4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

4D 현미경 검사는 C.elegans 배아 또는 기타 표본의 전체 세포 계통을 단일 세포 수준에서 재구성하는 데 유용한 도구입니다. Nomarski 광학 장치는 형질전환 동물이나 형광 현미경 검사 없이 표준 현미경과 투과광으로 개발 중 세포 모양 변화를 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 4D 현미경을 사용하면 예쁜꼬마선충 및 포유류 또는 조직 세포 배양과 같은 다른 시스템에서 세포 순환, 증식, 분화 및 세포사멸을 연구할 수 있습니다.

DIC 이미지에 대한 세포 계통 추적은 수동으로 수행됩니다. 시간이 많이 걸리고 전체 배아 분석을 수행하기 위해 약간의 연습이 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 연구실의 기술자인 Begona Ezcurra가 될 것입니다.

배아를 준비하기 전에 4D 현미경의 기록 온도를 섭씨 15도, 20도 또는 25도로 조정하고 각 스택의 시작 부분 사이에 30초 간격으로 1미크론 떨어진 1, 500, 30개의 초점면 z 스택을 기록하도록 현미경을 설정합니다. 다음으로, 500-1000 마이크로 리터의 액체 4.5 % 한천을 3 밀리미터 유리관에 분취하고 건조를 피하기 위해 왁스 필름으로 튜브를 조심스럽게 밀봉합니다. 녹음을 위해 얇고 균질한 한천 패드를 준비하려면 한천이 녹을 때까지 알코올 버너에서 한천을 조심스럽게 가열하고 분취한 다음 튜브를 섭씨 80도의 열 블록에 놓습니다.

유리 현미경 슬라이드를 플라스틱 조각에 놓고 한 손에 목초지 피펫을 사용하여 녹은 한천의 작은 방울을 슬라이드 중앙에 놓은 다음 즉시 다른 손을 사용하여 두 번째 슬라이드를 한천 방울에 올려 놓아 매우 얇은 한천 패드를 만듭니다. 배아를 장착하려면 먼저 피커를 사용하여 5-10개의 중력 자웅동체를 실체 현미경으로 물이 채워진 시계 제작자 유리로 옮깁니다. 메스를 사용하여 자웅동체 선충을 잘라 열고 자궁에서 1-4개의 초기 난자를 추출합니다.

한천 패드의 상단 슬라이드를 부드럽게 밀어 넣고 모세관 튜브를 사용하여 패드 중앙에 이른 달걀을 놓습니다. 이쑤시개 끝에 붙인 속눈썹을 사용하여 필요에 따라 달걀 위치를 조정하고 모세관 피펫을 사용하여 여분의 물을 제거합니다. 메스를 사용하여 준비 물 위에 커버 슬립을 천천히 비스듬히 드레이프한 다음 마이크로피펫을 사용하여 한천 패드 주변 공간의 3/4을 물로 채웁니다.

그런 다음 긴 녹음 기간 동안 건조를 방지하기 위해 커버 슬립을 바셀린으로 밀봉하십시오. 밀봉 후 슬라이드를 4D 현미경 스테이지에 놓고 저배율 대물렌즈를 사용하여 배아에 초점을 맞춥니다. 100X immersion objective를 선택하고 콘덴서의 초점을 맞춥니다.

콘덴서의 조리개를 완전히 열고 자기장 다이어프램을 닫아 더 높은 개구수와 더 큰 해상도를 제공합니다. Wollaston 프리즘을 돌려 한쪽 면에 조명이 비춰진 배아의 3차원 이미지를 얻은 다음 프리즘을 다른 방향으로 돌려 다른 면에 배아가 조명되는 효과를 얻고 4D 기록을 시작합니다. 4D 영화로 기록된 배아의 세포 계통을 복원하려면 계통 추적 소프트웨어를 열고 파일 및 새 프로젝트를 선택합니다.

기록 온도에 따라 적절한 세포 계통 템플릿을 선택하고 스캔 횟수를 1500으로 설정합니다. 스캔 사이의 시간은 30초, 레벨 수는 30초, 레벨 간 거리는 1미크론입니다. 이미지 파일, 형식 및 이미지가 저장된 디렉토리를 선택합니다.

이미지를 단일 이미지로 저장할지 다중 이미지 Z 스택으로 저장할지 선택하고 파일 이름 지정 및 이미지 형식을 설정합니다. 그런 다음 채널 처리 활성화를 클릭하여 4D 영화의 적절한 광 채널을 감지하고 설정합니다. 세포 계통 추적을 위해 세포 계통 추적 소프트웨어를 시작합니다.

비디오 창과 세포 계통 창이 나타납니다. 계통 창에서 계통 분기를 선택하고 비디오 창에서 이 세포에 해당하는 세포핵을 클릭합니다. 4D 동영상을 앞뒤로 재생하거나 한 수준 위나 아래로 재생하여 시간이 지남에 따라 관심 셀을 공간적으로 따라갈

주기적으로 세포핵을 클릭하여 계통 분기에 점을 생성하고 특정 시간에 세포의 공간 좌표를 등록합니다. 그 결과, 세포 계통 진행과 배아의 3D 재구성이 가능합니다. 그런 다음 Return 키를 눌러 유사분열을 표시하고 딸 세포 중 하나를 선택하여 방금 설명한 대로 세포 진행을 따릅니다.

나머지 배아 세포에 대한 분석을 반복하여 전체 세포 계통을 추적하거나 세포사멸을 겪고 있는 세포와 같은 관심 세포를 추적합니다. 관심 있는 돌연변이 계통을 고정관념화된 야생형 C.elegans 세포 계통과 비교할 수 있도록 합니다. 웜 플레이트는 결로를 방지하기 위해 판지 상자 내에서 배양됩니다.

기록이 완료되면 시연된 바와 같이 계통 추적 소프트웨어를 사용하여 세포 계통을 재구성할 수 있습니다. 예를 들어, 본 대표적인 분석에서, 추적된 gsr-1 돌연변이 배아 세포 계통을 예쁜꼬마선충 야생형 계통과 비교하였다. 그리고 배아 발달 동안 세포 주기의 점진적인 지연을 감지하는 것이 밝혀졌습니다.

그 결과, 돌연변이 배아는 중간 단계에서 정지한 반면, 야생형 배아는 진행되어 마침내 유충으로 부화했습니다. 또한 세포사멸(apoptosis)과 같은 배아 발달의 다른 중요한 특징은 4D 현미경을 사용하여 동적으로 시각화할 수 있습니다. DIC 이미지의 계보 추적은 수동으로 처리해야 합니다.

발달 초기 단계에서 가시광선에서 표시되지 않은 세포를 소프트웨어로 처리하는 것은 배아 분석에 정확하지 않습니다. 가시광선 현미경 분야에 이미지 인식 시스템을 적용하면 발생 생물학 분야에서 큰 발전을 이룰 것입니다.