Name: 병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 학습하세요 병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 방법론을. 블로팅 페이퍼 기법과 식 팟 기법을 사용하여 Rhizoctonia bataticola와의 상호작용을 연구하고, 병원균 내성이 있는 품종을 선별하는 데 활용할 수 있습니다.

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M.S.K 연구소의 프로젝트는 국립 식물 게놈 연구 핵심 자금 조달에 의해 지원됩니다. VI는 DBT-JRF(DBT/2015/NIPGR/430)를 인정합니다. 우리는 비디오 촬영 중 기술 적 도움을 준 훈련생 리시카 양, 자야첸 씨, 두르가데비 양에게 원시 데이터와 원고 파일을 비판적으로 평가해 준 것에 대해 감사드립니다. 라힘 H 타라프다르 씨와 선더 솔란키 씨가 실험실에서 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 DBT-eLibrary 컨소시엄 (DeLCON) 및 NIPGR 도서관이 공장 성장 지원 / 공간을위한 e 자원 및 NIPGR 플랜트 성장 시설에 대한 액세스를 제공하는 것을 인정합니다.

1. R. 바타티콜라 의 격리 및 저장
<ol><li>병아리콩 유전자형 및 DRR 증상의 세부 사항<ol>
<li>일반적으로 건조, 취성 1 차 뿌리와 같은 전형적인 DRR 증상을 보이는 병아리콩 식물 (유전자형, JG 62)을 사용하여 껍질 아래 와 pith1,3내부의 측면 뿌리및 미세 경화증이 없는경우.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수거 및 세척<ol>
<li>표피 층 아래 미세경화증을 가진 마른 짚 색 의 엽및 취성 1 차 뿌리와 같은 현상을 보여주는 뿌리 식물. 뿌리 뽑는 동안, 뿌리의 주요 부분은 감염된 뿌리가 취성이기 때문에 토양 내부에 남아있을 것입니다. 뿌리에 부착된 거친 토양 파편을 제거합니다. 뿌리를 따로 자르고 적절한 라벨로 종이 봉투(27.5cm x 12cm)로 수집하여 샘플 수집 상자에 넣습니다.</li>
		<li>샘플을 실험실로 운반한 후 뿌리를 200mL 비커에 놓고 메쉬(직경 3mm 크기의 나일론 메쉬)로 덮어, 흐르는 수돗물로 뿌리를 철저히 씻어 토양 입자를 제거합니다.</li>
		<li>역삼투압(RO) 물을 사용하여 마지막에 한 번 헹구세요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>표면 살균<ol>
<li>메스 블레이드로 각각 2cm 길이로 뿌리를 4개로 부수고 깨끗한 200mL 비커에 넣습니다.</li>
		<li>라미나르 플로우 챔버 내부에 오토클레이브 RO 물, 2% NaOCl, 폐기 항아리 및 자동 블로팅 용지(5cm2)를조립합니다.</li>
		<li>50mL의 오토클레이브 RO 워터로 뿌리를 세 번 씻은 다음 50mL의 2% NaOCl으로 10분 간 세척합니다. 뿌리를 RO 물 50mL로 세 번 다시 씻어 NaOCl을 제거합니다.</li>
		<li>블롯은 뿌리를 오토클레이브 블로팅 용지에 놓고 뿌리가 건조될 때까지 그대로 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어 및 인큐베이션<ol>
<li>멸균 된 메스 블레이드로 뿌리의 가장자리를 제거합니다. 블레이드를 이용하여 뿌리를 분할하고 멸균 된 집게를 사용하여 감자 덱스트로스 천 (PDA) 미디어 페트리 플레이트에 연쇄상 구균 황산염 (50 mg L-1)및 암피실린 (50 mg L-1)을함유한다.</li>
		<li>판을 닫고 파라필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 이틀 동안 28 °C의 인큐베이터에서 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>최면 팁 방법<ol>
<li>잠복 2 일 후, 라미나르 흐름 챔버에 플레이트를 가져. 스테레오현미경(라이카 EZ4 교육 스테레오현미경)에서 최면 성장8의 끝을 잘라내고 연쇄상 구균 황산염및 암피실린을 갖춘 신선한 PDA 플레이트로 옮는다.</li>
		<li>어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>R. 바타티콜라 곰팡이 무접종의 보관 및 유지 보수<ol>
<li>시험관에서 PDA 경사를 만들고 화염 살균 접종 루프를 사용하여 10 일 된 배양 판에서 곰팡이 천마 플러그를 전송합니다. 파라필름으로 테스트 튜브 캡을 밀봉합니다.</li>
		<li>어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 경사를 배양하십시오.</li>
		<li>파라필름으로 캡을 다시 밀봉하고 냉장고에 4°C로 보관하여 향후 사용하십시오.</li>
