세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양
2021년 2월 6일
우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.
우리의 프로토콜은 자궁 내 감염및 새로운 처리 효과의 병발생을 연구하기 위하여 마우스 눈에 미생물 및 치료에이전트의 재현가능한 소개를 허용합니다. 우리의 기술은 마우스 모형에 안구 감염을 설치할 수 있고 미생물의 양, 호스트 면역 반응, 감염 관련 숙주 및 병원체 유전자 발현 및 새로운 처리 효력을 용이하게 합니다. 주사 부위의 시각화, 바늘 각도 및 전달은 이 기술의 성공적인 실행에 매우 중요하며 적절한 눈 수확은 감염 매개 변수의 정량화에 필수적입니다.
생물 안전 수준 2 시설에서 는 10 밀리리터 스냅 캡 튜브에 BHI 국물의 5 밀리리터를 추가하고 멸균 루프를 사용하여 오거 플레이트 배양에서 5 밀리리터의 국물에 B.cereus 식민지 를 전송합니다. 짧은 소용돌이 후, 18 시간 동안 분당 200 회전에서 섭씨 37도 회전 인큐베이터에서 샘플을 배양. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 BHI의 10 밀리리터에서 마이크로 리터 농도 당 200 식민지 형성 단위로 배양을 희석하고, 소용돌이 후, 얼음에 1.5 밀리리터 미세 센심분리기 튜브에 갓 희석 배양의 1 밀리리터를 추가합니다.
인트라비탈 주사의 경우 마이크로인젝터를 켜고 마이크로인젝터에 부착된 압축 공기 탱크의 가스 밸브를 엽니다. 화면이 밸런스가 표시될 때까지 마이크로인젝터에서 모드를 누릅니다. 균형을 누르고 컴퓨터 마우스를 작동 테이블에 놓습니다.
스테인레스 스틸 파이펫 홀더를 인젝터의 채우기 출력에 부착된 튜브에 연결하고 코브레드 유리 모세관 파이펫 팁 바늘 주위의 파이펫 홀더 커넥터를 단단히 나사로 고정하여 피펫 홀더의 다른 쪽 끝에 모세관 바늘을 삽입할 수 있습니다. 안과 현미경을 켜고 발광 강도를 50%로 설정하여 현미경을 절차 부위에 배치하고 현미경을 원하는 초점으로 조정합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 코를 오른쪽으로 가리키는 의료 언더 패드에 마취 마우스를 왼쪽에 놓습니다.
안과 현미경 목표를 통해 오른쪽 눈을 찾아 주사 부위를 노출하기 위해 눈의 양쪽에 역작용 집게의 집게를 배치한다. 왼쪽은 마이크로인젝터에 연결된 마우스를 클릭하여 제조된 모세관 바늘을 희석된 박테리아 용액으로 채우고, 왼손으로 머리를 고정하고, 바늘의 끝을, 비스벨 쪽을 눈의 변두리에서 놓습니다. 바늘을 45도 각도로, 바늘의 날카로운 끝의 0.5 밀리미터만 삽입되는 것을 주의하여 눈을 뚫습니다.
바늘 팁이 삽입되면 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 마우스 패드에 마우스 패드를 클릭하여 B.cereus 용액의 0.5 마이크로 리터를 주입하십시오. 누출을 방지하기 위해 제거하기 전에 2~3초 동안 마우스 눈 안쪽에 바늘 끝을 두고 포셉을 풀어 주면 눈이 소켓으로 다시 들어갑니다. 마우스를 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링하여 온난화 패드의 복구 케이지로 옮길 수 있습니다.
적절한 실험 적 끝점에서, 얼음에 눈 당 표시 된, 자동 화 수확 튜브에 프로테아제 억제제로 보충 PBS의 400 마이크로 리터를 추가하고 감염된 눈의 양쪽에 열린 미세 팁 집게를 배치합니다. 팁을 머리 쪽으로 아래로 밀어 눈을 전파합니다. 집게가 눈 의 세계 뒤에 있으면 집게를 함께 짜내고 머리에서 집게를 당겨 안구를 분리하십시오.
그런 다음 즉시 적절하게 표시된 수확 튜브에 안구를 놓습니다. 샘플 수집 60분 이내에 폐쇄된 수확 튜브를 조직 균질화기에 넣고 30초의 휴식 기간을 가진 2분, 1분 의 균질화 기간 동안 샘플을 균질화합니다. 균질화 후, 얼음에 샘플을 놓고 20 마이크로리터 알리쿼트의 균질화를 사용하여 희석당 PBS의 180 마이크로리터에서 시료를 일련 적으로 희석하여 1배 10~음수 8에 도달한다.
