Name: 4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 학습하세요 4차원 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포를 측정하는 방법을. 공초점 현미경과 선형 스펙트럼 언믹싱 기술을 활용하여 세포 내 신호전달 경로를 고해상도로 연구할 수 있습니다.

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저자는 H188 cAMP FRET 바이오 센서와 케니 트린 (사우스 앨라배마 대학)을 제공하는 데 도움이 우리의 사용자 정의 개발 프로그래밍 스크립트를 실행하는 데 걸린 시간을 줄이기 위해 우리에게 제공하는 박사 Kees Jalink (네덜란드 암 연구소 및 고급 현미경 검사법을위한 반 Leeuwenhoek 센터) 인정하고 싶습니다.
저자는 자금 출처를 인정하고 싶습니다: 미국 심장 협회 (16PRE2713004), 국립 과학 재단; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL0666299).

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리프슬리 박사와 리치 박사는 스펙트럼 이미징 기술을 상용화하기 위해 설립된 스타트업 회사인 SpectraCyte, LLC에 대한 재정적 관심을 공개합니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 SPECtraCyte, LLC와 관련이 없는 상업적으로 이용 가능한 제품을 사용하여 수행되었습니다.

FRET 바이오센서의 개발은 단일 세포에서 순환 뉴클레오티드 신호의 측정 및 시각화를 허용하고, 세포 외 신호 이벤트13,22,37,38을시각화하기위한 큰 약속이있다. 그러나 FRET 바이오 센서의 사용은 많은 형광 단백질 계 FRET 리포터의 낮은 신호-잡음 특성 및 FRET 기자의 약한 트랜스퍼션 또는 발현 효율을 포함하여 몇 가지한계를제시한다(이는 PMVEC와 같은 특정 세포주에서 특히 어려울 수 있음)23,24. 약하게 발현된 형광 단백질의 이미징은 비메트릭 FRET 계산과 결합되어 종종 계산된 FRET 효율에서 높은 수준의 불확실성 또는 변동을 초래합니다. FRET 측정의 신뢰성을 향상시키...