		<li>곰팡이를 유지하기 위해 6 개월마다 하위 문화.</li>
	</ol>
</li>
	<li>독성 유지 보수<ol>
<li>아픈 냄비 기술3에서언급 한 대로 준비 된 순수한 곰팡이 무분비로 식물을 감염하십시오. 감염된 식물 (코흐의 추정)9에서 동일한 곰팡이를 분리하고 추가 실험에 사용합니다. 참고 : 이 연구에서, 곰팡이의 필드 고립 된 변형이 사용되었다 (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 종이 기술을 블로팅
참고: 얼룩진 종이 기술은 액체 곰팡이 접종, 모종 준비 및 질병 평가의 준비를 수반합니다.
<ol><li>액체 R. 바타티콜라 접종 준비 참고: 액체 R. 바타티콜라 곰팡이 접종에는 균증과 미세성 내분이 모두 포함되어 있습니다. 이 두 구조는 기본 무분비로 작용합니다.<ol>
<li>1,000mL 플라스크로 500mL의 PDB 미디어를 준비하고 15분 동안 121파운드에서 오토클레이브를 준비한다.</li>
		<li>미디어가 냉각된 후, 곰팡이 경사 배양에서 곰팡이 가루 플러그로 국물을 접종하고 어둠 속에서 180 rpm에서 셰이커에서 5 일 동안 28 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>테이블에 오토클레이브 유리 또는 플라스틱 깔때기 (10cm), 1 리터 원뿔 플라스크 및 두 층의 메쉬 (10cm2 크기) (직경 3mm의 모공 크기가있는 나일론 메쉬)를 조립합니다. 메쉬를 사용하여 곰팡이 균증과 미세 경화증을 걸러내세요. 블로는 오토클레이브 블로팅 페이퍼로 곰팡이를 말리십시오.</li>
		<li>50% 비수근에 100g 의 mycelia의 무게와 실온에서 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>병아리콩 식물의 준비<ol>
<li>50개의 건강한 씨앗을 선택합니다(이 연구에서 DRR에 취약한 유전자형 JG 62가 사용됨), 100mL 비커에 배치하고 메쉬로 덮습니다.</li>
		<li>먼저 수돗물로 씨앗을 씻어 토양 이물질을 제거합니다.</li>
		<li>씨앗이 있는 비커를 라미나르 유량 챔버에 넣고 세척당 1분 동안 50mL의 RO 물로 세척할 수 있습니다.</li>
		<li>50mL의 2% 수성 NaOCl으로 씨앗을 2분 동안 연속 흔들림으로 살균하고 50mL의 멸균수로 씨앗을 1분 동안 5회 세척합니다.</li>
		<li>폴리에틸린 백(47.5cm x 25cm)을 토양라이트(원예 등급의 혼합물)로 채우고, 아이리쉬 피트 이끼, 그리고 동등한 비율로 각질 제거 버미쿨라이트, 1/3:1/3:1/3), 표면 살균 50 씨앗 2cm 깊이를 뿌리고, 28 °C ± 2 °C 온도, 16 h 광기간을 150mol μ m-2,1 %의 빛 강도로 성장 챔버 / 방에 보관하십시오. RO 물로 물을 뿌리고 파종 후 8 일 동안 식물을 뿌리 뽑습니다.</li>
		<li>수돗물에 뿌리를 씻어 토양당 입자를 제거합니다. 멸균 된 RO 물로 뿌리를 헹구고 1000 mL 비커로 RO 물에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트레이에 용지를 얼룩질 준비<ol>
<li>얼룩진 종이를 가져 와서 복제를 충족하기에 충분한 숫자로 조각 (30cm × 23cm)로 잘라냅니다.</li>
		<li>자동 분해성 폴리에틸렌 백에 시트를 포장하고 121 파운드로 15 분 동안 오토 클레이브하고 건조를위한 뜨거운 공기 오븐에 보관하십시오.</li>
		<li>각 얼룩진 용지 시트를 반으로 접습니다.</li>
		<li>그림 2i-iv에표시된 것처럼 깨끗하고 정신이 닦은 플라스틱 트레이에 종이를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>담그면 식물 접종<ol>
<li>200mL 비커에 200mL 오토클레이브 RO 물에 곰팡이 이노쿨럼 100g을 녹여 50% 접종을 합니다.</li>
		<li>간헐적인 상하 운동으로 제조된 접종에 식물 뿌리를 담그고 곰팡이 무분비의 균일한 부착을 보장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>식물을 얼룩진 종이에 넣습니다.<ol>
<li>멸균 된 RO 물로 트레이에 놓인 블로팅 용지의 하단을 적시. 뿌리만 종이로 덮여 있고 싹이 남지 않는 방식으로 종이에 식물을 놓습니다.</li>
		<li>얼룩지는 종이의 상단을 접고 전체 종이를 적시어 식물 성장을 유지하기에 충분한 물을 공급하십시오.</li>
		<li>트레이를 하루에 한 번 물에 담고 트레이를 28°C로 유지합니다. 매일 괴사, 뿌리 부패 및 잎 황색과 같은 증상을 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 아픈 냄비 기술
참고 : 아픈 냄비 기술은 악성 접종과 아픈 냄비의 준비, 수분 수준의 유지 보수 및 질병 증상의 평가를 수반한다.