다음으로, 적절한 희석 농도로 정사각형 미리 따뜻해지는 BHI 플레이트의 각 행에 라벨을 붙이고, 플레이트가 45도 각도로 기울어져 있는 경우, 각 희석제 10마이크로리터를 플레이트 상단의 개별 행에 추가합니다. 접시를 평평하게 놓기 전에 각 샘플이 접시 바닥에 거의 도달할 때까지 실행합니다. 샘플이 한천에 흡수되면 플레이트를 섭씨 37도인큐베이터로 옮기습니다.
식민지는 배양 8 시간 후에 보이기 시작해야 합니다. 샘플의 농도를 정확하게 표현하려면 10~100개의 콜로니가 있는 행을 계산합니다. beveled 유리 바늘 팁의 건설은 마우스 눈의 중간 유리체로 박테리아를 전달하는 데 중요합니다.
이 심상에서, 혈액 한천 접시와 국물 배양 튜브에서 성장하는 바실러스 세레우스가 표시됩니다. 이 그래프에 도시된 바와 같이 10시간 후 감염 시 5개의 상이한 마우스 눈에서 10시간 사이 10시간, 제7식민지 형성 단위에서 세균의 형성 단위는 전형적으로 단일 감염된 눈으로부터 회복될 수 있다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 마우스 눈에 박테리아의 적절한 양을 주입하는 것입니다.
이 절차에 따라, 우리는 조직학에 의해 염증을 연구 할 수 있습니다, ELISA에 의한 염증 중재자, 높은 처리량 RNA 시퀀싱에 의해 유전자 발현이 질병의 발병의 더 나은 이해를 용이하게.
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개요
이 기사는 세균성 말초염의 마우스 모델에서 안구내 주사 및 세균 정량화 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 안구 내 감염을 연구하고 새로운 치료 효과를 평가하도록 설계되었습니다.
주요 연구 요소
과학 영역
- 신경과학
- 전염병
- 면역학
배경
- 안구 감염은 심각한 시력 상실로 이어질 수 있습니다.
- 숙주 면역 반응을 이해하는 것이 치료 개발에 중요합니다.
- 마우스 모델은 안구 질환 연구에 일반적으로 사용됩니다.
- 미생물 정량화는 감염 심각도 평가에 도움이 됩니다.
연구 목적
- 마우스 눈에 미생물을 도입하는 재현 가능한 방법을 확립합니다.
- 감염과 관련된 숙주 면역 반응 및 유전자 발현을 측정합니다.
- 새로운 치료제의 효과를 평가합니다.
사용된 방법
- 미생물 도입을 위한 안구내 주사 기술.
- 박테리아 배양을 위한 BHI 육즙의 사용.
- 감염 매개변수의 정량적 평가.
- 주사 부위 및 적절한 기술 실행의 시각화.
주요 결과
- 마우스 모델에서 안구 내 감염의 성공적인 확립.
- 미생물 부하 및 면역 반응에 대한 정량적 데이터 얻음.
- 감염 중 숙주 및 병원체 유전자 발현에 대한 통찰.
- 치료 효과의 평가가 입증됨.
결론
- 이 프로토콜은 안구 내 감염을 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 숙주-병원체 상호작용의 이해를 촉진합니다.
- 안구 감염에 대한 새로운 치료 전략 개발을 지원합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Reproducible intravitreal injection and quantitative infection assessment in mouse models enable rigorous evaluation of intraocular infection mechanisms and therapeutic interventions. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking for ocular anti-infective drug discovery. Quantitative outputs and standardized procedures facilitate translational continuity and portfolio triage in ophthalmic R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of host-pathogen interactions and immune response pathways in a controlled in vivo system.
- Supports functional validation of therapeutic targets by quantifying infection and immune parameters.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking bacterial load to host gene expression and inflammatory mediators.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo platform for evaluating anti-infective compounds and delivery strategies.
- Standardizes infection quantitation via CFU enumeration, supporting reproducibility and assay comparability.
- Generates quantitative readouts suitable for downstream screening and efficacy assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for translational biomarker discovery and preclinical validation.
- Enables continuity from mechanistic studies to preclinical efficacy testing in ocular infection models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust infection and immune response data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for ocular anti-infective development, bridging mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on infection mechanisms and immune modulation in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection metrics for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of bacterial load, immune mediators, and gene expression across conditions.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for biomarker and efficacy studies in ocular infection.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable platform for diverse anti-infective and immunomodulatory research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic understanding of ocular infections.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of infection modeling and quantitation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in ophthalmic portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical injection and animal model handling.
- Demands access to microinjectors, ophthalmic microscopes, and tissue homogenization infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of injection, harvest, and quantitation protocols.
- Adaptation may be needed for different pathogens or mouse strains as supported by the protocol.
- Careful volume control and technique are critical to ensure reproducibility and data integrity.
