Name: 4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 학습하세요 4D 현미경을 이용한 Caenorhabditis elegans 배아 세포 계통 추적 방법을. 노마르스키 광학으로 형광 표지 없이 발달 과정을 관찰하고, 돌연변이체와 야생형의 세포 주기를 비교 분석합니다.

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저자는 Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER)과 스페인 장관 인 Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00)의 지원을 인정하고자합니다. 크리스티나 로메로 아란다는 AECC (Asociación Española Contra el Cáncer)의 펠로우십에 의해 자금을 지원합니다.

1. 페트리 요리에 C. 엘레간을 재배하십시오.
<ol><li>NGM 플레이트를 준비하고 대장균 OP50을 식품 공급원으로 사용하여 시드합니다(그림 1). 17에 기재된 바와 같이 C. elegans를 성장 및 유지한다. 시딩된 플레이트를 최대 한 달 동안 4°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>웜을 추가하기 전에 플레이트를 원하는 온도로 조정하십시오.<ol>
<li>웜을 옮기려면 오래된 접시에서 한천 덩어리를 제거하고 신선한 접시에 놓습니다.</li>
		<li>또는 멸균 웜 피커 (파스퇴르 피펫의 끝에 장착 된 평평한 팁이있는 32 게이지 백금 와이어의 1 인치 조각)로 단일 동물을 포획하여 새 접시에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 온도에서 웜을 성장시킵니다.<ol>
<li>표준 온도 인 20 °C에서 C. elegans 웜을 성장시킵니다. 그러나, 열감응성 돌연변이체의 발달을 분석하기 위해, 보통 25°C에서 밤새 인큐베이션을 수행한다. 특정 돌연변이체에 따라 필요에 따라이 인큐베이션의 지속 기간과 온도를 조정하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 배아를 장착하기 전에 4D 현미경 기록을 준비하십시오 (그림 2)
<ol><li>배아를 준비하기 전에 현미경과 온도 조절기를 설치하십시오. C. elegans 배아는 매우 빨리 나뉩니다. 배아를 장착 한 직후에 기록을 시작할 준비를하십시오.</li>
	<li>기록 온도를 15°C, 20°C 또는 25°C로 조정합니다.<ol>
<li>배아를 25°C에서 일상적으로 기록한다. 제한적인 온도에서 열에 민감한 돌연변이체를 기록하여 표현형을 표시하십시오. WT 대조군 (다른 제제로 행해진 경우)을 돌연변이체와 동일한 온도에서 기록하십시오. 참고: WT 배아는 25°C에서 더 빠르게 발달하고 세포 계보의 추가적인 차이 없이 15°C에서 더 느리게 발달합니다. 현미경을 온도 조절실에 두십시오. 슬라이드를 냉각 또는 가열함으로써 추가적인 제어가 매우 바람직하다. 이것은 현미경 대물 및 응축기 주위의 금속 링을 통해 특정 온도에서 물을 순환시킴으로써 달성 될 수있다. 목적과 준비는 침지 오일을 통해 직접 접촉하며 온도 전달이 효율적입니다. 이 시스템은 기록 온도를 정밀하게 제어하고 배아 발달 중에 온도 이동을 수행 할 수있게합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 소프트웨어에서 레코드 매개 변수를 정의합니다.<ol>
<li>표준 C. elegans 기록(형광 스캔 제외)의 경우 다음을 선택합니다. 각각 1 미크론의 거리에서 30 초점면의 z- 스택. 각 z-스택의 시작 부분 사이의 30초 간격. 1500 z-스택 (12.5 시간의 기록). 참고: 상용 및 오픈 소스 현미경 제어 프로그램 모두 이미지 캡처를 위한 이 워크플로를 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 이제 현미경을 기록 할 준비가되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 배아를 준비하고 장착하십시오.
<ol><li>멋진 이미지를 얻기 위한 첫 번째 단계로 얇고 균질한 한천 패드를 준비합니다(그림 3).<ol>
<li>탈이온수에 4.5% 한천 용액 50ml를 준비한다. 전자 레인지에서 끓여서 가열하고 3ml 유리 튜브에 0.5 - 1ml를 붓습니다.</li>
		<li>건조를 피하기 위해 조심스럽게 왁스 필름으로 튜브를 밀봉하십시오. 밀봉 된 한천 튜브는 실온에서 최대 두 달 동안 보관할 수 있습니다.</li>
