원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

이 방법을 사용하면 박테리아의 나노 단위 연구를 수행할 수 있습니다. 이는 항생제 내성의 화학적 변화에 대한 자세한 통찰력을 제공합니다. 따라서 AMR 및 약물 개발에 대한 이해에 기여할 수 있습니다.

나노 크기의 박테리아는 화학적 성질을 조사할 수 있는 사용 가능한 연구 도구를 크게 제한합니다. AFM-IR을 사용하면 세포 내 수준에서도 비파괴적이고 관찰자에 독립적인 방식으로 이를 수행할 수 있습니다. 이 방법은 항생제 내성에 대한 통찰력을 제공함으로써 새로운 항생제에 대한 분자 표적을 식별하고 테스트하는 데 도움이 될 수 있습니다.

AFM-IR은 박테리아 외에도 다양한 세포, 조직 및 바이러스를 조사할 수 있습니다. AFM-IR 이미징을 위한 샘플을 준비하려면 적절한 배양 조건에서 적절한 배지에서 관심 박테리아를 배양한 후 멸균 루프를 사용하여 콜로니 상단에서 박테리아를 신중하게 선택하여 유리관으로 옮깁니다. 튜브에 초순수 1ml를 넣고 수집된 박테리아 펠릿이 튜브 바닥에서 더 이상 보이지 않을 때까지 1-2분 동안 소용돌이칩니다.

준비된 용액과 McFarland 표준물질 간의 시각적 비교를 통해 용액의 대략적인 탁도를 추정합니다. 박테리아 현탁액의 탁도가 매우 낮은 것으로 보이면 용액의 거친 탁도가 0.5 및 1 McFarland 표준과 비슷해질 때까지 더 많은 박테리아를 추가하고 와류를 일으킵니다. 원심분리로 박테리아를 펠렛으로 만들고 피펫으로 상등액을 조심스럽게 흡인합니다.

박테리아 세포 펠릿을 와류로 1ml의 초순수에 재현탁시키고 다른 원심분리로 박테리아를 침전합니다. 방금 시연한 것처럼 박테리아를 최대 3회 더 세척한 후 상등액을 흡인하고 펠릿을 최소 2분 동안 볼류로 처리한 후 실험 기판에 5마이크로리터의 세포를 추가합니다. 원하는 두께가 단층 또는 개별 박테리아 인 경우, 증착 직후 20-100 마이크로 리터의 초순수를 기판에 첨가하고 용액을 피펫 팁과 부드럽게 혼합합니다.

샘플이 자연 건조되면 양면 접착 테이프를 사용하여 기판을 AFM 금속 표본 디스크에 장착합니다. 분석을 위해 AFM-IR 분광학 기기를 준비하려면 소프트웨어와 레이저를 켠 후 초기화를 누르고 레이저 셔터가 열린 위치에 있는지 확인하십시오. 이 과정에서 스테이지 초기화 창이 나타납니다.

초기화 프로세스가 완료되면 초기화 및 확인을 클릭합니다. 가능하면 질소 흐름을 켜서 기기를 질소로 퍼지하고 안정적인 습도 수준을 달성하도록 질소 퍼지를 조정하십시오. 팁을 손상시키지 않고 샘플을 샘플 챔버에 조심스럽게 놓고 소프트웨어에서 Load(로드)를 클릭합니다. 마법사를 따라 샘플을 로드하고 각 단계에서 팁과 샘플에 초점을 맞춥니다.

그런 다음 접근 방식을 클릭하여 관여하지 않고 샘플에 접근합니다. 샘플을 사용하기 전에 Tools(도구), IR Background Calibration(IR 배경 보정) 및 New(새로 만들기)를 선택합니다. 팝업 창에서 분석 목적에 따라 해상도와 스펙트럼 범위를 설정하고 공동 평균과 배경을 평균 값으로 설정합니다.

사용을 선택합니다. 팝업 창에서 시작 및 종료 매개 변수를 설정하고 Accept and Acquire를 클릭합니다. 배경 데이터를 획득했으면 Save(저장)를 클릭합니다.

