그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화
2021년 2월 23일
MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.
RNA 염기서열 분석 또는 MAPS와 결합된 MS2-친화성 정제는 박테리아에 대한 관심의 모든 RNA의 전체 표적을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술을 통해 모든 종류의 sRNA 파트너를 규제 메커니즘과 독립적으로 식별할 수 있습니다. sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화는 숙주 세포 내의 박테리아의 더 나은 독성 요인 생산, 생물막 형성 및 생존을 이해하고 궁극적으로 포도상 구균 감염에 맞서 싸우는 데 도움이 될 것입니다.
이 프로토콜은 병원성 또는 비 병원성 그램 양성 박테리아에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 파스칼 롬비 박사의 실험실에서 박사 과정 학생인 노미에 메르시에(Noemie Mercier)가 될 것입니다. 시작하려면, 중복마이크로리터 에리스로마이신 당 10 마이크로그램으로 보충 BHI 매체의 3 밀리리터에서 pCN51 P3 MS2 sRNA 또는 pCN51 P3 MS2 플라스미드를 운반하는 균주의 한 식민지를 성장.
각 하룻밤 문화를 50 밀리리터의 신선한 BHI 배지로 희석하여 에리스로마이신으로 보충하여 OD 600에 도달합니다. 6시간 동안 180RPM에서 흔들리며 섭씨 37도에서 문화를 성장시다. 각 문화를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 4도에서 15분 동안 2, 900회 G에서 원심분리기를 한 다음, 상류체를 폐기하고 동결및 보관하거나 얼음위에 펠릿을 보관하고 기계식 셀 용액을 직접 수행합니다.
기계식 세포 리시스를 수행하기 위해 완충 A의 5 밀리리터에서 펠릿을 재차 판하고 3.5 그램의 실리카 구슬을 사용하여 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 재중단 된 세포를 전달합니다. 기계식 셀 리시스 기기에 튜브를 삽입하고 초당 4미터에서 40초의 사이클을 실행합니다. 15분 동안 2, 900회 G에서 튜브를 원심분리한 다음, 상체를 복구하고 얼음 위에 보관합니다.
상체가 명확하지 않은 경우 원심 분리를 반복하여 명확해야 합니다. 컬럼 팁을 제거한 다음 크로마토그래피 컬럼을 열 랙에 넣고 초순수물로 컬럼을 세척합니다. 300 마이크로리터의 아밀로오스 수지와 10밀리리터의 완충 A.희석 1, 200개의 MBP-MS2 단백질로 열을 완충 A의 6밀리리터에 넣고 컬럼에 적재합니다.
버퍼 A.Next의 10 밀리리터로 컬럼을 세척하고 MS2 선호도 정화를 수행합니다. 셀 용액을 컬럼에 로드하고 깨끗한 수집 튜브에서 흐름 관통 분수를 수집합니다. 버퍼 A의 10 밀리리터로 컬럼을 세 번 씻고 세척 분수를 수집한 다음 버퍼 E1 밀리리터로 컬럼을 길게 한 다음 2 밀리리터 마이크로튜브에서 용출 분수를 수집합니다.
RNA 추출될 때까지 수집된 모든 분수를 얼음 위에 보관하십시오. RNA 추출에 각 분획의 1 밀리리터를 사용합니다. 1부피를 RNA에 넣고 격렬하게 섞은 다음, 16, 000회 G에서 20°C에서 10분간 혼합물을 원심분리합니다.
상부를 깨끗한 2 밀리리터 마이크로튜브로 옮기. 클로로폼 이소아밀 알코올의 한 부피를 추가하고 원심 분리를 반복한 다음 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 2.5권의 100% 차가운 에탄올과 0.1부로 pH 5.2에서 아세테이트 3개소의 아세테이트를 넣고 밤새 섭씨 영하 20도까지 침전시한다.
다음 날, 원심분리는 16, 000 배 G와 섭씨 4도에서 15 분 동안 튜브를 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 파이펫으로 에탄올을 천천히 제거합니다. 5분 동안 80%의 차가운 에탄올과 원심분리기의 500마이크로리터를 추가합니다.
에탄올을 천천히 피펫팅하여 버린 다음, 실행 모드에서 5분 동안 진공 농축기로 펠릿을 건조시십시오. 펠릿을 적절한 양의 초순수로 재보펜합니다. 이 프로토콜은 S.aureus에서 RsaC 표적을 연구하는 데 사용되었습니다.