		<li>실험실 벤치에는 다음과 같이 80 °C에서 열 블록이 있습니다. 순수한 석유 젤리 (녹은)의 시험관, 내부에 미세한 페인트 브러시가 있습니다. 파스퇴르 피펫이 들어있는 증류수가있는 시험관. 참고 : 이렇게하면 필요한 모든 재료가 뜨거워지고 패드를 만드는 과정에서 한천이 굳어지지 않습니다.</li>
		<li>한천 튜브 중 하나의 상단에서 왁스 필름을 제거하고 알코올 버너 위로 조심스럽게 가열하여 한천을 녹입니다. 유리 튜브에서 배출 된 뜨거운 한천이 화상을 입을 수 있으므로주의하십시오.</li>
		<li>한천이 녹으면 튜브를 열 블록에 넣어 한천을 액체 형태로 유지하십시오.</li>
		<li>또는 실험 전에 한천 튜브를 열 블록 1h 내에 배치하여 버너를 사용하지 않고 녹입니다. 녹은 한천은 하루 후에 버려야합니다.</li>
		<li>현미경 슬라이드 (슬라이드 A)를 플라스틱 조각에 다른 두 개 사이에 놓습니다.</li>
		<li>다른 슬라이드(슬라이드 B)를 가져와 한 손에 손가락으로 잡으십시오.</li>
		<li>반면에 따뜻한 파스퇴르 피펫을 사용하여 슬라이드 A의 중앙에 녹은 한천 한 방울을 놓습니다.</li>
		<li>슬라이드 B를 한천 드롭에 즉시 눌러 슬라이드 A와 B 사이에 매우 얇은 패드를 만듭니다. 3.2.3단계까지 이러한 슬라이드를 함께 끼워 둡니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배아를 마운트하십시오.<ol>
<li>피커와 함께 5-10 개의 gravid hermaphrodite를 모아서 물로 채워진 시계 제작자 유리에 넣으십시오.</li>
		<li>메스를 사용하여 헤르마프로디트 선충류를 자르고 입체 현미경으로 자궁에서 초기 계란 (1-4 세포)을 추출하십시오.</li>
		<li>3.1.10단계에서 슬라이드를 가져와 슬라이드 B를 조심스럽게 밀어 슬라이드 A에 아가 패드를 노출시킵니다.</li>
		<li>모세관 튜브로 피펫팅하여 한천 패드의 중앙에 초기 달걀을 놓습니다.</li>
		<li>대안적으로, 한 세트의 배아를 함유하는 방울을 한천 패드 상에 피펫팅한 다음, 초기 단계 배아를 검색한다. 입체 현미경 아래에서이 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>필요한 경우 이쑤시개 끝에 붙어있는 속눈썹으로 달걀을 움직여 달걀을 움직입니다.</li>
		<li>모세관 피펫으로 과도한 물을 제거하십시오. 참고 : 모세관 피펫은 파스퇴르 피펫을 알코올 버너 위로 가열하고 양쪽 끝에서 당겨서 쉽게 준비 할 수 있습니다.</li>
		<li>조심스럽게 커버 슬립으로 준비를 덮으십시오. 기포를 방지하려면 커버슬립의 한쪽 가장자리를 슬라이드에 놓고 인접한 가장자리를 따라 메스를 부드럽게 밀어 커버슬립을 준비 대에 천천히 비스듬히 드레이프합니다.</li>
		<li>피펫을 사용하여 한천 패드를 둘러싼 공간의 3/4을 물로 채 웁니다. 공간의 1/4을 공기와 함께 남겨 두십시오.</li>
		<li>커버슬립을 석유 젤리로 밀봉하여 긴 기록 기간 동안 건조되지 않도록 하십시오.</li>
		<li>미세 브러시를 사용하여 녹은 석유 젤리의 얇은 층을 커버 슬립의 가장자리 주위로 확장하십시오. 참고: 이제 준비 완료 완료 되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. DIC를 조정하고 4D 현미경 녹화를 시작하십시오.
<ol><li>슬라이드를 현미경 스테이지에 놓습니다. 낮은 배율 목표 (5x 또는 10x)를 사용하여 배아를 집중시킵니다.</li>
	<li>100x 몰입 목표로 변경하십시오.</li>
	<li>현미경의 광학 성분을 조정하여 Nomarski 이미지를 가져옵니다.<ol>
<li>콘덴서에 초점을 맞춥니다.</li>
		<li>콘덴서의 조리개를 완전히 열고 필드 다이어프램을 닫습니다 (이것은 더 높은 수치 조리개를 제공하므로 더 큰 해상도를 제공합니다).</li>
		<li>현미경의 두 편광자가 최대 광 멸종을 일으키도록 배향되어 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>Wollaston 프리즘을 돌려 한쪽에 비추는 배아의 멋진 입체 이미지를 얻으십시오. 프리즘을 다른 방향으로 돌려 배아를 다른 쪽에 비추는 효과를 얻으십시오. 참고: 이러한 단계는 기록 전에 테스트 샘플에서 수행할 수 있으므로 분석 중인 시편에 미세 조정만 필요합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경에서 이미지 캡처를 시작합니다.</li>
