 복부에 바르고 면봉 어플리케이터를 사용하여 3x3cm 제곱 영역에 펴 바릅니다.2-3분 후 거즈나 티슈로 크림을 부드럽게 제거하고 PBS와 70% 에탄올을 사용하여 해당 부위를 깨끗하게 닦습니다. 초음파 프로브와 젤을 사용하여 임신한 쥐의 배아 E9.5를 확인합니다. 이것은 또한 수술 당일 시간을 절약하기 위해 E8.5에서 전날 수행할 수 있습니다.초음파 젤을 제거하고 BPS를 사용한 다음 70% 에탄올을 사용하여 해당 부위를 깨끗이 닦습니다. 피하 진통제를 가장 많이 주입하십시오. 그런 다음 집게와 가위를 멸균하여 피부를 수직으로 절개합니다.뭉툭한 집게를 사용하여 절개 부위 주변 피부와 복막을 분리합니다. 그런 다음 집게와 가위를 멸균하여 복막을 자릅니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 왼쪽과 오른쪽 자궁 뿔을 부드럽게 뽑아내고 배아를 세십시오.대부분의 자궁 뿔을 다시 삽입하되, 3개의 배아를 포함하고 있는 한쪽 자궁 뿔의 말단부는 노출된 상태로 둡니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 변형된 페트리 접시의 실리콘 멤브레인에 있는 구멍을 통해 3개의 배아가 있는 자궁을 부드럽게 밀고 당깁니다. 모델링 점토 큐브를 사용하여 페트리 접시를 안정화합니다.실리콘 몰드를 사용하여 페트리 접시 안에 있는 3개의 배아로 자궁을 안정화합니다. 그런 다음 뭉툭한 도구를 사용하여 배아 측면의 실리콘 플러그를 평평하게 만듭니다. 페트리 접시에 멸균 PBS를 채우고 페트리 접시 바닥에 있는 실리콘 멤브레인을 임신한 댐의 배와 씻어내어 누출을 방지합니다.초음파 헤드를 상단 배아에서 약 0.5cm 위에 있는 페트리 접시로 옮기고 초음파에서 양막이 명확하게 보이도록 단계를 조정합니다. 주입기 바늘을 수정된 페트리 접시에 조심스럽게 맞춥니다. 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘 끝을 상단 배아에서 5mm 이내에 놓은 다음 바늘을 앞뒤로 전환하여 초음파 이미지에서 끝이 가장 밝게 나타나는 평면으로 이동합니다.마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 자궁 벽을 통해 양강으로 밀어 넣습니다. 62나노리터의 렌티바이러스를 느린 주입 속도로 sgRNA 라이브러리에 주입합니다. 주입 버튼을 8번 누르면 배아당 총 496나노리터가 됩니다.다른 두 배아에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다. 그런 다음 초음파 헤드를 들어 올리고 실리콘 플러그를 제거합니다. 세 개의 배아 중 처음 두 개를 멸균된 면봉을 사용하여 쥐의 복부에 부드럽게 밀어 넣었습니다.다음 3개의 배아를 꺼내고 이전에 주입된 세 번째 배아를 밀어 넣습니다. 원하는 수의 배아가 주입될 때까지 주입 절차를 반복하고 마취 시간이 30분을 초과하지 않도록 합니다. 완료되면 초음파 헤드를 들어 올리고 바늘로 미세 조작기를 제거하고 PBS를 흡인하고 페트리 접시를 제거합니다.멸균 물티슈를 사용하여 복강에 축적되었을 수 있는 PBS를 흡수합니다. 흡수성 봉합사를 사용하여 복막 절개 부위를 봉합합니다. 그런 다음 두 개의 스테이플을 사용하여 복부 피부의 절개 부위를 봉합합니다.다음으로, 플라스미드 및 렌티바이러스 라이브러리 형질도입 세포에서 PCR 증폭 DNA의 세대 염기서열분석 판독은 높은 상관관계를 보여야 합니다. 플라스미드 DNA에서 판독한 sgRNA가 sgRNA와 동일한 표현을 보이지 않는 경우 바이러스 준비 및 농축 절차를 주의해서 반복해야 합니다. 출생 후 P0에 E9.5 Lox-STOP-Lox 색종이 조각 쥐 새끼에서 Cre recombinase를 운반하는 렌티바이러스의 초음파 유도 주입 결과가 여기에 나와 있습니다.바이러스의 역가가 높으면 마우스의 피부를 더 많이 커버할 수 있지만 여러 sgRNA가 동일한 세포로 형질전환되는 결과를 낳을 수도 있습니다. 이 플롯은 plasmid 및 lentiviral library transduced cell에서 PCR 증폭 DNA의 차세대 염기서열분석 판독과 4개의 대표적인 종양에서 판독을 보여줍니다. 종양 억제인자 ADAM10 및 RIPK4를 표적으로 하는 sgRNA 가이드는 플라스미드 풀 또는 감염된 세포에 비해 종양 샘플에서 풍부합니다.E9.5에서 수술을 수행하는 것이 중요합니다. 십자가를 세운 후 9일 후에 초음파로 임신 여부를 확인하고 각 암컷 쥐에서 배아 시점을 식별하는 것을 잊지 마십시오. 새끼가 태어나면 형질도입된 세포를 분리하고 단일 세포 RNA 염기서열 분석과 같은 최신 유전자 프로파일링 기술을 사용하여 광범위하게 프로파일링할 수 있습니다.