순환 아데노신 모노인산염(cAMP)은 세포 분열, 칼슘 유입, 유전자 전사 및 신호 변환을 포함한 주요 세포 및 생리적 과정에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 증거의 성장 몸은 신호 특이성을 달성하는 세포를 통해 cAMP 구획의 존재를 제안1,2,3,4,5,6,7. 최근까지, cAMP 구획화는 다른 G-결합 수용체작용제에의해 유도된 뚜렷한 생리적 또는 세포 효과에 기초하여 유추되었다8,9,10,11. 최근에는 FRET 기반 형광 이미징 프로브가 세포12,13,14에서cAMP 신호를 직접 측정 및 관찰하기 위한 새로운접근법을제공하고 있다.
Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 분자가15,16에근접할 때 비방사적 방식으로 기증자와 수용자 분자 간에 에너지 전달이 발생하는 물리적 현상이다. FRET 기반 형광 지표의 발달과 함께, 이러한 물리적 현상은 단백질-단백질 상호 작용17,단백질 공동 국소화18,Ca+2 신호19,유전자 발현20,세포 부문21 및 순환 뉴클레오티드 신호화를 연구하기 위해 생물학적 응용 분야에서 사용되었습니다. FRET 기반 cAMP 지표는 일반적으로 cAMP 결합 도메인, 기증자 불소 호및 수용자불소호레(22)로구성됩니다. 예를 들어, 이 방법론에 사용되는 H188 cAMP센서(12)22는 에팍으로부터 얻은 cAMP 결합 도메인으로 구성되며, 청록색(기증자)과 금성(수용자) 형광 사이에 끼어 있다. 기저 조건(언바운드)에서 청록색과 금성은 형광류 사이에 FRET가 발생하는 방향으로 있습니다. 바인딩 도메인에 대한 cAMP의 바인딩시, 청록색과 금성이 떨어져 이동하도록 형성 변화가 발생하여 FRET가 감소합니다.
FRET 기반 이미징 접근 방식은 셀 내에서 cAMP 신호를 조사하고 시각화하기 위한 유망한 도구를 제공합니다. 그러나, 현재 FRET 기반 현미경 이미징 기술은 종종 세포 전 세포 공간 선명도로 FRET를 측정하기에 충분한 신호 강도를 달성하는 데 부분적으로만 성공적입니다. 이는 많은 FRET 기자의 제한된 신호 강도, FRET 효율의 변화를 정확하게 정량화하는 데 필요한 높은 수준의 정밀도, 세포 자동불화(23)및24와같은 혼란스러운 요인의 존재를 포함한 여러 가지 요인에 기인한다. 결과는 종종 약한 SNR에 의해 괴롭히는 FRET 이미지, FRET에 있는 세포 극변경의 시각화를 아주 어렵게 만듭니다. 또한, 공간적으로 국소화된 cAMP 신호에 대한 조사는 거의 2개의 공간 차원에서만 거의 독점적으로 수행되었으며 축 cAMP 분포는거의 25로간주되지 않습니다. 이는 SNR이 cAMP 그라데이션을 세 가지 공간 차원으로 측정하고 시각화하는 기능을 방해했기 때문일 수 있습니다. 낮은 SNR을 가진 FRET 센서를 사용하는 한계를 극복하기 위하여는, 우리는 단하나세포25,26,27에서FRET를 측정하기 위하여 하이퍼 스펙트럼 화상 진찰 및 분석 접근법을 구현했습니다.
하이퍼스펙트럼 이미징 접근법은 NASA가 위성 이미지28,29에존재하는 지상파 물체를 차별화하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 이후 형광 현미경 필드(30)로번역되었으며, 스펙트럼 검출기를 제공하는 여러 상용 공초점 현미경 시스템이 있습니다. 기존의 (비 스펙트럼) 형광 이미징에서, 샘플은 밴드 패스 필터 또는 레이저 라인을 사용하여 흥분하고, 방출은 종종 형광의 피크 방출 파장에 맞게 선택된 제2 밴드 패스 필터를 사용하여 수집된다. 대조적으로, hyperspectral 화상 진찰 접근은 특정 파장 간격에 형광 방출26,31,32 또는 여기33,34의 완전한 스펙트럼 단면도를 샘플링하는 것을 추구합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 Hyperspectral 화상 진찰 및 분석 접근이 전통적인 필터 기지를 둔 FRET 화상 진찰 기술(26)에비교될 때 세포에 있는 FRET 신호의 향상한 정량화를 제공할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기서는 4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 수행하여 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정하고 시각화하는 방법론을 제시합니다. 이러한 접근법은 단일세포(25)에서작용제 유도 된 cAMP 공간 그라데이션의 시각화를 허용하였다. 흥미롭게도, 고뇌에 따라, cAMP 그라데이션은 세포에서 명백할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법론은 FRET 측정의 정확도를 향상시키기 위해 비 균일한 배경 및 세포 자동 형광의 스펙트럼 미혼을 사용합니다. 이 방법론은 cAMP FRET 바이오 센서를 사용하여 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 입증되지만, 방법론은 대체 FRET 기자 또는 대체 세포주와 함께 사용하기 위해 쉽게 수정 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Attofluor Cell Chamber</td><td>Invitrogen</td><td>A7816</td><td>Attofluor에는 강철 셀 챔버와 고무 O-링이 포함되어 있습니다. 