Name: 피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 배우세요 트롬빈과 로즈벵갈을 이용한 수정된 광혈전 뇌졸중 모델로 tPA에 민감한 혈전을 생성하는 방법을. 이 모델은 fibrin과 혈소판이 혼합된 환자 유사 혈전을 만들어 임상 전 뇌졸중 연구와 혈전 용해 치료법 개발에 활용됩니다.

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이 연구는 NIH 보조금(NS108763, NS100419, NS095064 및 HD080429 C.Y. K.; 및 NS106592 Y.Y.S.)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 버지니아 대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 국립보건원(National Institutes of Health) 지침을 따릅니다. 그림 1A 는 이 프로토콜의 수술 절차를 간략하게 보여줍니다.
1. 수술 설정
<ol><li>수술 최소 15분 전에 온도를 37°C로 설정한 보온 패드를 작은 동물 어댑터에 놓습니다. 동물 머리를 회전할 수 있는 어댑터용 노즈 클립 롤을 준비합니다. 마취제 케타민(60mg/kg)/자일라진(10mg/kg)을 준비합니다.</li>
	<li>가위, 집게, 마이크로 바늘 홀더, 지혈제, 면봉 및 봉합사를 포함한 수술 도구를 오토클레이브로 멸균합니다(121°C, 15psi에서 60분). 티슈 접착제와 눈 연고를 준비합니다. 외과 의사를 위한 532nm 레이저 보호 고글을 준비합니다. 참고: 이 프로토콜은 주요 생존 수술 절차를 설명하며 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.</li>
	<li>532nm 레이저 소스로 조명 시스템을 설정합니다. 치과 드릴을 준비하십시오.</li>
	<li>로즈 벵골 용액을 식염수(10mg/mL)로 준비합니다. 부분 표본 소 트롬빈(0.1U/μL)을 얼음 양동이에 놓습니다.</li>
	<li>케토프로펜(4.0mg/kg)을 수술 30분 전에 진통제로 쥐에게 피하주사하거나 현지 기관 지침에서 권장하는 진통제 요법을 사용하십시오.</li>
</ol>2. 동측 총경동맥의 결찰
<ol><li>10-14주 된 수컷 C57BL/6NCrl 마우스를 22-30g의 케타민(60mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 근육 주사로 마취시킵니다. 참고: 뇌혈류 모니터링을 통한 동측 총경동맥 결찰을 포함하는 전체 수술 절차는 ~120분이 소요될 것으로 예상됩니다. 마취 요법은 일반적으로 이 전체 기간 동안 효과적이지만 마취 깊이는 최소 15분마다 재평가해야 합니다. 이러한 절차를 배우는 동안 마취제를 다시 투여해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>동물이 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 발가락 꼬집기를 수행합니다. CCA 결찰을 위해 왼쪽 목의 털을 제거하고 제모 크림으로 두개골을 얇게 하기 위해 머리를 제거합니다.</li>
	<li>앙와위 자세의 작은 동물 어댑터에 마우스를 놓습니다. 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 세 번 문질러 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>이어 바를 사용하여 마우스 헤드를 고정합니다. 해부 현미경으로 정중선 측면 약 0.2cm에서 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 0.5cm 왼쪽 경추를 절개합니다.</li>
	<li>한 쌍의 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 연조직과 근막을 떼어내어 왼쪽 총경동맥(LCCA)을 노출시킵니다. 한 쌍의 가늘고 부드러운 집게를 사용하여 왼쪽 CCA를 미주 신경에서 조심스럽게 분리합니다.</li>
	<li>20mm 세그먼트로 자른 5-0 실크 봉합사를 사용하여 LCCA 주위에 영구적인 이중 매듭 봉합사를 배치한 다음 멸균 상처 클립을 사용하여 상처를 봉합합니다.</li>