</ol>5. 4D 동영상을 분석합니다(그림 4).
참고: 기록이 완료되면 세포 계보 추적 소프트웨어를 사용하여 세포 계보를 재구성하고 분석하십시오.
세포 계보 추적 소프트웨어는 세포 배양 또는 조직 단편에서 배아 발달 또는 역학에 대한 상세한 분석을 수행하기위한 강력한 도구입니다. 이 프로그램은 세포 분열, 세포주기 길이, 이동 또는 아폽토시스뿐만 아니라 그 동역학을 포함하여 기록 된 모든 세포의 완전한 세포 계보의 생성을 포함하는 샘플의 세포 역학에 대한 여러 데이터 세트를 추출하고 정량화합니다. 또한, 세포 분화는 세포의 형태학적 변화 또는 특정 마커의 발현에 의해 점수화될 수 있다. 기본적으로 소프트웨어 화면에는 두 개의 창이 표시됩니다 : 왼쪽 창에는 4D 동영상을 앞뒤로 재생하거나 위 또는 아래쪽 레벨로 위아래로 재생할 수 있으므로 녹음 내내 시간과 공간에서 각 셀을 따라갈 수 있습니다. 오른쪽 과부에서는 세포 계보가 생성됩니다. 4D 동영상에서 세포 핵을 클릭하면 계보 창에 세포 이름, 운명 및 공간 좌표의 정보를 저장하는 점이 생성됩니다. 특정 세포의 세포 계보는 4D 영화를 앞으로 재생하고 주기적으로 핵을 클릭하여 시간이 지남에 따라 특정 세포의 유사분열을 표시함으로써 생성됩니다. 기록된 각각의 세포에 대해 이러한 과정을 반복하면 배아 또는 샘플의 완전한 세포 계보가 생성된다. 각 세포의 공간 좌표에 대한 저장된 정보는 나중에 3D 배아 모델 및 세포 이동 경로를 재구성하는 데 사용됩니다.
<ol><li>계보 추적 소프트웨어를 열고 상단 막대 메뉴로 이동하여 다음을 선택하여 새 프로젝트를 만듭니다. 파일 | 새 프로젝트.</li>
	<li>기록 온도에 따라 셀 계보 템플릿을 선택하십시오: 25°C에서 기록하기 위한 DB08, 20°C에서 기록하기 위한 DB10, 15°C에서 기록하기 위한 DB12.</li>
	<li>새로운 창에서 스캔 횟수(보통 1500), 스캔 사이의 시간(30초), 레벨 카운트(30) 및 레벨 간 거리(1미크론)와 같은 기록 파라미터를 설정합니다.</li>
	<li>이미지 파일 및 형식을 선택합니다.<ol>
<li>이미지가 저장된 이미지 디렉토리를 선택합니다.</li>
		<li>이미지를 단일 이미지(레벨 및 시간당 하나의 이미지) 또는 다중 이미지 z-스택으로 저장할지 선택합니다.</li>
		<li>파일 이름 지정 및 이미지 형식을 결정합니다. 일반적으로 단일 이미지는 다음 이름으로 저장됩니다. X0000L00C1(스캔 0, 레벨 0, 채널 1의 경우) X0000L01C1(스캔 0, 레벨 1, 채널 1) X0000L02C1(스캔 0, 레벨 2, 채널 1의 경우) ... X0001L00C1(스캔 1, 레벨 0, 채널 1의 경우) X0001L01C1(스캔 1, 레벨 1, 채널 1의 경우) ... X0300L04C1(스캔 300, 레벨 4, 채널 1) ... 참고: 이미지를 압축된 형식으로 저장하면 하드 디스크의 공간이 절약됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>광 채널 정의: DIC 광학용 1개, GFP 2개, RFP 3개 등 4D 레코딩에 사용된 것을 추가합니다. "채널 처리 사용"을 클릭하여 감지하십시오.</li>
	<li>배아의 세포 계보를 추적하기 시작하십시오. 이제 화면에는 비디오 창과 셀 계보 창이라는 두 가지 주요 창이 포함되어 있습니다.<ol>
<li>계보 창에서 계보 분기를 선택하고 마우스를 사용하여 비디오 창에서 이 셀에 해당하는 세포 핵을 클릭합니다.</li>
		<li>커서 키를 사용하여 4D 동영상을 앞으로, 뒤로 또는 위 또는 아래로 재생하여 공간적으로 그리고 시간이 지남에 따라 셀을 따라갑니다.</li>
		<li>주기적으로 세포 핵을 클릭하십시오. 이렇게 하면 계보 분기에 점이 생성되고 이때 셀의 공간 좌표가 등록됩니다. 결과적으로 세포 계보가 진행되고 배아의 3D 재구성이 가능합니다.</li>
		<li>반환 키를 클릭하여 유사분열을 표시합니다. 그런 다음 딸 셀 중 하나를 선택하고 이전과 같이 따르십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나머지 배아 세포에 대해 이 과정을 반복하여(단계 5.6.1 내지 5.6.4), 완전한 세포 계보를 추적하거나, 아폽토시스를 겪는 것과 같은 관심있는 특정 세포를 따른다.</li>
	<li>돌연변이 계보를 입체형화된 WT C. 엘레간스 세포 계보와 비교한다.</li>
</ol>