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Genetics

유전학

이 동영상은 CRISPR-Cas9을 사용하여 게놈이 변형된 형질전환 초파리 파리를 식별하는 스크리닝 방법을 설명합니다. CRISPR-Cas9은 과학자들이 유기체의 게놈을 조작하는 방식에 혁명을 일으킨 강력한 게놈 편집 도구입니다. 예제 프로토콜에서는 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법을 확인할 수 있으며, 여기서 transactivation sequence의 삽입은 branchless(bnl) 유전자의 첫 번째 엑손을 대체하여 bnl 유전자 특이적 드라이버 라인인 bnl-LexA를 생성합니다.

유전체 변형 스크리닝: 초파리에서 CRISPR 생성 돌연변이를 식별하는 방법

형광 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)은 겔 전기 영동, 모세관에 결합 여기에 설명 된 기술 유전자형은 뉴 클레아 제 매개 녹아웃 클론의 높은 처리량 유전자형을 허용한다. 그것은 다른 유전자형 기술에 의해 직면 한 한계를 우회하고 시퀀싱 방법보다 더 비용 효과적입니다.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

마우스 oocytes의 microinjection는 일반적인 transgenesis ( 즉, transgenes의 무작위 통합) 및 CRISPR 매개 유전자 타겟팅 모두에 일반적으로 사용됩니다. 이 프로토콜은 품질 관리 및 유전자 타이핑 전략에 중점을두고 마이크로 인젝션의 최신 개발 상황을 검토합니다.

난 모세포의 미세 주입을 통한 유전자 조작 마우스의 생성

녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.

CRISPR 중재 손실 함수 분석 소 뇌과 립 세포를 사용 하 여 Utero에서 Electroporation 기반 유전자 이동

이 원고에서 급성 골수성 백혈병 (AML) 세포 증식에 여러 후보 유전자의 역할의 간단 하 고 신속 하 게 조사에 대 한 클러스터 정기적으로 Interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) CRISPR-Cas9-기반 방법을 설명 합니다. 병렬입니다. 이 기술은 확장성 이며 다른 암 세포 라인에 적용 될 수 있습니다.

CRISPR-Cas9-기반 경쟁 분석 실험을 사용 하 여 유전 종속성의 조사

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

미리 조립된 Cas9/가이드 RNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 직접 전달은 조혈 세포에서 게놈 편집을 위한 빠르고 효율적인 수단입니다. 여기서, 우리는 RUNX1 인트로닉 소음기를 삭제하고 OCI-AML3 백혈병 세포에서 전사 반응을 검사하기 위해 이 접근법을 활용한다.

급성 골수성 백혈병 세포에서 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질에 의한 RUNX1 내성 소음기의 전사 적 역할 조사

이 원고는 세포외 수용체-리간드 상호 작용을 확인하기 위해 게놈 규모의 세포 기반 스크리닝 접근법을 기술한다.

게놈 규모 CRISPR/Cas9 유전 스크린을 이용한 세포 표면 수용체 식별

여기에서는 CRISPR/Cas9 기술과 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석을 통합하여 조혈 줄기 세포 및 전구 세포의 비정상적인 증식 능력에 중요한 후보 유전자를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

게놈 차원의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을 적용하여 방사선의 저항성 및 민감성 유전자를 선택하기 위한 세심하고 구조화된 접근 방식이 제공됩니다. 이 프로토콜은 또한 임상적으로 투여되는 화학 약물에 대한 내성 메커니즘을 조사하는 다른 연구 노력을 위한 다재다능한 프레임워크 역할을 할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

이 프로토콜은 마우스 유선에서 유전자 노크아웃 및 활성화 연구를 병행할 수 있는  확장 가능한 관내 CRISPR 스크리닝 접근법을 설명합니다.

마우스 유선에서 유전자 결색 및 활성화의 병행 생체 내 스크리닝

배우세요 초음파 유도 자궁 내 렌티바이러스 주사를 이용한 마우스 피부와 구강의 CRISPR/Cas9 스크리닝 방법을. 이 기술은 수백 개 유전자의 종양 억제 기능을 동시에 평가하여 머리 목 암 연구에 효율적인 도구를 제공합니다.

마우스 피부와 구강의 유전자 기능을 동시에 평가하기 위한 Vivo CRISPR/Cas9 스크리닝

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