<ol><li>기판 준비<ol>
<li>시판되는 병아리콩 씨앗 1kg을 섭취하십시오. 감염된 씨앗을 제거하십시오 (곰팡이 성장, 감염 반점 및 곤충 손상이있는 씨앗). 5 L 플라스틱 비커에 놓고 수돗물로 3-4번 철저히 씻어 주요 이물질을 제거합니다.</li>
		<li>2L의 RO 물로 씨앗을 세 번 씻고 5 L 비커에 1kg 씨앗을 담그고 5 h의 물을 3 배 더 넣습니다.</li>
		<li>씨앗이 물을 뿌리면, 세 번 RO 물로 다시 씻어 씨앗을 제거합니다.</li>
		<li>물을 완전히 제거하고 씨앗을 잼 병(높이 300mL, 높이 12cm, 직경 6cm, 무게 155g)에 약1/4번째 용량(잼 병 당 100g)으로 포장하고 캡으로 병을 닫습니다. 자동 복제 가능한 비닐 봉지(48cm x 30cm)에 10개의 잼 병을 121파운드로 두 번 포장하여 15분 동안 계속 포장합니다.</li>
		<li>하룻밤 동안 오븐에서 40°C에서 씨앗을 건조하여 병 내부의 물방울을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아픈 문화의 준비<ol>
<li>BSL-2 레벨 라미나르 유량 챔버를 켭니다. 70% 에탄올로 바닥을 철저히 닦고 15분 동안 UV를 켭니다. 그런 다음, 라미나르 흐름 챔버 내부에 씨앗을 유지합니다.</li>
		<li>10일 된 갓 고립 된 R. 바타티콜라 문화 (1 부)를 가져 가라. 그런 다음 멸균 파이펫 팁이나 코르크 보어를 사용하여 3 개의 곰팡이 천 플러그 (직경 4mm)를 가져 가서 무균 잼 병에 넣습니다. 캡으로 병을 덮고 파라필름으로 밀봉합니다.</li>
		<li>병아리콩 씨앗과 곰팡이 디스크를 균일하게 혼합하기 위해 병을 흔들어.</li>
		<li>어둠 속에서 15 일 동안 30 °C에서 병을 배양하십시오.</li>
		<li>검은 곰팡이 성장(그림 4iii)과잼 병을 가지고 멸균 집게를 사용하여 유리 페트리 플레이트에 잼 병에서 아픈 문화 (미세 경화증씨앗)를 전송합니다. 유리 페트리 접시에 이틀 동안 실온에서 그들을 건조.</li>
		<li>모르타르와 유봉을 사용하여 곰팡이 덩어리를 분말화하고 분말을 4 °C에 저장합니다.</li>
		<li>오토클레이브 토양은 15 분 동안 121 파운드에서 두 번.</li>
		<li>자동 음영 으로 자동 토양 을 건조.</li>
		<li>곰팡이 분말을 토양과 50 % w /w로 섞고 냄비를 혼합물로 채우고 하루 동안 실온에서 유지하십시오.</li>
		<li>냄비당 표면 멸균 된 DRR -깨지기 쉬운 병아리콩 씨앗 (10cm 둥근 냄비)(재료 표)을 뿌리고 80%의필드 용량 (FC)의 수분 수준을 유지합니다.</li>
		<li>발아 후 식물을 뿌리 뽑아 괴사 및 뿌리 부패와 같은 증상을 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아픈 냄비 효율 평가 참고: 뿌리가 완전히 썩으면 식물은 노란 잎 증상을 보여줍니다.<ol>
<li>병변(괴사 반점)(보충도2C)및 루트 부패의 중증도에 기초한 질병 점수를 개발한다. 90%의 식물 죽음을 보여주는 아픈 냄비는 더 이상 사용될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유전자형 스크리닝<ol>
<li>아픈 문화를 대량으로 준비하고 30cm 높이의 냄비에 멸균 된 토양 또는 필드 토양 (5 % w /w)과 혼합하십시오. 냄비에 물을 주어 표면에 젖어 7 일 동안 방해받지 않고 둡니다.</li>
		<li>둥근 냄비 10cm당 표면 멸균 시드 1개를 뿌리고 30cm 둥근 냄비당 3개의 씨앗을 뿌리고 물을 적절히 뿌릴 수 있습니다.</li>
		<li>노란색 엽서 및 루트 부패 증상을 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>결합 된 가뭄과 R. 바타티콜라 감염<ol>
<li>신하 등에서 언급 된 프로토콜을 따라 가뭄 스트레스를 부과합니다.(2019).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+root+rot+%28Rhizoctonia+bataticola+%28Taub.%29+Butler%29%3A+an+emerging+disease+of+chickpea+-+where+do+we+stand%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Phytopathology+and+Plant+Protection%22%5BJournal%5D)">Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand.</a> Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).</li>
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</ol>