팁을 샘플에 참여시키려면 참여를 클릭합니다. 시스템은 직접 접촉이 감지될 때까지 샘플 표면에 접근합니다. 스캔을 클릭하여 초기의 더 넓은 영역, 낮은 공간 해상도의 AFM 이미지를 수집하여 팁을 관심 있는 측정 지점으로 이동하기 전에 표면을 시각화합니다.

적외선 레이저를 샘플이 흡수할 파수에 정렬하려면 Wave Number 필드에 샘플이 흡수할 파수를 입력하고 시작을 클릭합니다 IR.At Amplitude Versus Frequency 그래프에서 하나 이상의 명확한 피크가 관찰되어야 합니다. Deflection Versus Time 그래프는 주기적인 파형을 표시해야 합니다. 최적화를 클릭하여 기존 적외선 박테리아 스펙트럼을 선택하여 대역의 위치를 식별하고, 스펙트럼을 사용하여 다양한 스펙트럼 영역의 다양한 파수 값에서 핫스팟을 최적화합니다.

선택한 파수 값에 대한 적외선 스폿이 최적화되면 스펙트럼 해상도와 범위 및 공동 평균 수를 정의하고 Acquire를 클릭하여 AFM-IR 스펙트럼을 수집합니다. 선택한 파수 값에 대한 강도 분포 이미지를 수집하려면 단일 AFM-IR 스펙트럼을 기록한 후 선택한 샘플 영역의 AFM 이미지를 기록하고 AFM-IR 이미징을 위한 파수 값을 선택합니다. 레이저의 IR 스폿이 선택한 파수 값에 최적화되었는지 확인하고 이미지 영역의 X 및 Y 방향으로 데이터 포인트 수를 설정합니다.

일반 창에서 레이저 출력을 설정합니다. AFM Scan 창에서 스캔 속도를 정의합니다. 그런 다음 IR Imaging Enable(IR 이미징 활성화) 상자를 선택하고 Scan(스캔)을 클릭하여 이미징을 시작합니다.

선택한 파수에서 신호 강도의 AFM-IR은 해당 영역의 AFM 데이터와 동시에 수집됩니다. 이 프로토콜을 사용하면 단일 세포에서 단층 및 다층에 이르기까지 기질에서 다양한 유형의 박테리아 세포 분포를 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 살아있는 박테리아의 동적 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

예를 들어, S.aureus 세포 분열 중 중격 형성. 중격의 AFM-IR 스펙트럼은 세포 영역에서 수집된 AFM-IR 스펙트럼에 비해 1, 240 및 1, 090cm에서 대역의 상대적 강도가 더 높은 것이 특징이며, 이는 중격이 세포벽 구성 요소의 탄수화물 및 포스포다이에스테르 그룹으로 구성되어 있음을 시사합니다. 이 프로토콜은 또한 내성 발달로 인해 발생하는 화학 조성의 차이를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

이 대표적인 분석에서 관찰된 바와 같이, 반코마이신 간헐적 내성과 반코마이신 감수성 S.aureus 세포 간에 형태학적 차이는 측정되지 않았습니다. 그러나 AFM-IR 스펙트럼 및 2차 유도체를 평가한 결과, 내성 균주의 세포벽 성분에서 탄수화물 및 포스포다이에스테르 그룹과 관련된 밴드의 상대적 강도가 감수성 균주에 비해 뚜렷하게 증가한 것으로 나타났습니다. 깨끗한 샘플을 준비하는 것이 중요하므로 처음부터 중간 기여도를 줄이고 여러 번의 세척에서 완전히 제거하도록 주의하십시오.

AFM-IR은 비파괴 기법이기 때문에 나중에 염색 또는 컨포칼 이온 분광법과 같은 다른 기법으로 시료를 연구할 수 있으며, 이는 시료의 화학적 성질에 대한 보완적인 정보를 제공할 수 있습니다.