</ol>3. MCA 가지 위의 두개골이 얇아지고 광활성화
<ol><li>작은 동물 어댑터의 엎드린 자세로 마우스를 뒤집습니다. 노즈 클립 롤을 15° 돌립니다. 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 부위를 소독합니다.</li>
	<li>왼쪽 눈과 귀를 따라 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 두피를 0.8cm 절개하여 눈과 귀 사이에 위치한 측두근을 노출시킵니다(그림 1B).</li>
	<li>해부 현미경으로 한 쌍의 미세한 톱니 모양의 집게로 왼쪽 두정골의 측두근 가장자리를 따라 0.5cm를 절개합니다. 마이크로 가위로 측두근에 두 번째 0.3cm 수직 절개를 합니다. 측두근을 수축시켜 정수리골과 편평골의 가장자리를 노출시킵니다. 전두골과 두정골 사이의 관상동맥 봉합사의 랜드마크를 시각화해야 합니다(그림 1B,C).</li>
	<li>멸균 식염수를 발라 두개골에 수분을 공급하여 왼쪽 MCA를 드러냅니다. 마커 펜으로 편평 뼈의 근위 MCA 가지를 표시합니다. 공압 치과용 드릴(속도 조절기의 50%로 버 속도 설정)로 표시된 부위를 둘러싸고 직경 약 1mm의 원을 부드럽게 그린 다음 경막 아래쪽을 건드리지 않고 두개골을 약 0.2mm 깊이로 얇게 만듭니다. 매우 얇은 뼈 층이 남을 때까지 드릴링을 중지하십시오.</li>
	<li>쥐의 체중에 따라 트롬빈(T, 0.1 U/μL, 80 U/kg)과 로즈 벵골(RB, 10 mg/mL, 50 mg/kg) 용액을 혼합합니다. 예를 들어, 체중 25g의 마우스의 경우 20μL의 트롬빈(0.1U/μL)과 125μL의 RB(10mg/mL)를 혼합합니다.</li>
	<li>인슐린 주사기(#31G 바늘)를 사용하여 T+RB 용액(체중 25g당 145μL)을 후안와 부비동에 천천히 주입합니다. 참고: 파일럿 실험에서 표준 용량의 RB 염료(50mg/kg)와 혼합된 트롬빈 용량 증가의 사망률은 광활성화를 위해 검사되었습니다. 사망률은 80 U/kg 트롬빈(n=13)의 경우 0%, 120 U/kg 트롬빈(n=7)의 경우 43%, 160 U/kg(n=5) 및 200 U/kg 트롬빈(n=5)의 경우 100%였다. 따라서 80 U/kg 트롬빈의 투여량이 이 모델에 선택되었습니다. 또한 레이저 스페클 수축 이미징을 사용하여 T+RB의 역안와 부비동 주입 후 안와강 근처에서 만연한 혈액 응고의 가능성(보충 그림 1)과 레이저 조명을 받지 않은 반대쪽 반구의 광범위한 피브린 침착(보충 그림 2)을 배제했습니다.</li>
	<li>건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다.</li>
	<li>532분 동안 2인치 거리의 천공 부위에 0.5nm 레이저 광(2mW 에너지 포함)으로 조명기를 적용합니다. 레이저 보호 고글을 통해 MCA의 근위 분기에 대한 조명을 시각화합니다(그림 1C,D). 알림: 532nm 조명의 MCA는 고글 아래에 적색 형광을 보여줍니다. 원위 MCA는 10분 조명 후에 사라집니다. 20분 조명 후에도 원위 MCA 흐름이 여전히 존재하는 경우 동물을 제외합니다.</li>
	<li>20분 후에 레이저 조명을 중지합니다. 멸균 상처 클립으로 상처를 봉합합니다.</li>
</ol>4. 생체 내 이미징(옵션)
참고: 생체 내 혈전 형성을 특성화하려면 광활성화 시스템23이 있는 스핀 디스크 컨포칼에 의한 바이러스 내 이미징을 사용하십시오.
<ol><li>두개골의 두정골에 직경 ~ 3mm의 두개골 창을 만듭니다.</li>
	<li>두개골 창에 커버글라스를 놓고 20x 침수 대물렌즈 아래에서 원위 MCA(직경 ~50μm)를 찾습니다.</li>
	<li>이미징 전 5분에 DyLight488 접합 항 GPIbβ 항체(0.1mg/kg)의 꼬리 정맥 주사로 순환 혈소판을 라벨링합니다.</li>
	<li>트롬빈(80U/kg)과 로즈 벵골(50mg/kg)의 혼합물 용액을 이미징 전 5분에 역궤도로 주입합니다.</li>
	<li>직경 10μm의 레이저 빔이 있는 561nm 레이저 시스템을 사용하여 MCA를 광활성화하고 혈전이 형성될 때까지 이미지를 기록합니다.</li>
