Name: 마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 학습하세요 마우스 부고환 지방 조직에서 FACS를 이용해 지방 전구 세포를 분리하는 방법을. 높은 생존율과 순도를 확보하여 단일세포 RNA 시퀀싱 등 민감한 하류 분석이 가능합니다.

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우리는 FACS 분류에 대한 지원을 위해 메이요 클리닉 현미경 세포 분석 코어 흐름 세포 분석 시설을 인정합니다.

모든 동물 실험 절차는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 솔루션 준비 
<ol><li>콜라게나아제 2% (w/v) 용액을 100mL 행크스의 균형 잡힌 소금 용액(HBSS)으로 콜라게나아제 II 2g을 용해시켜 준비합니다. Aliquot 200 μL 각 사용에 대 한.</li>
	<li>84mL F-12 배지, 15mL 말 혈청, 1mL 페니실린/연쇄절제술을 혼합하여 중화 매체를 준비한다.</li>
	<li>덜베코의 인산완충식식염(DPBS)의 100mL에서 소 세럼 알부민(BSA)과 0.5M EDTA의 400 μL을 용해하여 유동 세포측정 버퍼를 준비한다.</li>
</ol>2. 부피성 지방 패드 및 조직 해리의 해부
<ol><li>인간적으로 안락사 (이소플루란 / 자궁 경부 탈구) 하나의 남성 마우스. 이 프로토콜에서는 4개월 된 FVB 마우스가 사용되었습니다.</li>
	<li>복부에 70% 에탄올을 바르고 깨끗한 가위와 집게를 사용하여 하복부를 노출시합니다.</li>
	<li>부피성 지방 패드(상반된 지방 패드/고환에 부착)를 찾습니다. 무딘 집게와 고환과 고환 지방 패드 사이의 접합을 잡고 부피 지방 패드를 해방부드럽게 당깁니다.</li>
	<li>실온에서 50mL 원피스 튜브에서 3%의 BSA로 보충된 HBSS5mL에서 가위를 사용하여 절단하여 고환을 제거하고 5mL 의 부피성 지방 패드를 15분 동안 제거합니다.</li>
	<li>원심분리기는 4°C에서 7분 동안 150 x g의 원심분리기.</li>
	<li>50mL 원뿔관에서 부동 부피 지방 패드를 가지고 깨끗한 가위를 사용하여 조직을 잘게 다진다.</li>
	<li>13mL 배양 튜브에 200 μL 콜라게나아제 2% 용액을 3.8mL의 HBSS에 추가합니다. 다진 조직을 추가하고 37 °C에서 1 시간 동안 5 rpm에서 회전 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다. 회전 인큐베이터 대신 37°C의 세포 배양 인큐베이터는 가끔 동요와 함께 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>전체 내용을 50mL 원문 튜브로 옮기고 10mL의 중화 매체를 추가합니다. 튜브를 2-3번 반전시켜 부드럽게 섞는다.</li>
	<li>70 μm 세포 스트레이너가 장착된 또 다른 50mL 원전 튜브를 준비합니다. 소화된 조직을 세포 여과기를 사용하여 새로운 튜브로 필터링합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 350 x g에서 15mL 원심분리기및 원심분리기로 유동을 전달합니다.</li>
	<li>조심스럽게 상체를 제거하고 DPBS의 5 mL로 셀 펠릿을 다시 중단합니다. 4°C에서 10분 동안 350 x g의 원심분리기.</li>
	<li>상체를 조심스럽게 제거하고 50 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 파이펫으로 잘 섞어서 얼음 위에 세포를 보관하세요. 세포 펠릿의 부피와 소량의 잔류 상류체로 인해, 유동 세포 분석 버퍼내의 총 세포 부피는 50 μL(약 100 μL)을 초과할 것이다.</li>
</ol>3. 항체 라벨링 및 형광 활성화 셀 정렬(FACS)
<ol><li>세포를 부드러운 파이펫팅과 잘 혼합한 후 셀 서스펜션의 54 μL을 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브로 옮기습니다. FcR 블로킹 시약 6μL을 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오. 54 μL을 복용한 후 남은 세포를 저장하고 얼음에 보관하여 3.5 단계 및 3.6 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	<li>3.1 단계에서 의 배양 중에, 마이크로센티립후지 튜브에 각각 11 μL의 안티-Sca1-APC, 안티-테르119-FITC, 안티 CD31-FITC 및 안티 CD45-FITC 항체를 결합하여 항체 칵테일을 준비한다. 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞어서 빛으로부터 보호되는 얼음을 유지하세요.</li>
	<li>FcR 블로킹 시약으로 10분 동안 배양한 후 항체 칵테일의 40 μL을 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 4 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>염색된 셀에 DAPI 1 μg/mL로 보충된 500 μL의 유동 세포분석 버퍼를 추가합니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 부드러운 파이펫팅및 필터 셀로 잘 섞으세요. 얼음에 세포를 유지합니다.</li>
	<li>3.1 단계에서 남은 셀에 500 μL의 유동 세포 측정 버퍼를 추가하고 부드러운 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5mL 테스트 튜브를 사용하여 셀을 필터링합니다. 이 세포를 얼음위에 유지하고 다음 단계에서 스테인드 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	<li>스테인드 셀과 스테인드 컨트롤을 FACS 분석 또는 정렬 기기로 가져 가라.<ol>
