Name: 쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 학습하세요 쥐 골격 근육에서 섬유 선화(FAP) 및 근생 전구자(MP)를 격리하고 특성화하는 방법을. 콜라게나제 처리와 유세포 분석을 통해 근육 재생 및 섬유화 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 오타와 대학과 생물 의학 에 대한 키난 연구 센터 (KRC), 세인트 마이클스 병원 유니티 건강 토론토의 전문 지식과 이 원고에 제시 된 흐름 세포측정 / FACS 프로토콜의 최적화에 대한 지도에 감사드립니다 흐름 세포 측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이 작품은 JB에 디자인 새로운 아이디어 2018 기금 (MbDNI-2018-01)에 의해 의학에 의해 투자되었다.

저자는 공개 할 충돌이 없습니다.

쥐 근육에 대 한 최적화 된, 검증 된 FAP 격리 프로토콜은 생물학적 또는 기술적 인 이유로 마우스에서 가능 하지 않는 부상 모델을 공부 하고자 하는 연구자에 대 한 필수적이다. 예를 들어, 마우스는 만성 국소, 또는 장기 기형 과 같은 신경 퇴행성 상해를 연구하는 최적 동물 모델이 아닙니다. 생물학적으로, 마우스의 짧은 수명과 급속한 노화는 노화의 혼란스러운 요인으로부터 의결로 인한 근육 의 균등화를 정확하게 묘사하기 어렵게 만듭니다. 기술적 관점에서, 심한 위축으로 인해 근육 질량이 크게 감소하면 효과적인 유동 세포 분석이 충분하지 않을 것입니다. 사실, 마우스 FAP 격리 프로토콜은 정렬 된 FAP29의수율을 더 잘 높이기 위해 건강한 근육을 함께 그룹화하는 것을 제안합니다. 이 분석을 위한 적당한 근육 조직을 얻기의 기술적인 장벽을 해결하는 동안, 동시에 근육 특정 수준에 FAP를 평가에서 연구원을 제한합니다. 특정 근육 그룹은 섬유 유형 조성에서 본질적으로 다르기 때문에, 혈...

섬유-adipogenic 전구 세포 (FAP)는 근육 항상성, 수리 및 재생에 중요한 역할을 하는 골격 근육에 거주하는 다능성 전구 세포의 인구이며, 반대로 근육 손상에 대한 병리학적 반응을 중재합니다. 이름에서 알 수 있듯이, FAP는 원래 섬유 아세포와 지방 세포1로 분화 할 수있는 잠재력을 가진 선조 인구로 확인되었으며 만성 상해 및 질병에 있는 골격 근육의 섬유 지방 침투의 핵심 중재자로 사칭되었습니다. 추가 연구 결과는 FAP가 골발생및 연골발생2,3,4의추가능력이 있다는 것을 밝혔다. 따라서, 그들은 더 광범위하게 중간 엽 또는 기질 선조로 문학에서 통보3,5,6,7,8. 급성 골격 근육 부상에서, FAP는 일시적으로 활성화 된 근육 위성 세포와 그들의 다운스트림 심근 선조 (의원)에 대한 유리한 환경을 제공하기 위해 일시적으로 증식하여 재생 근신생에 간접적으로 원조1,9,10. 성공적인 재생과 병행하여 FAP는 자멸을 겪으며 숫자를 기준 수준1,9,10,11로되돌린다. 대조적으로, 만성 근육 상해에서, FAP는 그들의 지속성9,10,11 및 이상한 근육 복구 결과 프로 세포 신호를 재정의합니다.