</ol>5. tPA 관리
<ol><li>마취된 동물을 37°C의 따뜻한 패드에 놓습니다. 선택한 광활성화 후 시점에서 ~45°C의 따뜻한 물로 거즈를 적시고 1분 동안 꼬리에 감습니다.</li>
	<li>재조합 인간 tPA(10mg/kg)를 꼬리 정맥을 통해 50% 볼루스로 주입하고 주입 펌프로 50분에 걸쳐 30%를 주입합니다. 참고: 급성 허혈성 뇌졸중 치료를 위한 재조합 인간 tPA의 임상 용량은 0.9mg/kg이지만, 종간 tPA 반응성 감소를 보상하기 위해 설치류에서 일반적으로 더 높은 용량(10mg/kg)이 사용됩니다. 또한 전임상 뇌졸중 모델에서 50%를 볼루스로 사용하고 50%를 꼬리 정맥을 통해 30분 동안 주입하는 tPA 투여의 표준 프로토콜을 따랐습니다.24</li>
</ol>6. 뇌혈류(CBF) 모니터링
참고: tPA 치료 후 CBF 회복을 확인하려면 2차원 레이저 스페클 조영 이미징 시스템(15 )을 사용하고 광혈전증 직후(3.9단계) 또는 tPA 치료 후 24시간에 기록합니다.
<ol><li>마취된 동물을 엎드린 자세로 놓고 두개골이 노출된 상태에서 두피에 정중선을 절개합니다.</li>
	<li>멸균 식염수로 두개골에 수분을 공급하고 초음파 젤을 두개골에 부드럽게 바릅니다. CBF 신호를 방해할 수 있는 젤의 머리카락과 기포를 피하십시오.</li>
	<li>10분 동안 레이저 스페클 콘트라스트 이미저에서 양쪽 대뇌 반구의 CBF를 모니터링합니다.</li>
	<li>CBF 이미지를 기록한 후 티슈 접착제로 두피를 봉합하고 동물을 케이지로 되돌립니다.</li>
	<li>선택한 영역의 CBF를 분석하고 반대측 영역과 비교하여 CBF 회수율을 계산합니다.</li>
	<li>그런 다음 회복을 위해 동물을 따뜻한 케이지에 다시 넣으십시오. 쥐가 마취에서 회복될 때까지 5-10분 동안 쥐를 모니터링합니다. 젖은 사료는 케이지에 넣어 동물 보호 시설에 반납합니다. 알림: 현지 기관 지침에서 권장하는 대로 수술 후 진통제를 제공하십시오.</li>
</ol>7. 트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색에 의한 경색 부피 측정
<ol><li>광혈전증 24시간 후, 비생존 수술에 대한 현지 기관 지침에 따라 동물을 깊이 마취합니다. 참고: 복강내(IP) 주사를 통해 트리브로모에탄올(avertin) 250mg/kg을 투여합니다.</li>
	<li>PBS로 심 경 관류를 수행하고 신선한 뇌를 수집하여 3 % 한천 젤에 포함시킵니다.</li>
	<li>뇌 절편을 1mm 두께로 비브라톰으로 절단하고 2% TTC 용액에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어에 의해 6개의 뇌 절편에서 발생한 총 경색 부피를 절대 부피로 정량화합니다. 참고: 뇌부종은 두 가지 이유로 결과 측정으로 사용되지 않았습니다. 첫째, TTC 염색은 부종보다 더 심각한 결과인 조직 생존율(미토콘드리아 환원 활성을 통해)을 측정합니다. 둘째, 경색이 진행됨에 따라 혈관성 부종과 세포독성 부종이 모두 발생하여 일반적인 뇌부종 측정법으로는 쉽게 구별할 수 없다. 그러나 항면역글로빈(IgG) 표지를 사용하여 혈액뇌장벽(BBB)의 무결성을 평가했으며, RB 및 T+RB 뇌졸중 모델 모두에서 광활성화 후 6시간에 유사한 IgG-유출을 발견했습니다(보충 그림 3).</li>
</ol>8. 혈전 형성 측정
참고: 혈전 형성을 측정하려면 광혈전증 후 1시간 및 2시간에 뇌를 수집하여 면역화학(IHC)에 의한 MCA의 혈전 측정과 면역블롯에 의한 뇌 반구의 피브린 측정을 각각 수행합니다.
<ol><li>응고 조성의 특성화를 위해 IHC를 수행합니다. 밤새 4% 파라포름알데히드로 뇌를 고정한 다음 OCT 임베딩을 위해 30% 자당으로 뇌를 탈수합니다.</li>
	<li>20μm 두께의 시상 방향으로 뇌를 절편하고 피브리노겐, 혈소판(당단백질 IIb), 적혈구(TER119) 및 혈관(이솔렉틴 GS-IB4)에 대한 특이 항체로 IHC를 수행합니다.</li>
	<li>피브리노겐에 대한 항체로 면역블롯에 의한 뇌 반구의 피브린 측정을 수행합니다.</li>
</ol>