<li>도 1에표시된 게이팅 전략으로 APC+FITC-/DAPI- 인구를 식별하고 격리합니다. 이 세포는 실행 가능한 Sca1+/Ter119-/CD31-/CD45- 세포를 나타냅니다. 파편 및 셀 응집체는 전방(FSC) 및 측면 분산(SSC) 플롯을 사용하여 고갈됩니다. 그런 다음, DAPI- 인구가 문이 닫힌 다음 APC+/ FITC- 인구의 게이팅이 뒤따릅니다. 스테인드 컨트롤은 게이팅 매개 변수를 설정하는 데 사용되어야 합니다.</li>
		<li>1.5mL 마이크로센트심리후지 튜브에서 500μL의 유동 세포분석 완충제로 세포를 수집한다. 앞으로 모든 절차는 오염을 최소화하기 위해 멸균 조건에서 수행되어야합니다. 대략 50,000 - 100,000 세포는 1개의 마우스에서 집합됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 생존가능성을 평가하기 위해 혈종계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 집계는 추가 다운스트림 분석을 방해할 수 있기 때문에 셀 집계의 존재도 평가되어 이러한 응재의 최소 존재(실행 가능한 셀 수의 5%)를 보장합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Krotkiewski, M., Bjorntorp, P., Sjostrom, L., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+obesity+on+metabolism+in+men+and+women.+Importance+of+regional+adipose+tissue+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Impact of obesity on metabolism in men and women. Importance of regional adipose tissue distribution.</a> The Journal of Clinical Investigation. 72, 1150-1162 (1983).</li>
<li>Salans, L. B., Horton, E. S., Sims, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+obesity+in+man%3A+cellular+character+of+the+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Experimental obesity in man: cellular character of the adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 50, 1005-1011 (1971).</li>
<li>Trayhurn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+adipose+tissue+function+and+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and adipose tissue function and dysfunction in obesity.</a> Physiological Reviews. 93, 1-21 (2013).</li>
<li>Halberg, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1alpha+induces+fibrosis+and+insulin+resistance+in+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1alpha induces fibrosis and insulin resistance in white adipose tissue.</a> Molecular and Cellular Biology. 29, 4467-4483 (2009).</li>
<li>Upadhyay, J., Farr, O., Perakakis, N., Ghaly, W., Mantzoros, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+as+a+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Obesity as a Disease.</a> Medical Clinics of North America. 102, 13-33 (2018).</li>
<li>Cawthorn, W. P., Scheller, E. L., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+stem+cells+meet+preadipocyte+commitment%3A+going+back+to+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue stem cells meet preadipocyte commitment: going back to the future.</a> Journal of Lipid Research. 53, 227-246 (2012).</li>
<li>Cho, D. S., Lee, B., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+the+adipose+progenitor+cell+landscape+in+healthy+and+obese+visceral+adipose+tissue+using+single-cell+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science+Alliance%22%5BJournal%5D)">Refining the adipose progenitor cell landscape in healthy and obese visceral adipose tissue using single-cell gene expression profiling.</a> Life Science Alliance. 2, 201900561(2019).</li>
