4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

이 프로토콜은 개별 셀에서 3개의 공간 차원에서 FRET 또는 순환 AMP 신호를 측정하고 시각화하는 방법을 제공한다는 점에서 중요합니다. 순환 AMP 분포는 측면뿐만 아니라 축 방향으로도 발생할 수 있으며, 이러한 분포를 샘플링하려면 FRET 순환 AMP 이미지 데이터를 3차원으로 획득하는 것이 중요합니다. 이미징 당일, 따뜻한 Tyrodes는 수조에서 섭씨 37도까지 버퍼링하고 관심 세포가 있는 커버 슬립을 세포실에 장착합니다.

누출을 방지하기 위해 장착 개스킷으로 챔버 상단을 고정하고 섬세한 작업 와이퍼를 사용하여 커버 슬립 하단에서 과도한 매체 또는 접착 셀을 제거합니다. 800마이크로리터의 작동 완충액과 4마이크로리터의 5밀리몰 핵 라벨을 셀 챔버에 추가하고 5-10초 동안 챔버를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 배양하기 위해 알루미늄 호일로 셀 챔버를 덮습니다.

세포를 이미지화하려면 분광 검출기가 장착된 컨포칼 현미경에서 60X Water Immersion Objective를 선택하고 대물렌즈에 물 한 방울을 추가합니다. 로드된 세포 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 필터 손잡이를 조정하여 적절한 필터 세트를 선택합니다. 형광 광시야 모드를 선택하고 접안렌즈를 사용하여 FRET 순환 AMP 센서를 발현하는 세포가 포함된 시야를 선택합니다.

이미징 소프트웨어를 열고 컨포칼 모드를 선택한 다음 레이저 인터록 버튼을 잠금 해제합니다. A1 설정 메뉴를 엽니다. 405 및 561 나노미터 레이저 라인에 해당하는 상자를 선택하고 이러한 스펙트럼 감지를 SD로, 해상도를 10으로, 채널을 32로 설정합니다.

시작 및 끝 파장 값을 선택하여 파장 범위를 설정합니다. A1 설정 메뉴를 열어 비닝 건너뛰기 아이콘을 선택합니다. 숫자 15 상자를 선택하고 확인을 클릭합니다. 레이저 강도를 405 나노미터 레이저의 경우 8%로, 561 나노미터 레이저의 경우 2%로 설정합니다.

검출기 게인을 149로 설정하고 핀홀 반경을 2.4 Airy 디스크 유닛으로 설정합니다. 스캔 속도를 초당 25 스펙트럼 프레임으로 설정하고 단방향 스캔 방향을 선택합니다. 개수를 4로 설정하고 스캔 크기를 1024 x 1024로 설정합니다.

z-stack 수집 매개변수를 정의하려면 보기, 수집 제어 및 ND 수집을 클릭하고 팝업 창에 파일 대상과 이름을 입력하여 ND 파일을 저장합니다. z-시리즈 상자를 클릭하고 A1 Plus 설정 창에서 라이브를 클릭하여 라이브 보기 창을 엽니다. 초점 노브를 조정하여 사전을 보는 동안 셀에 초점을 맞춥니다.view 창.

현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 상단을 선택하고 ND 획득 창에서 상단을 클릭하여 현재 위치를 상단으로 설정합니다. 현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 하단을 선택하고 하단을 클릭하여 현재 위치를 하단으로 설정합니다. 단계 크기로 1마이크로미터를 입력합니다.

z-스캔 방향에 대해 Top Bottom을 선택하고 실행을 클릭하여 z-스택을 획득합니다. z-stack 획득이 완료되면 피펫을 사용하여 세포를 방해하지 않고 관심 시약을 챔버에 부드럽게 첨가합니다. 10분 후 파일 이름을 변경하고 두 번째 z-stack 이미지를 가져옵니다.