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1985년에 도입된 전통적인 RB 광혈전 뇌졸중은 간단한 수술 절차, 낮은 사망률 및 높은 뇌경색 재현성을 위한 국소 뇌허혈의 매력적인 모델입니다. 5 이 모델에서, 광역학적 염료 RB는 광 여기시 혈소판을 빠르게 활성화하여 혈관을 막는 조밀 한 응집체를 유도합니다 5,8,23. 그러나, RB 유도 혈전 내 소량의 피브린(그림 2)은 허혈성 뇌졸중 환자에서 급성으로 회수된 혈전의 우성 혈소판:피브린 혼입 패턴에서 벗어난다21,22. RB 유도 혈전의 낮은 피브린 함량은 tPA 용해 치료에 대한 회복력에도 기여할 수 있습니다 7,8,1...

혈관 내 혈전제거술과 tPA 매개 혈전용해술은 미국 식품의약국(FDA)이 승인한 급성 허혈성 뇌졸중 치료법 중 유일하게 두 가지로, 미국에서 매년 ~700,000명의 환자를 괴롭히고 있습니다1. 혈전절제술은 대혈관 폐색(LVO)으로 제한되기 때문에 tPA 혈전용해술은 소혈관 폐색을 완화할 수 있지만, 둘 다 급성 허혈성 뇌졸중의 중요한 치료법이다2. 또한, 두 치료법의 조합(예: 뇌졸중 발병 후 4.5시간 이내에 tPA-혈전용해술을 시작한 후 혈전절제술을 시행)은 재관류와 기능적 결과를 개선한다3. 따라서 혈전용해술을 최적화하는 것은 혈전제거술의 시대에도 뇌졸중 연구의 중요한 목표로 남아 있습니다.
혈전색전증 모델은 혈전용해 요법을 개선하는 것을 목표로 하는 전임상 뇌졸중 연구에 필수적인 도구입니다. 이는 기계적 혈관 폐색 모델(예: 내강 내 봉합사 MCA 폐색)은 혈전을 생성하지 않으며, 기계적 폐색 제거 후 대뇌 혈류의 빠른 회복이 지나치게 이상화되어 있기 때문이다 4,5. 현재까지 주요 혈전색전증 모델에는 광혈 전증 6,7,8, 국소 염화제2철(FeCl3) 적용9, MCA 분지(10,11)로의 트롬빈 미세주입, MCA 또는 총경동맥(CCA)에 체외(미세)색전증 주입(CCA)12,13,14 및 일과성 저산소증-허혈(tHI)15,16, 17,18. 이러한 뇌졸중 모델은 혈전의 조직학적 조성과 tPA 매개 용해 요법에 대한 민감도가 다릅니다(표 1). 또한 개두술의 외과적 요구 사항(제자리 트롬빈 주사 및 FeCl3의 국소 적용에 필요), 경색 크기 및 위치의 일관성(예: 미세색전의 CCA 주입은 매우 다양한 결과를 산출함) 및 심혈관계에 대한 전반적인 효과(예: tHI는 저산소증으로 인한 말초 혈관 확장을 보상하기 위해 심박수 및 심박출량을 증가시킴)에 따라 다릅니다.
RB 염료 기반 광혈전 뇌졸중(PTS) 모델은 개두술이 필요 없는 간단한 수술 절차, 낮은 사망률(일반적으로 < 5%), 예측 가능한 경색의 크기 및 위치(MCA 공급 영역에서) 등 많은 매력적인 기능을 가지고 있지만 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 8 첫 번째 주의 사항은 tPA 매개 혈전용해 치료에 대한 반응이 약하거나 전무하다는 것인데, 이는 FeCl3 모델 7,19,20의 단점이기도 합니다. PTS 및 FeCl3 뇌졸중 모델의 두 번째 주의 사항은 이어지는 혈전이 소량의 피브린과 함께 조밀하게 포장된 혈소판 응집체로 구성되어 있어 tPA 용해 요법에 대한 회복력을 유발할 뿐만 아니라 급성 허혈성 뇌졸중 환자에서 혼합된 혈소판:피브린 혈전의 패턴에서 벗어난다는 것입니다21,22. 대조적으로, 제자리 트롬빈-미세주사 모델은 주로 중합된 피브린과 불확실한 혈소판 함량을 포함한다(10).
위와 같은 추론을 감안할 때, 얇아진 두개골을 통한 MCA 표적 광활성화를 위해 RB와 트롬빈의 아혈전 용량을 혼합하면 결과 혈전의 피브린 성분이 증가하고 tPA 매개 용해 치료에 대한 민감도가 높아질 수 있다는 가설을 세웠습니다. 우리는 이 가설을 확인했으며,23 여기에서 변형된(T+RB) 광혈전 뇌졸중 모델의 세부 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드 (TTC)</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>경색</td></tr><tr><td>4-0 나일론 모노필라멘트 봉합</td>사 <td>LOOK</td><td>766B</td><td>수술 용품</td></tr><tr><td>5-0 실크 봉합</td>사 <td>하버드 기구</td><td>624143</td><td>수술 용품</td></tr><tr><td>543nm 레이저 빔</td><td>Melles Griot</td><td>25-LGP-193-249</td><td>광혈전증</td></tr><tr><td>성인 수컷 마우스</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6</td><td>10~14주령(22~30g)</td></tr><tr><td>마우스 어댑터 기계 공장용 마취 바</td><td>, UVA</td><td></td><td>수술 설정</td></tr><tr><td>Avertin(2, 2, 2-Tribromoethanol)</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>안락사</td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>Dentamerica</td><td>Rotex 782</td><td>수술 설정</td></tr><tr><td>디지털 현미경</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>뇌 영상</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td>수술 설정</td></tr><tr><td>미세 곡선 겸자 (톱니 모양)</td> <td>FST</td><td>11370-31</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>미세 곡선 집게 (매끄럽게)</td> <td>FST</td><td>11373-12</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>면역 조직 화학</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito 지혈 FST</td><td></td><td>13008-12</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>온난화 패드가 있는 히트 펌프</td><td>Gaymar</td><td>TP700</td><td>외과 설정</td></tr><tr><td>주입 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>200</td><td>혈전용해 치료</td></tr><tr><td>인슐린 주사기 31G 바늘</td><td>BD</td><td>328291</td><td>광혈전증</td></tr><tr><td>케타민</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>레이저 보호 구글 532nm</td><td>Thorlabs</td><td>LG3</td><td>광혈전증</td></tr><tr><td>케토 프로펜</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>NSAID 진통</td></tr><tr><td>마이크로 바늘 홀더</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>수술 기구</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 혈류 이미저</td><td>Moor</td><td>780nm 레이저 소스</td><td>레이저 반점 대비</td></tr><tr><td>이미징 마우스 어댑터</td><td>RWD</td><td>68014</td><td>수술 설정</td></tr><tr><td>Puralube Vet 연고</td><td>Fisher</td><td>NC0138063</td><td>안구 건조 예방</td></tr><tr><td>견인기 팁</td><td>Kent Scientific</td><td>Surgi-5014-2</td><td>수술 설정</td></tr><tr><td>Rose Bengal</td><td>Sigma</td><td>198250</td><td>광혈전증</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T7513</td><td>광혈전증</td></tr><tr><td>조직 접착제</td><td>Abbott Laboratories</td><td>NC9855218</td><td>수술 용품</td></tr><tr><td>tPA</td><td>Genetech</td><td>Cathflo 활성효소 2mg</td><td>혈전용해 치료</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>TTC infacrt</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>CCM, UVA</td><td></td><td>마취</td></tr></tbody></table>