우리는 공개 할 것이 없다

얼룩지는 종이 기술은 실험실 조건 하에서 병아리콩 유전자형을 검사하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 딥 접종을 통해 접종부하(보충 도 1)를쉽게 제어하여 현세적 기초에 대한 상호 작용의 조사를 가능하게 하고 체외 검사를 용이하게 합니다. 또한, 심지어 젊은 묘목을 사용할 수 있습니다. 5일 된 곰팡이 배양(도 1B)은식물을 감염시킬 만큼 충분한 접종을 할 수 있습니다. 액체 접종은 균골과 미세 경화증(도 1D & E)을모두 함유하고 있습니다. 루트 부패증상(도 3B)은질병을 점수매기고 내성 유전자형을 식별하는 데 사용될 수 있다. DRR 발생은 주로 가뭄 스트레스1,3,<sup clas...

건조 루트 부패 (DRR)는 병아리콩1,2에서경제적으로 중요한 질병 중 하나입니다. 그것은 Rhizoctonia 바타티콜라에 의해 발생 하는 루트 특이 적인 질병 (텔레모프, 거시 포 미나 phaseolina). 감염된 식물은 측면 뿌리가 부족하고 부서지기 쉬운 타뿌리와 노란색 단풍1,3을가지고 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 DRR은 병아리콩재배1,2,3에대한 새로운 위협으로 보고되었습니다. 더욱이, DRR발생률은1, 2,3의현장조건하에서 가뭄 스트레스하에서 악화되는 것으로 보고된다. DRR은 관개 필드4보다비가 많이 내리는 지역에서 더 널리 퍼져 있습니다. 내성 품종의 활용은 질병을 극복하고 살균제 사용1,13을우회하는 방법입니다. 전 세계적으로 사용할 수있는 병아리 콩 세균은 특성5에대한 유전 적 변이를 항구하기 때문에, 내성 / 깨지기 쉬운 유전자형의 선별 및 식별은 작물 개선을위한 분자 번식에 매우 중요합니다.
견고하고 쉽고 비용 효율적인 질병 애약은 병아리콩의 R. 바타티콜라 감염 패턴을 조사하는 데 필수적입니다. R. 바타티콜라 감염에 대한 병아리콩 유전자형의 반응을 관찰하는 데 사용되는 1차 질환 분석법은 블로팅 종이 기술1,4이다. 그것은 간단한 기술이며 액체 곰팡이 접종, 뿌리가있는 모종 및 멸균 얼룩지를 사용하여 실행할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 문헌에서 단계별 프로토콜을 사용할 수 없기 때문에 최대한 활용되지 않았습니다.
한편, 아픈 냄비 기술은 잠재적 인 아픈 문화의 준비와 가뭄 스트레스의 부과를 포함한다. 가뭄 스트레스가 DRR 질환 발생률 을 악화시키는 것을 감안할 때3,가뭄 스트레스6,7하에서식물 병원체 상호 작용을 연구하는 것이 필수적이다. 아픈 냄비 기술은 이러한 동시 연구를위한 플랫폼을 제공, 세균 검사를위한 더 나은 가능성을 촉진하고 상호 작용의 기계론적 기초를 이해. DRR 질병에 내재된 루트 길이의 증가 및 측면 루트 수의 감소와 같은 병리학적 변화는 아픈 냄비 기술1,3,7을사용하여 해결할 수 있다.
본명, 병아리콩과 R. 바타티콜라 와 스크린 병아리콩 세균질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 종이와 아픈 냄비 기술을 부팅하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 연구에 사용된 재료의 세부 사항은 재료 표에부여됩니다.