이미징 후 스펙트럼 z-stack 영상과 파일 이름이 동일한 새 폴더를 만들고 관심 있는 스펙트럼 영상 파일을 엽니다. 파일, 가져오기/내보내기 및 ND 문서 내보내기를 클릭합니다. 팝업 창에서 새로 생성된 폴더, 파일 형식은 TIFF, 각 채널은 모노 이미지, 비트 심도 유지를 선택합니다.

내보내기를 클릭하여 개별 파일을 폴더로 내보내고 선형 스펙트럼 불혼화 소프트웨어를 엽니다. 선형 혼화 해제를 엽니다. m 파일을 열고 실행을 클릭합니다.

내보낸 TIFF 파일 시퀀스가 포함된 폴더를 찾아 선택하고 확인을 클릭하여 파장 및 z-슬라이스 창을 엽니다. 폴더에서 z-슬라이스 및 채널 번호가 없는 첫 번째 파일의 파일 이름을 복사하여 이미지 이름 입력 상자의 첫 번째 단계에 붙여넣고, 파장 대역 수 입력 상자에 채널 수를 입력하고, Z 슬라이스 수 입력 상자에 z-슬라이스 수를 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 팝업 창에서 Wavelength를 찾아 선택합니다. mat 파일을 열고 열기를 클릭합니다.

새 팝업 창에서 Library. mat 파일을 찾아 선택하고 Open을 다시 클릭하여 슬라이스 혼합 해제를 시작합니다. FRET 효율을 계산하려면 multiFRRCF를 엽니다.

m 프로그래밍 스크립트를 입력하고 다시 슬라이스할 폴더 수 상자에 분석할 실험 시도 수를 입력합니다. 확인을 클릭합니다. 혼합되지 않은 폴더를 찾아 선택하고 확인을 다시 클릭합니다. 새 팝업 창에서 배율 계수를 12.4로, 임계값을 56으로, X, Y 및 Z 주파수를 각각 5, 5, 1로, 평활 알고리즘을 가우스로 설정합니다.

그런 다음 실행을 클릭하여 FRET 측정 및 분할을 수행합니다. FRET 효율을 순환 AMP 레벨에 매핑하려면 Mapping_FRET 엽니다. Efficiency_to_cAMP_concentration. m 파일을 열고 실행을 클릭합니다.

첫 번째 회색 음영 FRET 이미지로 이동하여 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 FRET 순환 AMP 이미지를 열어 순환 AMP 신호의 분포를 3차원으로 검사합니다. 이 이미지에서는 베이스라인에서 그리고 포스콜린 처리 10분 후 컨포칼 현미경을 사용하여 획득한 거짓 착색된 원시 초분광 이미지 데이터의 3차원 보기를 관찰할 수 있습니다. 이 분석에서 수용체 형광단은 완전히 광파괴되어 일대일 화학량론을 통해 공여체와 수용체의 스펙트럼 서명을 얻을 수 있었습니다.

핵 염료로 표지된 형질주입되지 않은 세포를 사용하여 염료 형광단의 순수한 스펙트럼을 얻었습니다. donor, acceptor 및 nuclear dye fluorophores의 스펙트럼을 결합하면 3가지 구성 요소 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 여기에서 세 가지 배경 스펙트럼 시그니처의 소스를 관찰할 수 있습니다.

이러한 신호는 샘플 내에서 불균일하게 분포되어 있어 간단히 빼낼 수 없지만, 이러한 신호의 스펙트럼 시그니처를 스펙트럼 라이브러리에 추가하고 선형 불혼화를 사용하여 신호를 분리하면 FRET 효율을 계산하기 전에 도너 신호와 수용체 신호에서 이러한 교란 신호를 제거할 수 있습니다. 그런 다음 6개 구성 요소 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 축 이미지의 각 슬라이스에 대해 선형 스펙트럼 불혼화를 수행할 수 있습니다. 여기서, 서로 다른 XY 평면 슬라이스에서 FRET 효율 및 주기적 AMP 수준의 변화를 관찰할 수 있어 포스콜린 처리 10분 후 기준선 조건과 조건을 비교할 수 있습니다.

이 기술은 또한 세포와 조직 모두에서 3차원으로 다른 리포터의 FRET 효율성을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.