피브린이 풍부하고 tpa에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

이상적인 혈전색전증 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 비교적 간단한 수술 절차, 일관된 경색 크기 및 위치, 환자와 유사한 혈소판:피브린 혼합 혈전의 침전, 섬유소 용해 치료에 대한 적절한 민감성 등 특정 특성을 필요로 합니다. 로즈 벵골(RB) 염료 기반 광혈전 뇌졸중 모델은 처음 두 가지 요구 사항을 충족하지만 혈소판은 풍부하지만 피브린이 부족한 혈전 구성으로 인해 tPA 매개 용해 처리에 매우 내화성이 있습니다. 우리는 중뇌동맥(MCA)의 근위 가지를 겨냥한 광활성화를 위한 RB 염료(50mg/kg)와 트롬빈(80U/kg)의 혈전 미만 용량의 조합이 피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 혈전을 생성할 수 있다고 추론합니다. 실제로, 트롬빈과 RB(T+RB)의 결합 광혈전증 모델은 면역염색 및 면역블롯에서 볼 수 있듯이 혼합혈소판:피브린 혈전을 유발하고 일관된 경색 크기와 위치와 낮은 사망률을 유지했습니다. 또한, 광활성화 후 2시간 이내에 tPA(Alteplase, 10mg/kg)를 정맥 주사하면 T+RB 광혈전증의 경색 크기가 유의하게 감소했습니다. 따라서, 트롬빈-강화 광혈전 뇌졸중 모델은 새로운 혈전용해 요법을 시험하기 위한 유용한 실험 모델이 될 수 있다.

먼저, RB와 T+RB 광혈전증 유발 혈전의 피브린 함량을 비교했습니다. 마우스는 광활성화 후 2시간에 고정제의 심경 관류에 의해 희생되었고, 뇌는 종평면 및 횡평면에서 MCA 가지의 면역형광 염색을 위해 제거되었습니다. RB 광혈전증에서 MCA 가지는 CD41+ 혈소판과 작은 피브린으로 조밀하게 채워져 있었습니다(그림 2A,C). 대조적으로, T+RB 광혈전증의 MCA 가지는 무작위로 혼합된 혈소판:피브린 응고에 의해 폐색되었습니다(그림 2B,D, 각각에 대한 n&gt;3). 또한 면역블롯을 사용하여 광활성화 후 2시간에 식염수로 심 경관류를 한 후 두 모델 간의 대뇌 피질의 피브린(오겐) 수준을 비교했습니다. 이 분석은 RB 광혈전증&gt; 비해 T+RB의 동측 반구에서 피브린 침착이 2배 증가했음을 보여주었습니다(<strong class=...