세포 챔버는 커버 슬립을 잡고 O- 링은 누출없이 세포실에 완충액을 보유하는 잠금 메커니즘을 제공합니다</td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 (DMSO)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td>용매는 원액 포스콜린을 제조하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DRAQ5 형광 프로브 용액</td><td>Thermo Scientific</td><td>62252</td><td>핵 라벨</td></tr><tr><td>Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>배양 접시에서 세포가 성장하고 분열하는 데 필요한 영양소와 성장 인자가 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>배</td>양 배지에 첨가되는 Sigma <td>F6178</td><td>성장 인자 공급, DMEM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F3917</td><td>Adenyly cyclase 활성제.</td></tr><tr><td>H188 Cyclic AMP FRET 바이오센서</td><td>Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink</td><td>Gift</td><td>Plasmid 인코딩 청록색(공여체 형광단), 금성(수용체 형광단) 및 Epac에서 얻은 결합 도메인.</td></tr><tr><td>Image J</td><td>image.net</td><td>무료 다운로드</td><td>스펙트럼 정보 및 이미지 처리를 제거하는 데 사용되는 또 다른 이미지 처리 플랫폼입니다.</td></tr><tr><td>Integrating Sphere</td><td>Ocean Optics</td><td>FOIS-1</td><td>다양한 레이저 강도(?)에서 레이저 라인의 조명 강도를 측정하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Laminin Mouse Protein, Natural</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>커버슬립은 라미닌으로 코팅되어 있어 세포 부착, 성장 및 세포의 운동성에 도움을 줍니다.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L3000-015</td><td>H188 FRET 바이오센서로 세포를 transfection하는 데 사용되는 Transfection 시약</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2019a</td><td>이미지 처리 작업(선형 불혼합 및 FRET 효율 계산)은 MATLAB 프로그래밍 환경에서 사용자 지정 프로그램을 작성하여 수행됩니다</td></tr><tr><td>. Nikon A1R 컨포칼 현미경</td><td>Nikon Instruments</td><td>Nikon A1R</td><td>스펙트럼 이미지 획득은 컨포칼 현미경을 사용하여 수행됩니다.</td></tr><tr><td>Nikon Elements Software</td><td>Nikon Instruments</td><td>Software 동글</td>, <td>Nikon A1R</td></tr><tr><td>NIST-Traceable Calibration Lamp</td><td>Ocean Optics</td><td>LS-1-CAL-INT</td><td>표준</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>coomonly 사용 버퍼 suring 세포 배양</td></tr><tr><td>폐 미세혈관 내피 세포(PMVEC)</td><td>사내 - 세포 배양 코어, 사우스 앨라배마 대학교</td><td>쥐 폐 미세혈관 구조에서 분리</td>된 <td>PMVEC는 혈관의 내벽을 형성합니다.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>항생제를 배양 메덤에 첨가하여 세포의 오염을 방지합니다.</td></tr><tr><td>사전 세척된 골드 씰 마이크로 슬라이드</td><td>Clay Adams</td><td>3010</td><td>세포 고정에 사용되는 현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mounting Media</td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>샘플이 퇴색 방지 마운트를 사용하여 고정되면 나중에 형광 염료와 발색단이 퇴색되지 않도록 보호합니다.</td></tr><tr><td>Spectrometer</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65000</td><td>광원의 스펙트럼 응답을 측정하는 데 사용됩니다(?)</td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td>은 <td>세포와 세포 매트릭스 사이의 단백질-단백질 결합을 소화하고 세포 도금 중에 세포를 분리하고 들어 올리는 데 도움을 줍니다.</td></tr><tr><td>Tyrodes Buffer</td><td>Made in-house</td><td>Made</td><td>Tyrodes buffer는 작업 용액을 만들고 이미지 획득 중에 수용액의 세포를 유지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Corning</td><td>3506</td><td>라미닌 코팅 커버슬립을 6웰 배양 접시(1개의 커버리스프/웰)에 넣습니다. 배지와 함께 세포가 각 웰에 추가됩니다.</td></tr><tr><td>25mm 원형 현미경 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545102</td><td>세포는 원형 유리 커버 슬립,</td></tr><tr><td>60X Ojective</td><td>Nikon Instruments</td><td>Plan Apo VC 60X/1.2 WI &infin;/0.15-0.18 WD 0.27</td><td>수침 및 일반적으로 사용되는 세포 대물렌즈</td></tr>에서 성장했습니다</tbody></table>.