<table><tbody><tr><td>곰팡이- Rhizoctonia bataticola</td><td>Pathogen inoculum</td><td>Indian Type Culture Collection No. 8365</td><td>GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&amp; id=1251&Itemid=1370)</td></tr><tr><td>Soilrite mix</td><td>Soil medium in the lab</td><td>Keltech Energies Limited, Bangalore, India</td><td>http://www.keltechenergies.com/</td></tr><tr><td></td><td>식물 성장을 지원하는 여과지 블로팅 페이</td>퍼 <td>Himedia</td><td>http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374</td></tr><tr><td>Pot</td><td>10cm 및 30cm 크기의 화분</td><td>정기적으로 사용되는 종묘장, 예를 들어,</td><td></td></tr><tr><td>https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html 감자 포도당 한천 / 육수</td><td>배양 및 곰팡이 유지</td> Cat<td># 213400, DifcoTM, MD, USA</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>배양 곰팡이</td><td>LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, 인큐베이터 및 셰이커</td><td></td></tr><tr><td>http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 성장 챔버</td><td>통제된 조건에서 식물 성장</td><td>모델 번호 A1000, Conviron, Canada</td><td>https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber</td></tr><tr><td>층류 기류</td><td>무균 운동</td><td>수행 Telstar, Bio II advance, Class II 캐비닛, EN-12469-2000</td><td>https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html</td></tr><tr><td>Mesh</td><td>곰팡이 균사체 필터링</td><td>나일론 모기장</td><td>메쉬 0.6-1 mm 직경 기공 크기</td></tr><tr><td>오토클레이브</td><td>오토클레이브 매체 및 병아리콩 씨앗</td><td>오토클레이브</td><td>http://www.scientificsystems.in/autoclave</td></tr><tr><td>현미경</td><td>감염 시각화 곰팡이 균</td>사체 <td>SMZ25 / SMZ18, 연구 실체 현미경, 라이카 EZ4 교육용 실체 현미경</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i</td></tr><tr><td>저울</td><td>칭량 곰팡이 및 화학 물질 칭량</td><td>Sartorius 전자 칭량 저울, BSA 4202S-CW</td><td>https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances</td></tr><tr><td>WGA-FITC</td><td>곰팡이 염색</td><td>시그마</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN</td></tr><tr><td>아닐린 블루</td><td>곰팡이 염색</td><td>Himedia</td><td>http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901</td></tr></tbody></table>

병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론

Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology

건조 루트 부패 (DRR) 질병은 전 세계 병아리콩 재배에 대한 새로운 생물학적 스트레스 위협입니다. 토양에 의한 곰팡이 병원체인 리조토니아 바타티콜라에의한 것이다. 문헌에서는 질병 분석에 대한 포괄적이고 상세한 단계별 프로토콜은 희소합니다. 이 문서에서는 DRR에 대한 저항성을 위해 유전자형을 신속하게 선별하기 위한 블로팅 용지 기술을 설정하는 데 관련된 단계에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 블로팅 페이퍼 기법은 쉽고 저렴합니다. 아픈 냄비 접근법에 근거한 또 다른 방법은 자연 감염의 모방이며 질병 삼각형에 관여하는 식물, 병원균 및 환경과 같은 상호 작용하는 구성 요소를 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.
또한, 자연에서 DRR은 주로 작물 성장이 진행됨에 따라 토양 수분이 후퇴하는 비가 내린 병아리콩 재배 지역에서 발생합니다. 가뭄 스트레스는 DRR 질병에 병아리콩 식물을 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해는 병아리콩 세균성 수영장에서 엘리트 DRR 내성 품종의 식별을위한 길을 열 수 있습니다. 이 문서는 아픈 냄비와 후속 질병 분석의 준비를위한 단계별 방법론을 제공합니다. 전반적으로, 본 원에 제시된 정보는 연구원이 R. bataticola 곰팡이 무분큐럼을 준비하고, 이 병원체를 유지하고, 블로팅 종이 기술을 설정하고, 아픈 문화와 아픈 냄비를 준비하고, 병아리콩 식물에 있는 병원균 감염을 평가하는 것을 도울 것입니다.