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</ol>

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현대 생물학의 주요 과제 중 하나는 다세포 유기체의 발달을 이해하는 것입니다. C. elegans는 발달중인 배아에서 세포 증식과 세포 분화 사이의 미세 조정을 연구하는 데 가장 적합한 모델 중 하나로 부상했습니다. 광학적 관점에서 볼 때, 투명한 몸체와 작은 크기로이 선충류는 DIC 현미경 검사에 이상적인 표본입니다. 유사한 특성을 가진 다른 유기체들도 4D 현미경 분석11,12,13,14,15,16을 받았다.
이러한 발달 연구의 경우, 정방향 또는 역방향 유전학에 의한 유전자 불활성화는 배아 발생에 대한 단서를 제공합니다. 일단 유전자가 발달에서 중요한 역할을하는 것으로 입증되면, 다음 단계는 올바른 신체 계획의 수립에 정확한 역할을 정의하는 것입니다. 면역 염색은 대부분의 모델에 대해 선택된 접근법입니다. 이 기술은 세포 분화 또는 특정 마커의 발현의 문제를 해명한다. 그러나, 이러한 접근법의 주요 한계는 개발의 고정된 지점에서 하나 이상의 마커의 발현에 대한 정적 뷰만을 제공한다는 것이다. 발달 전반에 걸쳐 이러한 마커의 역동적 인 견해는 다른 시점에서 다른 배아를 염색함으로써 만 얻을 수 있습니다. 또한, 세포 계보 재구성은 이러한 고정된 샘플에서 가능하지 않다.
4D 현미경 검사는 배아 발달을 연구하기위한 보완적인 접근법입니다. 이 기술은 세포 수준 분해능에서 발달 역학을 드러낸다. 스핀들 방향, 세포 이동, 아폽토시스, 세포 운명 사양 등의 문제와 같은 배아의 결함은 연구자가 앞뒤로 시각화하고 정량화하고 채점할 수 있는 4D 영화에 나타날 것이다. 이 기술을 사용하면 배아의 거의 모든 세포가 배아가 움직이기 시작하는 순간까지 추적 할 수 있습니다. 가시광선과 노마르스키 광학만으로 4D 현미경을 검사받은 배아는 광손상을 입지 않습니다. 형광 스캔은 또한 유전자가 언제 어디서 발현되는지를 검출하기 위해 기록 내에서 인터칼레이션될 수 있다. 상당한 광손상을 겪는 배아는 표준 WT 계통 배아에 비해 강한 UV 조사를 일으키는 세포 주기 확장에 의해 확인된다. 이 경우 UV 램프 강도를 낮추고 카메라 감도 또는 노출 시간을 늘려 광손상을 줄일 수 있습니다. 형태학적 특성 및 분자 마커는 임의의 돌연변이체의 배아 발달을 명확히 하는 것을 도울 수 있다.
4D 현미경 시스템을 설치하는 것은 실험실에서 쉽게 구현할 수 있으며, 몇 가지 실습 후에 현미경 분야의 모든 세포의 해상도 수준에서 세포 역학 및 세포 배양 및 살아있는 투명 표본의 계보 추적에 대한 탁월한 분석을 가능하게합니다. DIC 이미지에 대한 세포 계보 추적은 여전히 손으로 처리됩니다. 시간이 많이 걸리고 소프트웨어가 동일한 셀을 표시하는 다른 계보 분기와 같은 계보 오류를 감지하더라도 실수가 발생할 수 있습니다. GFP 표지된 세포의 자동 검출이 잘 발달되어 있지만2, 표시가 없는 세포 및 가시광선 이미지를 기반으로 하는 상보적 계통 추적 소프트웨어는 아직 초기 단계에 있으며 전체 배아 분석에는 실제로 유용하지 않습니다. 의심의 여지없이, 가시 광선 현미경 분야에 이미지 인식 시스템을 적용하면이 분야에서 큰 발전을 가져올 것입니다.