<li>Burl, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+Adipogenesis+Induced+by+beta3-Adrenergic+Receptor+Activation+with+Single-Cell+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling.</a> Cell Metabolism. 28, 300-309 (2018).</li>
<li>Hepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functionally+distinct+fibro-inflammatory+and+adipogenic+stromal+subpopulations+in+visceral+adipose+tissue+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice.</a> eLife. 7, 39636(2018).</li>
<li>Merrick, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mesenchymal+progenitor+cell+hierarchy+in+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue.</a> Science. 364, 2501(2019).</li>
<li>Schwalie, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stromal+cell+population+that+inhibits+adipogenesis+in+mammalian+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots.</a> Nature. 559, 103-108 (2018).</li>
<li>Raajendiran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Metabolically+Distinct+Adipocyte+Progenitor+Cells+in+Human+Adipose+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of Metabolically Distinct Adipocyte Progenitor Cells in Human Adipose Tissues.</a> Cell Reports. 27, 1528-1540 (2019).</li>
<li>De Matteis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+physiological+transdifferentiation+of+adult+adipose+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo physiological transdifferentiation of adult adipose cells.</a> Stem Cells. 27, 2761-2768 (2009).</li>
<li>Hanamsagar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+workflow+for+single-cell+transcriptomics+and+repertoire+profiling+of+purified+lymphocytes+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized workflow for single-cell transcriptomics and repertoire profiling of purified lymphocytes from clinical samples.</a> Scientific Reports. 10, 2219(2020).</li>
<li>Marinovic, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crotamine+induces+browning+of+adipose+tissue+and+increases+energy+expenditure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Crotamine induces browning of adipose tissue and increases energy expenditure in mice.</a> Scientific Reports. 8, 5057(2018).</li>
<li>Takahashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+clinical+availability+of+adipose-derived+stem+cells+for+pelvic+dead+space+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biological and clinical availability of adipose-derived stem cells for pelvic dead space repair.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1, 803-810 (2012).</li>
<li>Cowan, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+adult+stromal+cells+heal+critical-size+mouse+calvarial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects.</a> Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).</li>
<li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24, 2746-2756 (2018).</li>
</ol>