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 fret 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 camp 분포 측정

Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and &lambda;) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis

순환 AMP는 세포 및 생리 활동의 넓은 범위에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 몇몇 연구 결과는 cAMP 신호가 구획화되고, 그 구획화가 cAMP 신호 통로 내의 신호 특이성에 기여한다는 것을 건의합니다. F렌스터 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오 센서의 개발은 세포내 cAMP 신호를 측정하고 시각화하는 능력을 발전시켰습니다. 그러나 이러한 측정은 종종 두 개의 공간 차원으로 제한되어 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다. 현재까지, 본질적으로 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 나타내는 FRET 센서를 사용하는 기술적 한계로 인해 3개의 공간 차원(x, y 및 z)으로 cAMP 신호의 측정이 매우 제한적이었습니다. 또한, 전통적인 필터 기반 이미징 접근법은 스펙트럼 크로스토크, 제한된 신호 강도 및 자동 형광을 포함한 다양한 요인으로 인해 국소화 된 세포 이형 지역에서 cAMP 신호를 정확하게 측정하는 데 효과가 없습니다. 이러한 한계를 극복하고 FRET 기반 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 기반 의 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 효율을 계산하기 위한 스펙트럼 특이성 및 추가 형광 라벨에서 접건 성 자동 형광 및/또는 신호를 반사적으로 분리하는 기능을 제공하는 하이퍼 스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 접근 방식을 개발했습니다. 여기서는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징을 구현하기 위한 방법론과 스펙트럼 미혼을 수행하기 위해 샘플링되거나 과샘플링되지 않은 적절한 스펙트럼 라이브러리를 구성할 필요성을 제시합니다. 우리는 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 3 차원 cAMP 분포의 측정을위한이 방법론을 제시하는 동안,이 방법론은 세포 유형의 범위에서 cAMP의 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 3개의 공간 차원에서 cAMP 그라데이션을 측정하기 위하여 hyperspectral FRET 화상 진찰 및 분석 접근의 사용을 기술합니다. 이러한 결과를 생성하는 데 관련된 몇 가지 주요 단계가 있으며, 데이터를 분석하고 정량화하는 동안 주의 깊게 주의를 기울여야 합니다. 이러한 주요 단계에는 적절한 스펙트럼 라이브러리 구성, 백그라운드 스펙트럼 해제, 셀 테두리 식별을 위한 임계값 지정 및 FRET 효율성 계산이 포함됩니다. 도 1은 살아있는 세포의 FRET 효율 및 cAMP 수준을 측정하는 데 관련된 모든 단계의 회로도 흐름을 보여줍니다. 이러한 이미징 및 분석 단계를 사용하면 FRET 효율을 측정하고 셀의 3차원의 cAMP 공간 그라데이션을 측정하는 동시에 균일하지 않은 배경 신호를 고려할 수 있습니다.
도 2는 기준조건(그림 2A)...

Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

Cyclic AMP is a second messenger that is involved in a wide range of cellular and physiological activities. Several studies suggest that cAMP signals are ...