이 연구는 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해를 촉진하기 위해 종이와 아픈 냄비 기술을 블로팅과 같은 기술을 입증하는 것을 목표로했습니다. 이를 위해 DRR 증상을 보이는 식물1,3,4는 병아리콩 밭에서 수집되었고, 곰팡이는 최면 팁 방법8을사용하여 분리되었다. R. bataticola 곰팡이 문화는 PDA 플레이트에 어두운 회색으로 나타나고 인큐베이션 후 4 일 동안 기울어진(도 1A &amp; C)및 인큐베이션 후 5 일 동안 PDB 배지에서 회색 색으로 어둡게 나타난다(도 1B). R. 바타티콜라는 미셀리아(도<stro...

이 연구는 병아리콩의 근간을 연구하는 방법론과 분자 메커니즘을 제시합니다–Rhizoctonia 바타티콜라 상호 작용. 상기 블로팅 종이 방법은 병아리콩 유전자형 반응을 빠르게 연구하는 데 유용하며, 아픈 냄비 기반 방법은 가뭄과 R. 바타티콜라 감염 및 내성 유전자형을 위한 화면을 동시에 부과하는 데 사용될 수 있다.

Dry root rot (DRR) disease is an emerging biotic stress threat to chickpea cultivation around the world. It is caused by a soil-borne fungal pathogen, ...