4D 현미경 검사는 다초점 타임랩스 기록 시스템으로, 연구자가 생물학적 샘플의 세포 역학을 공간적으로나 시간이 지남에 따라 등록하고 정량화할 수 있습니다. 세포 배양, 효모 또는 살아있는 조직은 4D 분석을 거칠 수 있지만이 기술은 살아있는 배아의 발달을 분석하는 데 특히 적합합니다. 이 분석의 해상도는 배아의 모든 단일 세포 수준에 도달합니다. 각 세포 분열을 감지 할 수 있으며 시간이 지남에 따라 세포 움직임을 추적 할 수 있습니다. 세포 운명은 세포가 획득하는 위치와 모양에 따라 평가됩니다. Nomarski 광학의 사용은 초점면을 방해하는 직교 편광 광선을 사용하여 염색되지 않은 투명 샘플의 대비를 향상시킵니다. 결과 이미지는 입체적으로 보이며 한쪽에 조명됩니다.
핵의 자동 검출 및 세포 계보의 생성을 위한 공초점 현미경 및 GFP 트랜스제닉 동물의 사용에 기초한 다른 방법들이 개발되었다 1,2. 이러한 시스템의 장점은 분명합니다 : 소프트웨어는 일정 기간 동안 각 핵을 수동으로 표시 할 필요성을 크게 무시합니다 (후기 단계에서는 수동 감독이 필요하지만). 그러나, 세포 분화, 이동, 아폽토시스 또는 시체 삼킴 동안 발생하는 것과 같은 세포 형태 또는 막 역학의 변화를 수반하는 세포 과정은 형광 표지된 핵 이미지에서 검은 배경으로서 숨겨져 있다.
대조적으로, 4D Nomarski 현미경 (DIC 현미경, 차등 간섭 대조 현미경이라고도 함)은 야생형 또는 돌연변이 동물의 발달 중에 발생하는 핵 및 세포 모양 변화를 보여줍니다. 이를 통해 표준 현미경을 사용하여 세포 계보를 추적 할 수 있으며 투과 된 빛 만 사용합니다. 특정 발현 패턴을 보이는 것 외에는 일반적으로 트랜스제닉 동물을 사용할 필요가 없으며, 이 경우 형광 스캔이 인터칼레이션될 수 있다. 따라서 이것은 DIC 현미경 3,4,5,6,7에서 강조 표시 할 수있는 배아 발생 또는 아폽토시스와 같은 동적 세포 과정을 연구하는 많은 실험실에서 최적의 접근법이 될 수 있습니다.
현미경 이미지를 캡처하고 기록 된 샘플에서 세포 계보, 3D 모델, 세포 이동 경로 등을 재구성하기 위해 몇 가지 유연하고 사용자 친화적 인 프로그램을 사용할 수 있습니다. 표준 실험에서 이미지는 일정한 거리에서 일련의 초점면에서 수집되며, 그 수는 샘플 두께에 따라 다릅니다. 분석의 시간적 분해능은 스캔 빈도를 증가시킴으로써 최적화될 수 있다. 컴퓨터 저장 용량 이외의 녹음 기간에는 사실상 제한이 없습니다. 예를 들어, C. elegans 배아 발달 분석의 경우, 우리는 12 시간 동안 30 초마다 30 초점 평면 (각각 1 미크론 스텝)에서 이미지를 일상적으로 수집합니다.
이들 시스템은 예쁜꼬마선 충 8,9,10, 초파리 멜라노가스터 11, 다른 선충류 배아 12,13, 타르디그레이드 14,15 및 심지어 초기 마우스 배아 16과 같은 몇몇 동물 배아의 분석에 적용되었다. 유일한 요구 사항은 현미경으로 슬라이드 제제에서 개발할 수있는 투명한 배아를 갖는 것입니다.
요약하면, DIC 기반 4D 현미경 검사는 1) 작고 투명한 동물의 배아 발달 분석에 특히 유용합니다 : 세포 계보 추적, 세포 이동 경로, 3D 모델 생성 등; 2) 유전자 발현 패턴을 정의하는 단계; 3) 효모에서 인간 세포에 이르기까지 세포 배양 역학을 연구하는 단계; 4) 조직 역학 또는 배아 단편을 분석하는 단계; 5) 세포 사멸 동역학 및 시체 삼킴을 정량화하는 단계; 6) 배아 발달 특성에 기초한 비교 계통학 분석을 수행한다. 이러한 주제 (또는 유사한 주제) 중 하나에 관심이있는 경우 4D 현미경을 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Caenorhabditis elegans (N2)</td><td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td><td>N2</td><td>WT C. elegans 균주. GCG (Caenorhabditis Genetics Center)에서 요청할 수 있습니다 : https://cgc.umn.edu/</td></tr><tr><td>Caenorhabditis elegans (VZ454) </td> <td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td> <td>VZ454</td><td>gsr-1 (tm3574) C. elegans 돌연변이 균주. GCG(Caenorhabditis Genetics Center)에서 요청할 수 있습니다: https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>세포 계통 추적 소프트웨어</td><td>SIMI</td><td>Simi BioCell</td><td>이것은 배아 세포 계통을 재구성하는 소프트웨어입니다. 자세한 설명은 다음에서 확인하십시오: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td></tr><tr><td>현미경 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-R2</td><td>투과 및 자외선 모두를 위한 Miscroscope 카메라</td></tr><tr><td>현미경 제어 소프트웨어</td><td>Caenotec</td><td>Time to Live</td><td>이 소프트웨어는 현미경을 제어하여 4D 이미지 캡처를 수행합니다. 요청: Caenotec Prof. Ralf Schnabel Kleine Dorfstr. 9 38312 B&ouml; r&szlig; um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td></tr><tr><td>현미경 제어 소프트웨어</td><td>Micro-manager</td><td>Micro-manager</td><td>이 소프트웨어는 현미경을 제어하여 4D 이미지 캡처를 수행합니다. 다운로드 위치: https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>전동 현미경</td><td>라이카</td><td>라이카 DM6000</td><td>4D 현미경 검사를 수행하기 위한 전동 정립 현미경</td></tr><tr><td>분자생물학 실험실의 표준 장비.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td>스테로현미경은 선충을 조작하고 배아를 준비합니다.</td></tr></tbody></table>