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단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 단일 세포 수준에서 다양한 세포 집단을 동시에 연구하는 강력한 도구로서 빠르게 견인력을 얻고 있다. 시료 준비와 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 높은 비용으로 인해 실험 성공 가능성을 높이기 위해 세포 입력(높은 생존가능성 및 순도)을 최적화하는 것이 필수적입니다. 일부 세포 준비 프로토콜은 FACS 정렬14없이 낮은 스핀 세차및 컬럼 기반 분리를 사용하여 죽은 세포 및 파편제거에 의존한다. 그러나 이러한 방법의 대부분은 실행 가능한 복구 된 세포의 수를 크게 감소시키고 많은 경우에 죽은 세포가 완전히 제거되지 않습니다14. 이 프로토콜은 최소한의 세포 이물질, 세포 이중 및 죽은 세포를 포함하는 매우 실행 가능한 Sca1+ 지방 전구 세포를 격리하는 간단한 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 격리된 세포는 높은 생존력을 보였지만, 높은 생존력을 유지하기 위해 세포 격리...

지방 조직은 에너지 대사에 중요한 역할을합니다. 과도한 에너지는 지질의 형태로 저장되며, 지방 조직은 영양 상태와 에너지 수요에 따라 상당한 확장 또는 후퇴가 가능합니다. 지방 조직의 확장은 지방 세포 크기 (비대) 및 /또는 지방 세포 수 (hyperhyperasia)의 증가에서 발생할 수 있습니다. 후자의 과정은 지방 선조 세포의 증식 및 분화에 의해 단단히조절된다 1,2. 비만 도중, 지방 조직은 과도하게 확장되고, 조직 기능 장애 – 저산소증을 포함하여, 염증 및 인슐린 저항 - 수시로3,4를개발합니다. 이러한 합병증은 고혈압, 당뇨병, 심혈관 질환, 뇌졸중 및 암5를포함한 많은 만성 질환에 대한 위험 요소입니다. 따라서 통제되지 않는 지방 조직 확장을 제한하고 지방 조직 병리학을 완화하는 것이 최고의 생체 의학 연구 우선 순위입니다. 지방 조직 팽창 동안, 상주 지방 조직 유래 줄기 세포 (ASC)는 증식하고 preadipocytes로 순차적으로 분화 (헌신적 인 전구 세포) 다음 성숙한 지방 세포6로분화한다. 최근 단세포 RNA-시퀀싱(scRNA-seq) 연구는 이러한 지방 선조 세포(APC) 집단(ASC 및 preadipocytes)이 상당한 분자 및 기능성 이질성7,8,9,10,11,12를나타낸다는것을 보여준다. 예를 들어, ASC는 감소된 사이포겐화 분화 능력을 표시하는 동시에, 또한 지방세포7에비해 더 높은 증식 및 확장 기능을 나타낸다. 추가 분자 다름은 ASC 및 preadipocyte 인구 내에서 보고됩니다, 그러나 이 다름의 기능적인 관련성은 불분명남아7. 함께, 이러한 데이터는 지방 선조 세포 풀의 복잡성을 강조하고 더 나은 이해하고 이러한 중요한 세포 인구를 조작하기 위해 도구를 개발하고 표준화 할 필요성을 강조한다.
이 프로토콜은 단일 세포 연구 (scRNA-시퀀싱) 및 세포 배양을 포함하여 민감한 다운스트림 분석에 적합한 마우스 상피 지방 패드에서 높은 생존성 Sca1+ 지방 전구 집단의 분리를 자세히 설명합니다. 상고체 지방 패드의 격리 및 해리는 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다7,13 격리 된 APC의 생존가능성을 개선하는 약간의 수정. 간단히 말해서, 상고성 지방 패드에서 해리된 세포는 Sca1에 대한 항체, ASC 및 프리디포사이클6,7및기타 계보(Lin) 마커모두에 대한 마커로 염색됩니다: Ter119(적혈구), CD31(내피 세포), CD45(leukocytes). 실행 가능한 Sca1+/ter119-/CD31-/CD45-/DAPI- 세포는 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 의해 정렬됩니다. 중요한 것은, 이 프로토콜은 ASC 및 프레디포세포7내의 기능적으로 이질적인 하위 집단을 확인한 최근 단세포 RNA 시퀀싱 연구에서 보고된 실행 가능한 Sca1 +/Lin-분면 전구 세포의 성공적인 격리 및 분석에 의해 검증되었다.

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td>, <td>VWR</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>13 mL 배양 튜브</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>50-809-216</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td>, <td>Greiner Bio-one</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 시험관(셀 스트레이너 스냅 캡 포함</td><td>) Thermo Fisher Scientific</td><td>08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 코니컬 튜브</td>, <td>Greiner Bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>70 &마이크로; m cell strainer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31-FITC 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-519</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45-FITC 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-491</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SCA1-APC 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-833</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter119-FITC 항체</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-908</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-420-500</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase type II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101-015</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>F-12 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FcR 차단 시약</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide 용액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Tel.: 130-093-233</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

Preparation of Adipose Progenitor Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissues

당뇨병, 심장병 및 암과 같은 비만 및 대사 장애는 모두 극적인 지방 조직 리모델링과 관련이 있습니다. 조직 거주자 지방 선조 세포 (APC)는 조직 항상성에 중요한 역할을하고 조직 병리학에 기여할 수 있습니다. 단세포 RNA-염기서열 분석 및 단세포 프로테오믹스를 포함한 단일 세포 분석 기술의 사용이 증가하고 있으며, 인구 또는 조직 전반의 변화의 맥락 내에서 개별 세포 발현 변화의 전례 없는 해결을 허용함으로써 줄기/전구 세포 분야를 변화시키고 있다. 이 문서에서는 마우스 부피 지방 조직을 해부하고, 단일 지방 조직 유래 세포를 분리하고, 형광 활성화 세포 정렬(FACS)을 수행하여 실행 가능한 Sca1 +/CD31-/CD45-/Ter119- APC에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 통해 조사관은 단일 세포 RNA 염기서열분석과 같은 다운스트림 분석에 적합한 고품질 APC를 준비할 수 있습니다.