기존의 광혈전제 뇌졸중(PTS) 모델은 주로 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 용해 치료에 대한 내성이 높은 고밀도 혈소판 응집체를 유도합니다. 여기서 변형된 쥐 PTS 모델은 광활성화를 위해 트롬빈과 감광성 염료를 함께 주입하여 도입됩니다. 트롬빈 강화 PTS 모델은 혼합 혈소판:피브린 응고를 생성하며 tPA 혈전용해에 매우 민감합니다.

피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

우리는 환자 샘플과 유사한 혈전을 생성하고 임상적 관련 혈전용해 요법에 반응하는 뇌졸중 모델을 만들고자 합니다. 따라서 우리는 고전적인 광혈전 뇌졸중 모델을 수정하고 광활성화 전에 트롬빈과 광역학적 염료 로즈 벵골을 혼합합니다. 우리는 이 시술이 실제로 tPA 매개 혈전용해에 매우 민감한 혈전을 생성한다는 것을 기쁘게 생각합니다.이 수정된 광혈전 뇌졸중 모델은 사망률이 낮은 매우 간단한 수술 절차를 사용하여 매우 일관된 경색 크기와 위치를 생성했습니다. 또한 급성 뇌졸중 환자와 유사한 피브린과 혈소판이 혼합된 혈전이 생성됩니다. 따라서 전임상 뇌졸중 연구에서 보다 효과적인 혈전용해 치료법을 개발하는 데 매우 유용하다고 생각합니다.더 많은 사람들이 우리 모델을 사용하기를 바랍니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 그룹의 연구 조교수인 Dr.Yu-Yo Sun이 될 것입니다. 수술 30분 전에 진통제를 주사하여 쥐를 준비합니다.마우스를 마취한 후 발가락 꼬집기를 수행하여 완전히 마취되었는지 확인합니다. 그런 다음 제모 크림으로 왼쪽 목과 머리의 털을 제거합니다. 작은 동물 어댑터에 마우스를 누운 자세로 놓고 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 피부 부위를 소독합니다.해부 현미경으로 정중선 측면 약 0.2cm에서 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 0.5cm 왼쪽 경추를 절개합니다. 그런 다음 미세한 톱니 모양의 집게를 사용하여 연조직과 근막을 당겨 LCCA를 노출시킵니다. 그런 다음 한 쌍의 가늘고 부드러운 집게를 사용하여 LCCA를 미주 신경에서 조심스럽게 분리합니다.5-0 실크 봉합사를 사용하여 LCCA 주위에 영구적인 이중 매듭 봉합사를 놓습니다. 마우스를 엎드린 자세로 뒤집고 노즈 클립 롤을 15도 회전합니다. 그런 다음 베타딘과 70% 에탄올을 번갈아 세 번 번갈아 가며 문질러 수술 부위를 소독합니다.왼쪽 눈과 귀를 따라 마이크로 가위와 직선 집게를 사용하여 두피를 0.8cm 절개하여 측두근을 노출시킵니다. 다음으로 왼쪽 두정골의 측두근 가장자리를 따라 0.5cm 절개합니다. 그런 다음 측두근을 0.3cm 수직으로 절개하고 근육을 수축시켜 정수리골과 편평골의 가장자리를 노출시킵니다.전두골과 두정골 사이의 관상동맥 봉합사의 랜드마크를 시각화해야 합니다. 다음으로, 멸균 식염수를 발라 두개골을 적셔 왼쪽 MCA를 드러내고 편평 뼈의 근위 MCA 가지를 마커로 표시합니다. 공압 치과 드릴로 이 표시된 영역을 둘러싸는 직경 1mm의 원을 부드럽게 그립니다.그런 다음 두개골 아래쪽을 건드리지 않고 약 0.2mm 깊이로 두개골을 얇게 만듭니다. 매우 얇은 뼈 층이 남아 있으면 드릴링을 중지하십시오. 다음으로, 쥐의 체중에 따라 트롬빈과 로즈 벵골 용액을 혼합하고 31게이지 바늘로 혼합물을 후안와 부비동에 천천히 주입합니다.건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 눈 연고를 바릅니다. 2인치 거리 내에서 천공된 부위에 532나노미터 레이저 광으로 조명기를 20분 동안 적용합니다. 레이저 프로젝션 고글을 통해 MCA의 근위 분기에서 조명을 시각화합니다.20분 후 레이저 조명을 멈춥니다. 