4d 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

4D 현미경 검사는 다른 동물에서 배아 발달 과정을 풀기위한 귀중한 도구입니다. 지난 수십 년 동안 Caenorhabditis elegans 는 개발을 연구하기위한 최고의 모델 중 하나로 부상했습니다. 광학적 관점에서 볼 때, 크기와 투명한 몸체는이 선충류를 DIC (차동 간섭 대비 또는 Nomarski) 현미경 검사에 이상적인 표본으로 만듭니다. 이 기사는 C. elegans 선충류를 성장시키고, 배아를 준비 및 장착하고, 4D 현미경 검사 및 세포 계보 추적을 수행하는 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 Nomarski 이미지의 다초점 타임랩스 기록 및 특정 소프트웨어를 사용한 분석을 기반으로 합니다. 이 기술은 세포 수준에서 배아 발달 역학을 보여줍니다. 스핀들 배향, 세포 이동, 아폽토시스 또는 세포 운명 사양의 문제와 같은 돌연변이체의 모든 배아 결함은 효율적으로 검출되고 점수가 매겨질 수 있다. 배아의 거의 모든 단일 세포는 배아가 움직이기 시작하는 순간까지 추적 할 수 있습니다. 4D DIC 현미경으로 C. elegans 배아의 전체 세포 계보를 추적하는 것은 힘들지 만 특정 소프트웨어를 사용하면 이러한 작업이 크게 용이합니다. 또한이 기술은 실험실에서 쉽게 구현할 수 있습니다. 4D 현미경 검사는 다목적 도구이며 배아 발달에 대한 비교할 수없는 분석을 수행 할 수있는 가능성을 열어줍니다.

환원된 글루타티온(GSH)을 재생하는데 필요하고 선충류에서 산화환원성 항상성을 유지하는데 관여하는 효소 글루타티온 환원효소인 gsr-1에 대한 C. elegans 돌연변이체의 배아 발달을 특성화하기 위해, 우리는 초기 배아 정지 표현형18을 야기하는 대립유전자(function allele)의 상실인 gsr-1(tm3574) 결실 돌연변이체의 4D 현미경 검사를 수행하였다. WT 및 평형 gsr-1 (tm3574) 돌연변이체 C. 엘레간 선충류 둘 다를 식품 공급원으로서 대장균 OP50으로 시딩된 NGM 플레이트 상에서 성장시켰다17. gsr-1 (tm3574) 웜을 2세대 동안 20°C에서 이형접합체로서 성장시킨 다음, 동형접합성 웜(모체 부하로 인해 성인기까지 자랄 수 있음)을 분리하여 배아 분석 전에 하룻밤 동안 배양을 위해 25°C로 이동시켰다. 웜 플레이트는 응축을 피하기 위해 골판지 박스 내에서 인큐베이션되었다(그림 1). Gravid 선충류를 어린 배아를 추출하기 위해 개방하여 절단하였다.
동일한 조건하에서 돌연변이체 대 입체형화된 WT의 배아 발달을 비교하기 위해, WT (대조군으로서) 및 gsr-1 (tm3574) 배아를 서로 옆에 동일한 제제 상에 배치하였다. 4D 현미경 작업 과정은 DIC 광학이 장착 된 표준 전동 직립 현미경에서 실행되었습니다. 현미경 제어 프로그램에서 선택된 기록 파라미터는 각각 1미크론 거리에서 30개의 초점면으로 구성된 z-스택, 각 z-스택의 시작 부분과 1500개의 z-스택 사이의 30초 간격(기록 12.5시간)이었습니다. 기록 온도를 25°C(실내와 현미경 단계 모두)로 조정하였다(도 2).
녹화가 완료되면 이미지 파일이 열리고 비디오 창에 표시된 세포 핵을 클릭하여 계보 추적 소프트웨어를 사용하여 세포 계보를 재구성했습니다 (그림 4). 추적된 gsr-1 (tm3574) 돌연변이 배아 세포 계보를 배경에 묘사된 C. elegans WT 계보와 비교하였다. 주요 결과는 배아 발달 동안 세포 주기의 점진적인 지연의 검출이었다. 결과적으로 돌연변이 배아는 중간 단계에서 체포되었지만 WT 배아는 진행되어 마침내 애벌레로 부화했습니다.
현미경 또는 후기 배아 마커에 대한 항체로 면역염색을 통한 배아의 제조 및 직접 관찰은 WT에 비해 돌연변이체에서 어린 배아의 높은 비율의 존재를 나타낼 수 있습니다. 배아 체포는 가장 그럴듯한 설명으로 추론 될 수 있습니다. 그러나 세포 주기 지연에 대한 직접적인 증거와 정확한 정량화는 4D 현미경 실험을 통해서만 우아하고 쉽게 표시되고 정량화될 수 있습니다. 세포 분화 또는 아폽토시스와 같은 배아 발달의 다른 중요한 특징(그림 5)은 또한 단일 실험에서 발달의 여러 측면에 대한 상세한 분석을 제공하는 4D 현미경을 사용하여 동적 방식으로 시각화할 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> 그림 1 : 실험실 조건에서 자라 는 C. elegans 선충류. 선충류는 대장균 시드 NGM 플레이트에서 재배되어 골판지 상자에 보관되고 15°C, 20°C 또는 25°C에서 배양됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> 그림 2: 4D 현미경 기록 소프트웨어의 스크린샷. 두 개의 다른 현미경 제어 소프트웨어 프로그램 (A 및 B)의 예. 이 프로그램은 4D 현미경 녹화 중에 현미경 및 이미지 캡처를 제어하는 워크 플로우를 만듭니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> 도 3: 한천 패드 준비 및 C. elegans 배아의 장착을 보여주는 연속 사진. A . 준비된 한천 튜브. B-C. 한천 패드의 준비. D. 부분적으로 물로 채워진 슬라이드. E. 석유 젤리로 슬라이드를 밀봉. F. 최종 준비. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> 그림 4: 세포 계보 추적 소프트웨어의 직렬 스크린 샷. 이 프로그램은 세포 주기 지연 돌연변이체 (왼쪽) 및 WT (오른쪽) C. elegans 배아의 배아 세포 계보의 재구성을 허용한다. A. 개발의 초기 단계. B-C. 두 배아의 발달은 시간이 지남에 따라 진행됩니다. D. WT 배아는 적절하게 발달하고 돌연변이가 체포되는 동안 신장을 시작합니다. 모든 경우에 프로그램은 비디오 창과 계보 창을 표시합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> 도 5: C. elegans WT 배아에서 세포사멸 세포의 렌틸 굴절성 형태. 형태학적 특성에 의해 정의되는 세포 운명은 4D 현미경으로 평가할 수 있다. 이미지는 콩 단계에서 C. elegans 배아를 보여줍니다. 살아있는 세포는 과립 세포질로 둘러싸인 매끄러운 모양의 핵을 보여줍니다. 대조적으로, 세포사멸 세포 (노란색 화살표)는 응축되어 렌즈 콩과 같은 굴절성 모양을 채택합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