RsaC와 직접 상호 작용하는 몇몇 mRNAs는 MAPS 기술을 사용하여 확인되었습니다, 산화 스트레스 및 금속 관련 반응에 있는 중요한 역할을 드러냅니다. MS2 sRNA가 생성되고 그들의 발현 패턴을 시각화하기 위해, 세포는 BHI 배지에서 2시간, 4, 6시간 의 성장 후에 수확되었다. RNA를 추출하였고 북부 블롯 분석은 RsaC 특이적 DIG 프로브를 사용하여 수행되었다.
내인성 RsaC의 수준은 성장의 6 시간 후에 현저하게 증가했습니다. 중요한 것은 MS2-RsaC 544 및 MS2-RsaC 1, 116의 수준은 6시간 만에 내인성 RsaC와 비교되었다. 선호도 정제는 MS2 태그를 단독으로 발현하는 야생형 스트레인에서 원유 추출물, 흐름-스루 및 용출 분획에서 추출되었으며 MS2-RsaC 544 구조를 발현하는 돌연변이 RsaC 균주.
1, 116 뉴클레오티드 긴 내인성 RsaC는 용출 분획에서 농축되었지만 길이 및 복잡한 이차 구조로 인해 친화성 컬럼과 비특이적 상호 작용되었다. MS2-RsaC 544는 MS2-MBP 융합 단백질에 의해 성공적으로 유지되었다는 것을 보여주는 용출 분획에서 고도로 농축되었다. 생물정보 분석은 MS2 sRNA와 MS2 대조군 사이 접이식 변화에 따라 putative mRNA 표적을 제시했습니다, sodA가 첫번째 putative 표적이었다는 것을 나타내는.
MS2 친화 정화 후 sodA 특이적 DIG 프로브를 수행한 북부 블롯 분석은 sodA가 MS2 제어에 비해 MS2-RsaC 544와 효율적으로 공동 농축되었다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 시도할 때 MS2 태그를 추가하면 sRNA 확인, 안정성 또는 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 이를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.
MAPS는 sRNA-RNA 표적 페어링의 스냅샷을 제공합니다. 추가 실험 유효성 검사는 해당 기능을 해명합니다. 이 기술은 어떤 박테리아에 있는 sRNA 규제 네트워크를 구축하는 강력한 공구를 나타냅니다.
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개요
MAPS 기술은 특히 그람 양성균에서 특정 조절 RNA의 타겟톰(targetome)을 in vivo에서 식별할 수 있게 합니다. 이 방법은 MS2-친화성 정제와 RNA 시퀀싱을 활용하여 RNA 파트너를 공동 정제하고 식별합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 미생물학
- RNA 생물학
배경
- sRNA 의존적 조절 네트워크를 이해하는 것은 박테리아의 행동을 연구하는 데 매우 중요합니다.
- RNA 파트너를 식별하면 병원성 인자와 바이오필름 형성에 대한 단서를 얻을 수 있습니다.
- MAPS 기술을 통해 sRNA 파트너를 독립적으로 식별할 수 있습니다.
- 본 프로토콜은 병원성 및 비병원성 그람 양성균 모두에 적용 가능합니다.
연구 목적
- 박테리아의 sRNA 의존성 조절 네트워크를 규명하기 위해.
- 숙주 세포 내 박테리아의 생존 메커니즘에 대한 이해를 높이기 위해.
- 포도상구균 감염에 대처하는 전략을 개발하기 위해.
사용된 방법
- RNA 시퀀싱과 결합된 MS2-친화성 정제.
- 에리트로마이신이 포함된 BHI 배지에서의 세균 균주 배양.
- 분석을 위한 sRNA 및 파트너의 공동 정제.
- 시퀀싱 기술을 통한 RNA 파트너 식별.
주요 결과
- 그람 양성균 내 sRNA 파트너의 성공적인 식별.
- 독성 및 생존에 영향을 미치는 조절 네트워크에 대한 통찰.
- Pascal Romby 박사 연구실의 박사 과정 학생에 의한 프로토콜 시연.
- 박테리아 감염 대응을 위한 잠재적 응용 방안.
결론
- MAPS 기술은 RNA 상호작용을 연구하는 강력한 도구입니다.