4개월 된 남성 FVB 마우스는 이 실험에서 사용되었다. FSC/SSC 플롯을 사용하여 파편과 이중을 제외한 후 실행 가능한 세포(DAPI-인구)가 게이트되었고, 그 다음으로 APC+/FITC-인구(도1)의선택이 뒤따랐다. DAPI, APC 및 FITC 게이트는 스테인드 컨트롤을 기반으로 그려졌습니다. 게이팅 전략은 그림 1에표시됩니다.
1h 분류 후, 절연의 질은 유동 세포측정분석(그림 2,3)에의해 정량적으로 평가되었다. 세포는 생존성 염색을 위해 프로피듐 요오드 용액(1:100)으로 염색하였다. 분류에 동일한 게이팅을 사용하여, 세포는 높은 생존력과 순도를 유지했다: 92.6 ± 2.2% 단일 세포 (도 2의세 번째 패널), ...

우리는 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 마우스 전도성 지방 패드에서 매우 실행 가능한 지방 전구 세포를 분리하는 간단한 방법을 제시한다.

Obesity and metabolic disorders such as diabetes, heart disease, and cancer, are all associated with dramatic adipose tissue remodeling. Tissue-resident ...

이 프로토콜은 민감한 다운스트림 분석을 위해 마우스 부고환 지방 조직에서 고품질 지방 전구 세포를 분리할 수 있습니다. 이 기술은 생존력이 높은 지방 전구 세포를 생성하며 최근 단일 세포 RNA 염기서열 분석 연구에서 검증되었습니다. 수컷 쥐를 안락사시킨 후 부고환 지방 패드를 찾아 뭉툭한 집게로 부드럽게 당겨 신중히 관찰합니다.가위를 사용하여 고환을 제거하고 50ml 원추형 튜브에 3% BSA가 보충된 HBSS 5ml에 부고환 지방 패드를 15분 동안 배양합니다. 배양 후 150 x g에서 튜브를 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리합니다. 원뿔형 튜브에서 떠 있는 부고환 지방 패드를 제거하고 깨끗한 가위로 잘게 다집니다.13ml 배양 튜브에 200ml의 2%콜라겐 분해효소 용액을 3.8ml의 HBSS에 추가합니다. 그런 다음 다진 조직을 넣고 섭씨 37도에서 1시간 동안 5RPM의 회전 인큐베이터에서 배양합니다. 전체 내용물을 50ml 원추형 튜브에 옮기고 10ml의 중화 매체를 추가합니다.튜브를 두세 번 뒤집어 부드럽게 섞습니다. 70마이크로미터 세포 여과기가 장착된 또 다른 50ml 원뿔형 튜브를 준비하고 소화된 조직을 새 튜브로 여과합니다. 흐름을 15ml 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분당 350 x g의 속도로 원심분리합니다.상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 5ml의 DPBS로 재현탁합니다. 그런 다음 튜브를 10분 더 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 50마이크로리터의 유세포 분석 완충액을 추가합니다.부드럽게 피펫팅하여 세포를 혼합하고 얼음 위에 보관하십시오. 유세포 분석 완충액에 있는 세포의 총 부피는 약 100마이크로리터가 될 것입니다. 세포를 혼합한 후 54마이크로리터의 세포 현탁액을 1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.6마이크로리터의 FCR 차단 시약과 피펫을 부드럽게 첨가하여 혼합합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 10분 동안 튜브를 배양합니다. 남은 세포는 얼룩지지 않은 방제로 사용할 수 있도록 얼음 위에 보관하십시오.배양 중에 마이크로 원심분리기 튜브에 anti-Sca1-APC, anti-Ter119-FITC, anti-CD31-FITC 및 anti-CD45-FITC 항체를 각각 11마이크로리터씩 결합하여 항체 칵테일을 준비합니다. 혼합물을 부드럽게 피펫으로 만들고 빛으로부터 보호된 얼음 위에 보관하십시오. FCR 차단 시약으로 배양한 후 항체 칵테일 40마이크로리터를 넣고 부드러운 피펫팅으로 잘 섞습니다.세포를 섭씨 4도에서 10분 더 배양합니다. 밀리리터당 1마이크로그램 DAPI가 보충된 500마이크로리터의 유세포 분석 완충액을 염색 세포에 추가합니다. 잘 섞고 세포 여과기 스냅 캡이 있는 5ml 시험관을 사용하여 세포를 여과합니다.그런 다음 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 염색되지 않은 세포에 500마이크로리터의 유세포 분석 완충액을 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 셀 스트레이너 스냅 캡이 있는 5ml 시험관을 사용하여 세포를 여과하고 얼음 위에 보관합니다.염색된 세포와 염색되지 않은 대조군을 FACS 분석 또는 분류 기기로 운반합니다. 텍스트 원고에 설명된 게이팅 전략을 사용하여 APC 양성, FITC 음성, DAPI 음성 모집단을 식별하고 분리합니다. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 게이팅 매개변수를 설정할 수 있습니다.FSC-SSC 플롯을 사용하여 파편과 이중항을 배제한 후, 생존 세포를 게이팅한 후 APC 양성, FITC 음성 집단을 선택했습니다. DAPI, APC 및 FITC 게이트는 염색되지 않은 대조군을 기반으로 그려졌습니다. 다음 결과는 4개월 된 수컷 FVB 마우스에서 지방 전구 세포를 분리한 것을 보여줍니다.1시간 분량의 분류 후, 유세포 분석 분석을 통해 분리 품질을 정량적으로 평가했으며, 이는 세포가 높은 생존력과 순도를 유지하는 것을 입증했습니다. 이 프로토콜 이후에 단일 세포 RNA 염기서열분석, 정량적 real-time PCR 및 유세포 분석과 같은 민감한 다운스트림 분석을 수행할 수 있습니다. 이를 통해 지방 전구 세포의 추가 특성화를 수행할 수 있습니다.지방 전구 세포는 추가적인 단세포 연구가 필요한 이질적인 집단입니다. 이 방법을 사용하면 단일 세포 연구에 적합한 세포를 분리할 수 있습니다.