두개골의 두정골에 직경 3mm의 두개골 창을 만들고 그 위에 덮개 유리를 놓습니다. 그런 다음 20x 침수 대물렌즈 아래에서 원위 MCA를 찾습니다.이미징 5분 전에 DyLight 488 접합 항-GP1b-베타 항체의 꼬리 정맥 주사로 순환 혈소판에 라벨링합니다. 그런 다음 트롬빈과 로즈 벵골 용액 혼합물을 역궤도로 주입합니다. 직경 10마이크로미터의 레이저 빔이 있는 532나노미터 레이저 시스템을 사용하여 MCA를 광활성화하고 혈전이 형성될 때까지 이미지를 기록합니다.tPA 투여를 위해 마취된 동물을 섭씨 37도의 따뜻한 패드에 놓습니다. 선택한 광활성화 후 시간 지점에서 섭씨 45도의 따뜻한 젖은 거즈로 꼬리를 1분 동안 감쌉니다. 다음으로, 꼬리 정맥을 통해 재조합 인간 tPA를 주입합니다.50%를 볼루스로 주입하고 나머지 50%를 주입 펌프를 사용하여 30분에 걸쳐 주입합니다. 뇌 혈류를 모니터링하려면 두개골이 노출된 두피에 정중선을 절개합니다. 멸균 식염수로 두개골에 수분을 공급하고 초음파 젤을 부드럽게 바르고 젤에 머리카락이나 기포가 생기지 않도록 합니다.10분 동안 레이저 스페클 콘트라스트 이미저 아래에서 양쪽 대뇌 반구의 대뇌 혈류를 모니터링합니다. 면역형광 표지는 로즈 벵골 염료 기반 광혈전증에서 MCA 가지가 CD41 양성 혈소판과 약간의 피브린으로 조밀하게 채워져 있음을 보여줍니다. 대조적으로, 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증에서 MCA 가지는 무작위로 혼합된 혈소판과 피브린 혈전에 의해 폐색되었습니다.면역블로팅 분석 결과, 로즈 벵골 단독에 비해 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증의 동측 반구에서 피브린 침착이 2배 이상 증가한 것으로 나타났습니다. 컨포칼 현미경 기반 생체 내 이미징은 정맥 주사 트롬빈 주사가 레이저 조명 아래에서도 혈소판 응집체를 유도하지 못하는 것을 보여주었습니다. 혈소판은 로즈 벵골 광혈전증 모델에서는 균질한 응고를 형성했지만, 트롬빈과 로즈 벵골 모델에서는 여러 희미한 영역을 가진 고르지 않은 응집체를 형성했습니다.tPA 치료 전 및 24시간 후 동일한 마우스의 CBF와 차량 치료 대비 레이저 스페클 조영제 이미징으로 측정하고 반대측 반구로 정규화했습니다. 로즈 벵골 광혈전증에서 tPA 치료는 특히 차량 처리 마우스에 비해 허혈성 경계 영역에서 CBF 회복 추세를 이끌었습니다. 트롬빈 플러스 로즈 벵골 광혈전증에서, tPA 처리 마우스에서 CBF의 회복이 더 두드러졌으며, 근위 MCA 가지가 종종 24시간에 가시화되었습니다.로즈 벵골 광혈전증(rose bengal photothrombosis)의 경우, 비히클 처리된 마우스와 tPA를 처리한 마우스에서 유사한 경색 크기가 검출되었습니다. 대조적으로, 트롬빈과 로즈 벵골 광혈전증의 경우, tPA 용해 처리는 0.5시간, 1시간 또는 2시간에 경색을 유의하게 감소시켰지만, 비히클 처리된 마우스에 비해 광활성화 후 6시간에는 감소하지 않았으며, 이 과정에서 혈전 형성에 혈전 형성에 중요한 혈전 매개 피브린 생성이 중요합니다. 이 방법은 혈전 조성을 조사하고 혈전 용해 치료를 추가로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.이 시술 후, 혈전용해 요법의 다른 방법을 적용할 수 있고 나중에 효능을 결정할 수 있습니다. 트롬빈을 첨가하면 혈전 조성을 피브린 부족에서 피브린 풍부로 조정할 수 있어 연구자들이 임상적으로 관련된 치료 전략을 개발할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 감광성 염료 투여 후 손상되지 않은 두개골의 레이저 조명으로 마우스 모델에서 광혈전 스트로크를 생성하는 절차를 보여줍니다.