4D 현미경 검사는 C.elegans 배아 또는 기타 표본의 전체 세포 계통을 단일 세포 수준에서 재구성하는 데 유용한 도구입니다. Nomarski 광학 장치는 형질전환 동물이나 형광 현미경 검사 없이 표준 현미경과 투과광으로 개발 중 세포 모양 변화를 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 4D 현미경을 사용하면 예쁜꼬마선충 및 포유류 또는 조직 세포 배양과 같은 다른 시스템에서 세포 순환, 증식, 분화 및 세포사멸을 연구할 수 있습니다.DIC 이미지에 대한 세포 계통 추적은 수동으로 수행됩니다. 시간이 많이 걸리고 전체 배아 분석을 수행하기 위해 약간의 연습이 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 기술자인 Begona Ezcurra가 될 것입니다.배아를 준비하기 전에 4D 현미경의 기록 온도를 섭씨 15도, 20도 또는 25도로 조정하고 각 스택의 시작 부분 사이에 30초 간격으로 1미크론 떨어진 1, 500, 30개의 초점면 z 스택을 기록하도록 현미경을 설정합니다. 다음으로, 500-1000 마이크로 리터의 액체 4.5 % 한천을 3 밀리미터 유리관에 분취하고 건조를 피하기 위해 왁스 필름으로 튜브를 조심스럽게 밀봉합니다. 녹음을 위해 얇고 균질한 한천 패드를 준비하려면 한천이 녹을 때까지 알코올 버너에서 한천을 조심스럽게 가열하고 분취한 다음 튜브를 섭씨 80도의 열 블록에 놓습니다.유리 현미경 슬라이드를 플라스틱 조각에 놓고 한 손에 목초지 피펫을 사용하여 녹은 한천의 작은 방울을 슬라이드 중앙에 놓은 다음 즉시 다른 손을 사용하여 두 번째 슬라이드를 한천 방울에 올려 놓아 매우 얇은 한천 패드를 만듭니다. 배아를 장착하려면 먼저 피커를 사용하여 5-10개의 중력 자웅동체를 실체 현미경으로 물이 채워진 시계 제작자 유리로 옮깁니다. 메스를 사용하여 자웅동체 선충을 잘라 열고 자궁에서 1-4개의 초기 난자를 추출합니다.한천 패드의 상단 슬라이드를 부드럽게 밀어 넣고 모세관 튜브를 사용하여 패드 중앙에 이른 달걀을 놓습니다. 이쑤시개 끝에 붙인 속눈썹을 사용하여 필요에 따라 달걀 위치를 조정하고 모세관 피펫을 사용하여 여분의 물을 제거합니다. 메스를 사용하여 준비 물 위에 커버 슬립을 천천히 비스듬히 드레이프한 다음 마이크로피펫을 사용하여 한천 패드 주변 공간의 3/4을 물로 채웁니다.그런 다음 긴 녹음 기간 동안 건조를 방지하기 위해 커버 슬립을 바셀린으로 밀봉하십시오. 밀봉 후 슬라이드를 4D 현미경 스테이지에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 배아에 초점을 맞춥니다. 100X immersion objective를 선택하고 콘덴서의 초점을 맞춥니다.콘덴서의 조리개를 완전히 열고 자기장 다이어프램을 닫아 더 높은 개구수와 더 큰 해상도를 제공합니다. Wollaston 프리즘을 돌려 한쪽 면에 조명이 비춰진 배아의 3차원 이미지를 얻은 다음 프리즘을 다른 방향으로 돌려 다른 면에 배아가 조명되는 효과를 얻고 4D 기록을 시작합니다. 4D 영화로 기록된 배아의 세포 계통을 복원하려면 계통 추적 소프트웨어를 열고 파일 및 새 프로젝트를 선택합니다.기록 온도에 따라 적절한 세포 계통 템플릿을 선택하고 스캔 횟수를 1500으로 설정합니다. 스캔 사이의 시간은 30초, 레벨 수는 30초, 레벨 간 거리는 1미크론입니다. 이미지 파일, 형식 및 이미지가 저장된 디렉토리를 선택합니다.이미지를 단일 이미지로 저장할지 다중 이미지 Z 스택으로 저장할지 선택하고 파일 이름 지정 및 이미지 형식을 설정합니다. 그런 다음 채널 처리 활성화를 클릭하여 4D 영화의 적절한 광 채널을 감지하고 설정합니다. 세포 계통 추적을 위해 세포 계통 추적 소프트웨어를 시작합니다.비디오 창과 세포 계통 창이 나타납니다. 계통 창에서 계통 분기를 선택하고 비디오 창에서 이 세포에 해당하는 세포핵을 클릭합니다. 4D 동영상을 앞뒤로 재생하거나 한 수준 위나 아래로 재생하여 시간이 지남에 따라 관심 셀을 공간적으로 따라갈 수 있습니다.주기적으로 세포핵을 클릭하여 계통 분기에 점을 생성하고 특정 시간에 세포의 공간 좌표를 등록합니다. 그 결과, 세포 계통 진행과 배아의 3D 재구성이 가능합니다. 그런 다음 Return 키를 눌러 유사분열을 표시하고 딸 세포 중 하나를 선택하여 방금 설명한 대로 세포 진행을 따릅니다.나머지 배아 세포에 대한 분석을 반복하여 전체 세포 계통을 추적하거나 세포사멸을 겪고 있는 세포와 같은 관심 세포를 추적합니다. 관심 있는 돌연변이 계통을 고정관념화된 야생형 C.elegans 세포 계통과 비교할 수 있도록 합니다. 웜 플레이트는 결로를 방지하기 위해 판지 상자 내에서 배양됩니다.기록이 완료되면 시연된 바와 같이 계통 추적 소프트웨어를 사용하여 세포 계통을 재구성할 수 있습니다. 예를 들어, 본 대표적인 분석에서, 추적된 gsr-1 돌연변이 배아 세포 계통을 예쁜꼬마선충 야생형 계통과 비교하였다. 그리고 배아 발달 동안 세포 주기의 점진적인 지연을 감지하는 것이 밝혀졌습니다.그 결과, 돌연변이 배아는 중간 단계에서 정지한 반면, 야생형 배아는 진행되어 마침내 유충으로 부화했습니다. 또한 세포사멸(apoptosis)과 같은 배아 발달의 다른 중요한 특징은 4D 현미경을 사용하여 동적으로 시각화할 수 있습니다. DIC 이미지의 계보 추적은 수동으로 처리해야 합니다.발달 초기 단계에서 가시광선에서 표시되지 않은 세포를 소프트웨어로 처리하는 것은 배아 분석에 정확하지 않습니다. 가시광선 현미경 분야에 이미지 인식 시스템을 적용하면 발생 생물학 분야에서 큰 발전을 이룰 것입니다.