이 프로토콜은 개별 셀에서 3개의 공간 차원에서 FRET 또는 순환 AMP 신호를 측정하고 시각화하는 방법을 제공한다는 점에서 중요합니다. 순환 AMP 분포는 측면뿐만 아니라 축 방향으로도 발생할 수 있으며, 이러한 분포를 샘플링하려면 FRET 순환 AMP 이미지 데이터를 3차원으로 획득하는 것이 중요합니다. 이미징 당일, 따뜻한 Tyrodes는 수조에서 섭씨 37도까지 버퍼링하고 관심 세포가 있는 커버 슬립을 세포실에 장착합니다.누출을 방지하기 위해 장착 개스킷으로 챔버 상단을 고정하고 섬세한 작업 와이퍼를 사용하여 커버 슬립 하단에서 과도한 매체 또는 접착 셀을 제거합니다. 800마이크로리터의 작동 완충액과 4마이크로리터의 5밀리몰 핵 라벨을 셀 챔버에 추가하고 5-10초 동안 챔버를 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 실온에서 10분 동안 배양하기 위해 알루미늄 호일로 셀 챔버를 덮습니다.세포를 이미지화하려면 분광 검출기가 장착된 컨포칼 현미경에서 60X Water Immersion Objective를 선택하고 대물렌즈에 물 한 방울을 추가합니다. 로드된 세포 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 필터 손잡이를 조정하여 적절한 필터 세트를 선택합니다. 형광 광시야 모드를 선택하고 접안렌즈를 사용하여 FRET 순환 AMP 센서를 발현하는 세포가 포함된 시야를 선택합니다.이미징 소프트웨어를 열고 컨포칼 모드를 선택한 다음 레이저 인터록 버튼을 잠금 해제합니다. A1 설정 메뉴를 엽니다. 405 및 561 나노미터 레이저 라인에 해당하는 상자를 선택하고 이러한 스펙트럼 감지를 SD로, 해상도를 10으로, 채널을 32로 설정합니다.시작 및 끝 파장 값을 선택하여 파장 범위를 설정합니다. A1 설정 메뉴를 열어 비닝 건너뛰기 아이콘을 선택합니다. 숫자 15 상자를 선택하고 확인을 클릭합니다. 레이저 강도를 405 나노미터 레이저의 경우 8%로, 561 나노미터 레이저의 경우 2%로 설정합니다.검출기 게인을 149로 설정하고 핀홀 반경을 2.4 Airy 디스크 유닛으로 설정합니다. 스캔 속도를 초당 25 스펙트럼 프레임으로 설정하고 단방향 스캔 방향을 선택합니다. 개수를 4로 설정하고 스캔 크기를 1024 x 1024로 설정합니다.z-stack 수집 매개변수를 정의하려면 보기, 수집 제어 및 ND 수집을 클릭하고 팝업 창에 파일 대상과 이름을 입력하여 ND 파일을 저장합니다. z-시리즈 상자를 클릭하고 A1 Plus 설정 창에서 라이브를 클릭하여 라이브 보기 창을 엽니다. 초점 노브를 조정하여 사전을 보는 동안 셀에 초점을 맞춥니다.view 창.현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 상단을 선택하고 ND 획득 창에서 상단을 클릭하여 현재 위치를 상단으로 설정합니다. 현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 하단을 선택하고 하단을 클릭하여 현재 위치를 하단으로 설정합니다. 단계 크기로 1마이크로미터를 입력합니다.z-스캔 방향에 대해 Top Bottom을 선택하고 실행을 클릭하여 z-스택을 획득합니다. z-stack 획득이 완료되면 피펫을 사용하여 세포를 방해하지 않고 관심 시약을 챔버에 부드럽게 첨가합니다. 10분 후 파일 이름을 변경하고 두 번째 z-stack 이미지를 가져옵니다.이미징 후 스펙트럼 z-stack 영상과 파일 이름이 동일한 새 폴더를 만들고 관심 있는 스펙트럼 영상 파일을 엽니다. 파일, 가져오기/내보내기 및 ND 문서 내보내기를 클릭합니다. 팝업 창에서 새로 생성된 폴더, 파일 형식은 TIFF, 각 채널은 모노 이미지, 비트 심도 유지를 선택합니다.내보내기를 클릭하여 개별 파일을 폴더로 내보내고 선형 스펙트럼 불혼화 소프트웨어를 엽니다. 선형 혼화 해제를 엽니다. m 파일을 열고 실행을 클릭합니다.내보낸 TIFF 파일 시퀀스가 포함된 폴더를 찾아 선택하고 확인을 클릭하여 파장 및 z-슬라이스 창을 엽니다. 폴더에서 z-슬라이스 및 채널 번호가 없는 첫 번째 파일의 파일 이름을 복사하여 이미지 이름 입력 상자의 첫 번째 단계에 붙여넣고, 파장 대역 수 입력 상자에 채널 수를 입력하고, Z 슬라이스 수 입력 상자에 z-슬라이스 수를 입력한 다음 확인을 클릭합니다. 그런 다음 팝업 창에서 Wavelength를 찾아 선택합니다. mat 파일을 열고 열기를 클릭합니다.새 팝업 창에서 Library. mat 파일을 찾아 선택하고 Open을 다시 클릭하여 슬라이스 혼합 해제를 시작합니다. FRET 효율을 계산하려면 multiFRRCF를 엽니다.m 프로그래밍 스크립트를 입력하고 다시 슬라이스할 폴더 수 상자에 분석할 실험 시도 수를 입력합니다. 확인을 클릭합니다. 혼합되지 않은 폴더를 찾아 선택하고 확인을 다시 클릭합니다. 새 팝업 창에서 배율 계수를 12.4로, 임계값을 56으로, X, Y 및 Z 주파수를 각각 5, 5, 1로, 평활 알고리즘을 가우스로 설정합니다.그런 다음 실행을 클릭하여 FRET 측정 및 분할을 수행합니다. FRET 효율을 순환 AMP 레벨에 매핑하려면 Mapping_FRET 엽니다. Efficiency_to_cAMP_concentration. m 파일을 열고 실행을 클릭합니다.첫 번째 회색 음영 FRET 이미지로 이동하여 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 FRET 순환 AMP 이미지를 열어 순환 AMP 신호의 분포를 3차원으로 검사합니다. 이 이미지에서는 베이스라인에서 그리고 포스콜린 처리 10분 후 컨포칼 현미경을 사용하여 획득한 거짓 착색된 원시 초분광 이미지 데이터의 3차원 보기를 관찰할 수 있습니다. 이 분석에서 수용체 형광단은 완전히 광파괴되어 일대일 화학량론을 통해 공여체와 수용체의 스펙트럼 서명을 얻을 수 있었습니다.핵 염료로 표지된 형질주입되지 않은 세포를 사용하여 염료 형광단의 순수한 스펙트럼을 얻었습니다. donor, acceptor 및 nuclear dye fluorophores의 스펙트럼을 결합하면 3가지 구성 요소 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 여기에서 세 가지 배경 스펙트럼 시그니처의 소스를 관찰할 수 있습니다.이러한 신호는 샘플 내에서 불균일하게 분포되어 있어 간단히 빼낼 수 없지만, 이러한 신호의 스펙트럼 시그니처를 스펙트럼 라이브러리에 추가하고 선형 불혼화를 사용하여 신호를 분리하면 FRET 효율을 계산하기 전에 도너 신호와 수용체 신호에서 이러한 교란 신호를 제거할 수 있습니다. 그런 다음 6개 구성 요소 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 축 이미지의 각 슬라이스에 대해 선형 스펙트럼 불혼화를 수행할 수 있습니다. 여기서, 서로 다른 XY 평면 슬라이스에서 FRET 효율 및 주기적 AMP 수준의 변화를 관찰할 수 있어 포스콜린 처리 10분 후 기준선 조건과 조건을 비교할 수 있습니다.이 기술은 또한 세포와 조직 모두에서 3차원으로 다른 리포터의 FRET 효율성을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 단일 세포의 세 차원 공 촛점 형광에서 가져 정의되지 않은 형태의 형태학의 변화를 측정하기 Imaris 신경 과학, ImarisXT 및 MATLAB을 사용하는 소프트웨어 플랫폼을 개발했습니다. 이 새로운 접근 방식은 수용체 활성화에 따라 세포 모양의 변화를 수량화하는 데 사용되므로 약물 발견을위한 가능한 추가 도구를 나타냅니다 할 수 있습니다.