이 연구의 주요 목표는 종이 기술과 아픈 냄비 기술을 블로팅하는 것과 같은 건조 루트 부패 질환 소의 상세한 방법론을 입증하는 것입니다. 이러한 기술은 병아리콩 식물과 리조토니아 바타티콜라 사이의 상호 작용을 연구하는 데 도움이 될 것입니다. 곰팡이 병원균 Rhizoctonia 바타티콜라와 병아리 식물 상호 작용을 이해하는 것은 농업적으로 중요합니다.이를 위해서는 다재다능하고 재현 가능한 에세이가 필요합니다. 여기에서, 우리의 실험실에서 널리 사용되는 두 개의 assays가 입증됩니다. 그 중 하나는 종이 를 기반으로 얼룩지고, 다른 하나는 아픈 냄비 기반 분석이다.블로팅 페이퍼 분석법을 실행하려면 경사 배트리 컬쳐에서 페트리 플레이트로 확장한 다음 액체 문화로 확장하여 Rhizoctonia 바타티콜라 곰팡이 무접종을 준비하십시오. 병아리콩 보육원을 준비하여 큰 냄비에 씨앗을 파종하십시오. 그들을 뿌리 뽑고 액체 접종에 넣고 얼룩진 종이에 놓습니다.질병 증상, 즉 뿌리에 괴사, 뿌리 부패, 그리고 난간 황변 8 일 접종 후 8 일 관찰. 여기에 표시된 간단히 말해서, 종이 기술을 블로팅하는 단계입니다. 아픈 냄비 분석법을 실행하려면 곰팡이와 병아리 콩 식사를 접종하십시오.15일 동안 섭씨 30도에서 잠복한 후, 아픈 문화를 얻습니다. 그런 다음, 그들을 분말냄비 믹스와 혼합. 제어 냄비와 아픈 냄비에 씨앗을 뿌리.다음 날에는 파종 후 10일 후에, 뿌리, 뿌리 부패, 잎 황색등의 증상을 관찰한다. 아픈 냄비는 확장 될 수 있으며 대규모 검사에 사용할 수 있습니다. 여기에 아픈 냄비 기술의 단계의 간단히 한마디입니다.리조토니아 바타티콜라는 발달병원균입니다. 이 곰팡이는 식물 감염 중 1 차적인 inuclum 역할을하는 최면및 미세 경화증을 일으킵니다. isolative 방법을 통해 적용 하는 순수한 문화는 에세이에 사용 됩니다.이러한 성공적인 에세이의 핵심은 최적의 난교 부하입니다. 블로팅 용지 기술의 데모는 여기에서 시작됩니다. 액체 Rhizoctonia 바타티콜라 접종을 준비하기 위해, 3 일 된 신선한 접시 문화에서 곰팡이 한천 플러그와 500ml 국물을 접종하고 5 일 동안 28 섭씨에서 인큐베이터에 플라스크를 배양.미세한 회색 곰팡이 균증을 미세한 것으로 필터링합니다. 자동 으로 중단된 물에 일시 중단하고 미디어를 제거합니다. 다시, 미셀리아를 걸기하고 몇 분 동안 미셀리아를 건조 하여 수분을 제거합니다.잼 병에 자동 용수 200ml에 곰팡이 무분비 100 그램을 중단하고 제대로 섞습니다. 솔란트로 표면 살균 씨앗을 파종하여 병아리콩 보육을 개발합니다. 파종 후 8일 후에 식물을 뿌리 뽑고 씻어 내고 오토클레이브 RO로 헹구습니다. 얼룩이 있는 종이를 가지고 한 번 접고 그 절반을 트레이에 놓습니다.오토클레이브 물로 젖어 두십시오. 간헐적으로 위아래로 움직이면서 식물을 데리고 접종에 30초 간담하십시오. 뿌리가 시트 내부에 덮여 있고 Folia가 밖으로 유지되는 방식으로 식물을 놓습니다.나머지 절반을 접어서 용지를 구부립니다. 제어를 위해, 자동화 된 물에 식물을 찍어 8 일 동안 성장 챔버에 트레이를 유지합니다. 결과. 잎 황색, 뿌리 부패, 뿌리 괴사, 측면 루트 수의 감소와 같은 증상을 관찰한다.아픈 냄비 기술의 데모는 여기에서 시작됩니다. 상업용 병아리콩 씨앗 1킬로그램을 섭취하십시오. 씨앗을 수돗물로 씻고 RO 물로 다시 씻으십시오.씨앗을 5시간 동안 담그세요. 다시 말하지만, RO 물로 씨앗을 씻어 잼 병에 300 그램을 추가하십시오. 121 LVS에서 15분 동안 두 번 연속으로 오토클레이브를 사용해 보도록 합니다.냉각 후, 라미나르 흐름을 통해 병을 전송합니다. 3개의 곰팡이 향이 나는 천으로 병을 접종하고 약 4mm 평방 사이즈를 연결하고 잘 흔들어 제대로 섞습니다. 병을 감싸고 인큐베이터에서 15일 동안 섭씨 30도에서 인큐베이터에 인큐베이션을 넣습니다.병아리콩 씨앗 주위에 어두운 균사 성장병을 관찰하고 씨앗을 제거합니다. 실온에서 건조하고 분말. 리조토니아 바타티콜라 파우더를 솔로라이트와 섞어 5일 동안 실온에서 보관하십시오.표면은 GT62 씨앗을 살균하고 2 센티미터 깊이로 뿌리세요. 결과. 아픈 냄비에 있는 90%의 사망률을 관찰하십시오. 파종 후 10일, 뿌리의 괴사 등의 증상을 관찰하고, 다음 날에는 횡근수와 잎황의 감소를 관찰한다.아픈 냄비는 뿐만 아니라 필드 토양에서 제조 될 수있다. 가뭄과 리조토니아 바타티콜라 감염. 물을 원천징수하여 아픈 냄비에 가뭄 스트레스를 부과합니다.여기에 제어, 가뭄, 병원균, 그리고 동시 가뭄과 병원균 스트레스를 받는 식물이 여기에 표시됩니다. 증상, 즉, 더 많은 괴사, 루트 부패, 및 측면 루트 수의 감소, 및 병원체 전용 치료에 비해 결합 된 스트레스 치료의 루트 길이를 관찰한다. 결론. 블로팅 용지 기술은 시험관 내 조건에서 수행 될 수있다.아픈 냄비 기술은 생체 내 조건에서 실행될 수 있습니다. 아픈 포트에서, abiotic 긴장, 즉, 가뭄 스트레스는 병원체 감염과 함께 부과 될 수 있습니다. 이러한 기술을 사용하여 병원균 감염 패턴을 연구할 수 있습니다.생리학적 변화의 대부분은 병아리콩-Rhizoctonia 바타티콜라 상호 작용 중에 발생하며, 또한 저항을 위한 병아리콩 유전자형을 검사합니다. 얼룩종이 분석법은 현미경 검사법과 분자 생물학 연구를 위한 질 견본을 생성하는 데 아주 유용합니다. 자연적인 감염 조건을 모방하는 아픈 냄비 분석은 병아리콩 세균을 선별하는 데 적용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

병원체 성장의 정량화는 다양한 애기장대(Arabidopsis) 탈리아나(Arabidopsis) 면역 반응을 특성화하는 강력한 도구입니다. 여기에 설명된 방법은 Pseudomonas syringae pv를 정량화하기 위해 최적화된 주사기 침투 분석을 제공합니다. 마쿨리콜라 성체 애기장대에서 ES4326 성장.