4d-microscopy-unraveling-caenorhabditis-elegans-embryonic-development

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이미징 C. 엘레간스</emEpifluorescent 현미경과 오픈 소스 소프트웨어를 사용> 태아

이 문서는 선충류에 embryogenesis의 초기 이벤트의 시각화를위한 기술을...

상순 Embryogenesis의 시간 경과 현미경 Caenorhabditis 엘레간스

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

이 프로토콜은 이미지에 예쁜 꼬마 선충 배아의 조직 내에서 세포를 분할하는 방법에 대해 설명합니다. 여러 프로토콜은 초기 배아의 이미지 세포 분열에,이 프로토콜은 어떻게 중순 후반 배아 동안 개발 조직 내에서 세포 분열 이미지에 설명하는 방법을 설명하는 동안.

동안 Neuroblast 세포질 분열을 시각화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 배아

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

이 프로토콜은 배아 후 발달 전반에 걸친 미세유체 기반 예쁜꼬마선충(C. elegans ) 타임랩스 이미징을 설명합니다.

모든 유충 단계에서 이미징하는 고해상도 C. elegans

우리는 생식계열 독성을 평가하는 데 사용되는 선충 Caenorhabditis elegans에서 고처리량 화학 분석의 세부 단계를 설명합니다. 이 분석법에서는 화학 물질 노출에 따른 생식세포 기능의 중단을 이수성 배아에 특이적인 형광 리포터를 사용하여 모니터링합니다.

선충을 사용하여 생식선 화학 독성의 종합 평가<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

학습하세요 4D 현미경을 이용한 Caenorhabditis elegans 배아 세포 계통 추적 방법을. 노마르스키 광학으로 형광 표지 없이 발달 과정을 관찰하고, 돌연변이체와 야생형의 세포 주기를 비교 분석합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

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