3 차원 형광 이미지에서 세포 형태학의 변경 사항 단정 지을 분석 도구

단일 분자 추적과 함께 Photoactivated 현지화 현미경 (PALM)은 허용 라이브 대장균 세포에서 단백질-DNA 상호 작용의 직접 관찰 및 정량화.

Photoactivated 단일 분자 추적을 사용하여 라이브 박테리아 세포에있는 단백질-DNA 상호 작용을 시각화

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라벨-무료 3 차원 양적 위상 이미징 사용 하 여 림프 구의 식별 및 기계 학습

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여기에서는 MIP-FISH(mid-infrared photothermal-FISH)라고도 하는 광학 광열 적외선 형광 in situ hybridization(OPTIR-FISH)을 사용하여 개별 세포를 식별하고 세포의 신진대사를 이해하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론은 single-cell resolution으로 세포 대사를 매핑하는 것을 포함하여 다양한 응용 분야에 광범위하게 적용할 수 있습니다.

광학 광열 적외선-형광 현장 혼성화(OPTIR-FISH)

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살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

다차원 현미경 데이터를 정확하게 분석하려면 복잡한 워크플로가 필요합니다. 이 문서에서는 소프트웨어 Cell-ACDC를 사용하는 방법을 보여줍니다. 현미경 데이터의 세분화, 추적, 세포 혈통 분석 및 정량화를 위해 최첨단 AI 기반 모델을 활용합니다. 결정적으로, 모델 출력의 반자동 수정을 위한 혁신적인 프레임워크로 이러한 모델을 보완합니다.

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4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

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