- sRNA 네트워크를 이해하면 더 나은 치료 전략을 수립할 수 있습니다.
- 이 방법은 다양한 박테리아 종에 적용 가능합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
MAPS 기술은 그람 양성 병원균 내 소형 조절 RNA의 종합적인 타겟토옴(targetome) 매핑을 가능하게 하여, 항균제 개발 과정의 타겟 검증을 지원합니다. 이 기술은 병원성과 생존에 영향을 미치는 sRNA-mRNA 상호작용을 밝혀냄으로써, 초기 단계의 항균 프로그램에서 기전적 리스크를 완화해 줍니다. 이러한 접근 방식은 치료적 개입을 위한 sRNA 타겟의 우선순위 선정 시 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 그람 양성균에서 치료 가설을 명확히 하기 위해 sRNA 의존적 조절 네트워크의 조사를 가능하게 함.
- 운영적 가치: 생물학적 리스크 감소 및 기능적 표적 검증을 지원하기 위한 sRNA 타겟옴(targetome)의 스냅샷을 제공함.
- 과학적 가치: sodA와 같은 추정 mRNA 표적을 식별하여 sRNA 활성을 산화 스트레스 및 금속 반응 경로와 연결함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 공동 정제된 분획물로부터 정량적인 RNA 시퀀싱 결과를 생성하여 재현 가능한 표적 식별을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 아밀로스 수지상의 MS2-MBP 융합 단백질을 통한 캡처 과정을 표준화하여, 그람 양성 균주 전반에 걸친 분석 확장성을 지원합니다.
- 과학적 가치: 농축 지표(예: 용출 분획)를 제공하여 특이적 RNA 상호작용과 비특이적 상호작용을 구분합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: sRNA 레귤론을 Staphylococcus aureus의 독성 인자 생성 및 바이오필름 형성 것과 같은 표현형 출력과 연결합니다.
- 운영적 가치: sRNA 활성을 감염과 관련된 스트레스 반응 경로에 연결함으로써 중개 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 과학적 가치: Northern blot과 같은 직교 방법을 통해 sRNA 표적을 검증함으로써 위험 조정된 추진 결정 프로세스를 촉진합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
MAPS는 표적 식별부터 리드 최적화에 이르는 발견 연속체에 적합하며, 특히 RNA 기반 조절을 표적으로 하는 항균 프로그램에 유용합니다.
- 발견 생물학: 정의된 성장 조건하에서 in vivo RNA 인터랙톰(interactome)을 매핑하여 sRNA 기능의 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 시퀀싱과 호환되는 표준화된 용해, 친화성 캡처 및 RNA 추출 워크플로우를 통해 분석 준비 상태를 가능하게 합니다.
- 분석: MS2-sRNA 분획과 대조군 분획 간의 fold-change 측정을 제공하여 후속 연구를 위한 신뢰도 높은 표적의 우선순위를 결정합니다.
- 중개 연구: sRNA 타겟톰(targetome)을 호스트 생존 기전과 연결하여 항감염 전략의 전임상 검증에 정보를 제공합니다.
- 기업적 재사용: 병원성 및 비병원성 그람 양성 균주 전반에 걸친 sRNA 타겟톰 프로파일링을 위한 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: sRNA 표적 식별의 예측 신뢰도 향상, 전사 후 조절의 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 박테리아 용해물 내 RNA-단백질 상호작용 캡처의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 항균 표적 선택 시 더 정확한 진행/중단(go/no-go) 결정, 자본 효율성 증대 및 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: 농축 데이터 및 표현형 상관관계를 기반으로 한 sRNA 표적의 위험 조정 우선순위 지정.
구현 시 고려 사항
- 분자 클로닝, 박테리아 배양 및 RNA 취급에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 기계적 용해 인프라, 크로마토그래피 시스템 및 RNA 시퀀싱 역량이 필요합니다.
- 컨스트럭트 설계(예: MS2-sRNA 융합) 및 발현 검증을 위한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 다양한 그람 양성 모델에 적용할 때 sRNA의 안정성과 이차 구조에 대한 적응 고려 사항이 필요합니다.
- 실질적 제한 사항: 비특이적 상호작용의 가능성이 있으므로, 추정 타겟의 특이성을 확인하기 위해 직교 검증(예: Northern blot)이 필요합니다.