FAP가 근육 반응을 중재하는 세포 및 분자 메커니즘을 평가하는 생체 내 연구에서 현재까지뮤뇨 동물모델을1,7,9,10,11,12, 13,14로활용하였다. 유전자 조작 된 마우스는 이러한 분석에 사용하기위한 강력한 도구이지만, 동물의 작은 크기는 근육 위축이 외상성 기형과 같은 심오할 수있는 장기 국화 부상 모델에서 연구를위한 조직 가용성을 제한합니다. 더욱이, 근육강도 및 신체 기능의 측정은 마우스의 종료를 필요로 하는 전 생체 내 또는 시투 측정, 또는 수술 및/또는 전신 마취가 필요한 생체 내 측정을 필요로 하여 근육 수축 성능15,16,17,18,19,20의 평가를 허용해야합니다. . 쥐에서, 잘 검증되고 세계적으로 활용된 근육 기능 분석, 걸음걸이 분석(예를 들어, 상시 기능 지수, CatWalk 분석)과 같은 보다 복잡한 모터 행동에 대한 분석이 존재하며, 깨어 있고 자발적으로 움직이는 동물21,22,23,24에서 수행된다. . 이것은 또한 동물 실험에 있는 최소한의 이환율의 원리및 사용된 연구 동물의 수를 낙관합니다. 따라서 쥐는 FAP 조사관에게 단백질 및 세포 분석을 위한 더 큰 부상된 근육 부피의 추가된 융통성과 경보 동물에서 근육 복잡한 정적 및 동적 기능 활동 및 행동의 연쇄 평가를 착수하는 기능을 제공합니다.
FAP는 주로 유동 세포측정및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전체 근육 샘플에서 각각 확인되고 격리되었습니다. 이들은 크기, 세분성 및 세포 표면 또는 세포 내마커(25)의특정 조합과 같은 특징적인 특징에 기초하여 다중 특정 세포 집단을 식별할 수 있는 레이저 기반 의 소세이다. 이것은 항상성 및 재생이 세포 모형의 과다에 의해 조정된 다자간 프로세스이기 때문에, 골격 근육과 같은 기관 시스템의 연구 결과에서 매우 유리합니다. 정액 연구는 마우스 골격 근육 1에서 유동 세포 측정 방법을 사용하여 FAP뿐만 아니라 의원을확인했습니다. 그(것)들은 내피성 (CD31), 조혈 (CD45), 또는 근생성 (Integrin-α7 [ITGA7]) 기원에서 세포에 특정표면 항원이 부족하기 때문에 FAP는 본질적으로 중간엽이다는 것을 보여주었습니다, 그러나 중간엽 줄기 세포 마커 Sca-1 (줄기 세포 항원 1분화)와섬유질1의 자궁근증 세포 마커Sca-1을 표현했습니다. 다른 연구는 대체 줄기 세포 마커의 발현에 기초하여 근육에서 중간엽 전두체의 성공적인 절연을 입증, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파 (PDGFRα)2,7,8 및 추가 분석은 FAPs와 동일한 세포 집단이 될 가능성이 있음을 밝혀3. FAP는 이제 일반적으로 양성 선택 마커1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31로 Sca-1 또는 PDGFRα를 사용하여 유량 세포측정에서확인된다. . PDGFRα의 사용은 인간 조직에 우선적이지만, 뮤린 스카-1의 직접적인 인간 호모로그로 아직 확인되지 않은32. 또한, 다른 세포 표면 단백질은 FAP격리(33)에서근생 계보의 세포 지표로서 ITGA7에 대한 잠재적 대안을 제공하는 MP(예를 들어, VCAM-1)의 마커로서 보고되었다.
유동 세포측정법/FACS는 골격 근육1,9,10,11,13,29에서FAP의 역할 및 병원성 잠재력을 연구하기 위한 강력한 방법론이지만, 필요한 시약의 특이성 및 최적화에 의해 기술적으로 제한됩니다. FAP의 흐름 세포 식별 및 격리가 마우스 동물 모델1, 9,10,11,29에서개발 및 수행되었기 때문에 다른 모델 유기체에서 FAP를 연구하고자하는 연구자에게 도전이 제기됩니다. 처리될 최적의 조직 크기, 시약 및/또는 항체 특이성 및 가용성과 같은 많은 요인은 사용되는 종에 따라 다릅니다.