마우스 모델의 광혈전성 스트로크 모델링: 광혈전증을 유발하기 위해 감광성 염료 투여 후 마우스 두개골을 통한 레이저 조명 기술

Photothrombosis 매우 재현성 방식으로 관심 분야의 작은 잘 구분 경색을 유도하기위한 빠르고, 최소 침습 기술입니다. 그것은 형질 전환 생쥐에서 뇌의 가소성을 기본 세포 및 분자 반응 연구를 위해 특히 적당하다.

Photothrombotic 국소 빈혈 : 마우스 스트로크 연구를위한 최소 침습 및 재현성 광화학 대뇌 피질의 병변 모델

여기에서는 생체 내 마우스의 체성 감각 피질에서 Rose Bengal 광혈전 혈전을 유도하기 위한 반침습적 광학 현미경 접근 방식을 설명합니다.  이미징 절차의 기술적 측면은 광혈전 이벤트의 유도에서 적용 및 데이터 수집에 이르기까지 설명됩니다.

공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis<em&gt; 생체</em&gt; : 단일 선박 스트로크의 모델

혈전색전성 뇌졸중 모델은 재개통 치료를 최적화하기 위한 중요한 도구입니다. 본 연구에서는 혈전증 및 경색을 유발하는 일과성 대뇌 저산소성 허혈성(tHI) 모욕에 기초한 쥐 혈전성 뇌졸중 모델을 보고하며, 뇌졸중 환자와 유사한 치료 창에서 조직 플라스미노겐 활성제(tPA) 매개 섬유소용해에 호의적으로 반응합니다.

과도 대뇌 저산소증 - 허혈을 기반으로 혈전 성 뇌졸중 모델

이 원고는 캡슐 경색의 모델링 기법에 대해 설명합니다. 여기에서 우리는 미리 수술 대상 매핑​​ 후 빛의 낮은 강도와​​ 변형 photothrombotic 기술을 이용했다. 이 기술을 사용하여, 우리는 지속적인 운동 장애 외접 캡슐 경색 모델을 만들었습니다.

Photothrombotic 기술을 이용하여 외접 캡슐 경색 모델링

우리는 혈전 형성을 폐쇄하는 시간을 모니터링하는 생체 내에 현미경을 사용하여 효율적 특징으로하는 정제 된 철 클로라이드 (50ml을) 경동맥 및 장간막 동맥에 유도 된 혈전증 모델의 절차뿐만 아니라 정맥을보고한다.

철 염화물에 의한 쥐 혈전증 모델

여기에 설명된 광혈증 뇌졸중 모델은 감광성 염료투여 후 레이저 조명을 이용하여 영구 미생물 폐색을 유도하여 손상되지 않은 두개골을 통해 뇌졸중이 생성된다.

마우스에서 뇌졸중 모델링: 포심 피질 병변

모든 광학 접근 방식을 사용하여 허혈성 뇌졸중을 유도하는 동시에 깨어 있고 행동하는 마우스의 새로운 뇌졸중 코어에서 형광 바이오센서를 사용하여 신경 Ca2+ 활동을 기록합니다.

행동하는 마우스에서 허혈성 뇌졸중을 유도하고 모니터링하기 위한 동시 광혈전증 및 섬유 측광

혈전색전성 뇌졸중을 모방하기 위해 이종 쥐 혈액으로 만든 색전을 중뇌동맥에 주입한 후, 재관화를 위한 전신 혈전용해술을 투여하였다. 이 모델은 다중 실험실 네트워크에서 최적화되어 여러 후보 치료제를 테스트할 수 있습니다.

뇌졸중 전임상 평가 네트워크 혈전색전성 뇌졸중 및 혈전용해 다중 실험실 모델: TE-MCAo

이 프로토콜은 바이러스 전달, 광혈전 이식, 광혈전 유도, 성상교세포 및 신경세포 활동의 동시 기록, 성상교세포의 광유전학적 자극을 포함하는 통합 방법을 제공합니다. 이 통합 방법은 허혈성 뇌졸중의 급성기부터 만성기까지의 성상교세포-뉴런 관계를 동시 조사하는 것을 목표로 합니다.

광혈전성 뇌졸중 모델링과 행동하는 쥐의 신경 및 성상세포 활동의 생체 내 옵트로드 기록을 위한 통합 방법

배우세요 트롬빈과 로즈벵갈을 이용한 수정된 광혈전 뇌졸중 모델로 tPA에 민감한 혈전을 생성하는 방법을. 이 모델은 fibrin과 혈소판이 혼합된 환자 유사 혈전을 만들어 임상 전 뇌졸중 연구와 혈전 용해 치료법 개발에 활용됩니다.

피브린이 풍부하고 tPA에 민감한 광혈전 뇌졸중 모델

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