preparation-adipose-progenitor-cells-from-mouse-epididymal-adipose

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 쥐 대동맥 주위 지방 조직에서 형광 표지된 신경능선 유래 지방 유래 줄기세포(ADSC)를 분리 및 배양하는 기술을 보여줍니다. 분리 후 NCADSC를 검출하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 분류한 후 플레이트에서 배양하여 세포 증식을 촉진합니다.

쥐 대동맥 지방 조직에서 지방 유래 줄기 세포 분리

여기에서는 MCS (Magnetic-activated Cell Sorting)를 사용하여 Perivascular Adipose Tissue (PVAT)에서 지방 세포 전구 세포 (Adipocyte Progenitor Cell, APC) 개체군을 분리하는 방법을보고합니다. 이 방법은 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting)와 비교할 때 지방 조직 1g 당 APC의 증가 된 분리를 허용합니다.

자기 활성화 세포 정렬에 의해 분리 된 혈관 주위 지방 조직으로부터의 지방 전구 세포 전구 세포의 확장 및 지방 생성 유도

지방 조직 혈관 창시자에서 흰색과 베이지색 adipocytes의 차별화는 비만에 대사 개선 위한 잠재력을 맺는 다. 우리는 CD34 + CD31 + 인간의 지방에서 내 피 세포 격리 및 후속 시험관에 확장 및 차별화 흰색과 베이지색 adipocytes에 프로토콜을 설명합니다. 여러 다운스트림 응용 프로그램을 설명 합니다.

절연, 확장, 및 Adipogenic CD34 + CD31 + 인간의 Omental 및 피하 지방 조직에서 내 피 세포의 유도

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

그들은 pluripotency에 대한 표준 테스트를 통과 때도 생성 유도 만능 줄기 세포 (iPSC) 라인이 발달 가능성을 서로 다른 행을 생산하고 있습니다. 여기 가진 전체 pluripotency로 iPSC 라인을 정의 iPSCs에서 완전히 파생 쥐를 생산하기 위해 프로토콜을...

유도 만능의 줄기 세포에서 파생 마우스의 생성

학습하세요 마우스 부고환 지방 조직에서 FACS를 이용해 지방 전구 세포를 분리하는 방법을. 높은 생존율과 순도를 확보하여 단일세포 RNA 시퀀싱 등 민감한 하류 분석이 가능합니다.

마우스 전형 지방 조직에서 지방 전구의 준비

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