을 사용해서 식물 방어 응답의 미세 특성에 대한 세균성 잎 침투 분석<em&gt; 애기 장대-슈도모나스 시린 개 (Pseudomonas syringae)</em&gt; Pathosystem

결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다.  여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

기술 된 수경 공동 배양 시스템은 금속 메쉬 스크린이있는 온전한 식물을지지하고 박테리아와 함께 배양한다. 식물 조직, 박테리아 및 분비 된 분자는 하류 분석을 위해 따로 따로 수확 할 수 있으며 동시에 식물 숙주와 상호 작용하는 미생물 또는 미생물의 분자 반응을 조사 할 수 있습니다.

식물 / 미생물 분자 상호 작용 및 신호의 동시 및 체계적 분석을위한 수경 공동 공동 배양 시스템

제시는 특정 퇴 비 포함 박테리아와 균 류 Rhizoctonia solani의 성장을 억제 하는 것 인지를 식별 하는 접시 경쟁 분석 결과 대 한 프로토콜.

질병 억제의 빠른 예비 평가로 격판덮개 경쟁 분석 결과

수박의 Fusarium wilt를 관리하려면 존재하는 병원균 종족에 대한 지식이 필요합니다. 여기에서, 우리는 병원성 균류 Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon)의 인종 타이핑에서 그들의 효능을 입증하기 위해 뿌리 딥, 감염된 커널 시딩, 및 변형된 트레이-딥 접종 방법을 설명한다.

알려지지 않은 Fusarium oxysporum f.sp.의 인종을 결정하는 데 사용되는 세 가지 접종 기술의 대조. 니벳 격리

이 프로토콜은 식물 뿌리에 토양 매개 미생물을 접종하는 전략에 대한 자세한 요약을 제공합니다. 진균 Verticillium longisporum 및 Verticillium dahliae에 대해 예시된 세 가지 상이한 뿌리 감염 시스템이 기술된다. 잠재적 응용 분야와 가능한 다운스트림 분석이 강조되고 각 시스템에 대한 장단점이 논의됩니다.

식물 뿌리를 토양 매개 미생물로 감염시키는 접종 전략

우리는 간단한 실험실 도구를 사용하여 Arabidopsis 및 Medicago의 루트 시스템 아키텍처 (RSA)를 검사합니다. 묘목은 메쉬 위에 수경 재배되고 아트 브러시를 사용하여 RSA를 드러냅니다. 스캐닝 또는 고해상도 카메라를 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 분석하여 특성을 매핑합니다.

플랜트 루트 시스템 아키텍처 특성을 매핑하기 위한 간단한 프로토콜

이 논문은 기공 발달을 제어하는 유전자를 특성화하기 위해 표피 껍질을 사용하지 않는 두 가지 표현형 방법을 설명합니다. 첫 번째 방법은 톨루이딘 블루 O-염색 식물 표피를 사용하여 기공 표현형을 분석하는 방법을 보여줍니다. 두 번째 방법은 기공 리간드를 식별하고 생물학적 활성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

표피 표현형 점수를 통한 기공 발달에 관여하는 유전자 식별

여기에서는 애기장대 묘목 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소 생합성 모니터링을 위해 설계된 고급 도구에 대해 설명합니다. 이 새로운 방법론은 높은 공간 및 시간 분해능에서 비침습적 실시간 엽록소 형광 이미징을 제공합니다.

애기장대 탈에티올화의 초기 단계 동안 엽록소 생합성 역학 측정을 위한 비침습적 분석

역방향 유전자 접근 방법은 모기에 벡터 병원균하는 유전자 underly 저항을 결정하는 매우 유용하게 입증했습니다. 이 비디오 프로토콜은 말라리아 기생충을 항구 아노 펠 레스 모기 gambiae로 dsRNA를 주입하기 위해 Dimo​​poulos 연구실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. 사출 설정을 조작하고 흉부에 dsRNA를 주입 기술은 그림이다.

성인 모기 (A. gambiae)에서 RNAi의 Assays을위한 프로토콜

학습하세요 병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 방법론을. 블로팅 페이퍼 기법과 식 팟 기법을 사용하여 Rhizoctonia bataticola와의 상호작용을 연구하고, 병원균 내성이 있는 품종을 선별하는 데 활용할 수 있습니다.

병아리콩에서 건조 루트 썩은 질병 에세이 : 상세한 방법론

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