새로운 동물 모델에서 FAP를 연구하는 기술적 장벽 외에도, 그들은 주로 급성에서 연구되었습니다, 독성 설정 - 일반적으로 근육 화학 주입 또는 심장 독소를 통해. FAP의 장기 역학평가는 주로 듀첸의 근이영양증 에 대한 평가에 국한되어 있으며, mdx 마우스 모델9,10,11,및 동시 힘줄 트란과 기질이 어깨 근육26,27, 28, 28에서 동시 힘줄 과 기립이 수행되는 대규모 회전근 파열과 같은 조합 근육 부상의 모델 . 만성 외상성 기형의 단독 모욕에 대한 FAP의 반응, 중공업, 농업 및 출생 외상 (brachial 신경총 상해)에서 발생하는 일반적인 발생 (brachial 신경총 상해)34,35,36,37이 중요한 이환율을 가진, 종종 단기 시간 프레임11,38로제한되는 특성화되지 않았습니다.
우리는 쥐에 있는 가혹한 위축및 섬유성 골격 근뿐만 아니라 건강에서 FAP와 의원을 확인하고 격리하는 방법을 기술합니다. 첫째, 조직 소화 및 유동 세포체 염색 프로토콜을 사용하여 CD31/CD45-1+/VCAM-1-FAP 및 CD31/CD45-1-/VCAM-1+ MP의 식별이 입증되고, 분리된 세포의 배양 및 면역세포 화학적 얼룩을 통해 당사의 연구 결과의 후속 검증이 수행된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 또한 쥐에 있는 장기 고립된 기질 상해 모형에 있는 새로운 FAP 시간 과정을 보고합니다.

<table><tbody><tr><td>5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(셀 스트레이너 캡 포함</td>) <td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>10cm 세포 배양 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>130185</td><td></td></tr><tr><td>12mm 유리 커버슬립, No.2</td><td>VWR</td><td>89015-724</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Beckton Dickenson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>FroggaBio</td><td>91014</td><td></td></tr><tr><td>20 게이지 바늘</td><td>Beckton Dickenson 305176</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mL 혈청 피펫</td><td>Sarstedt</td><td>86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>40&micro; m 세포 여과기</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>50mL 원심분리기 튜브</td><td>FroggaBio</td><td>TB50</td><td></td></tr><tr><td>AbC 총 항체 보상 비드&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>A10497</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄, 시약 등급</td><td>Bioshop</td><td>AMC303.500</td><td></td></tr><tr><td>APC 접합 키트, 50-100&micro; g</td><td>Biotium</td><td>92307</td><td></td></tr><tr><td>Aquatex 수성 장착 매체</td><td>Merck</td><td>108562</td><td></td></tr><tr><td>Biolaminin 411 LN</td><td>Biolamina</td><td>LN411</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td> <td>Bioshop</td><td>ALB001</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Bioshop</td><td>CCL444.500</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 II 형</td><td>Gibco</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Plus 앱솔루트 카운팅 비즈</td><td>ThermoFisher</td><td>C36995</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>(+)4.5 g/L D-Glucose (+)L-Glutamine (+)110 mg/L 피루브산 </td></tr><tr><td>나트륨 EDTA</td><td>FisherScientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>FACSClean Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FACSRinse Solution</td><td>Beckton Dickenson</td><td></td><td></td>340346</tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석 칼집 유체</td><td>Beckton Dickenson</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>형광 장착 매체</td><td>Dako</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa Fluor 555 2차 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 Alexa Fluor 488 보조 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>염소 항토끼 Alexa Fluor 555 보조 항체</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr><tr><td>염소 세럼</td><td>Gibco</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F10 Media</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>11550043</td><td>(+) 페놀 레드 (+) L-글루타민 (-) 헤페스</td></tr><tr><td>행크' s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td><td>Multicell</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Reichert</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 최소 99.5% 적정</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Human Transforming Growth Factor &beta; 1 (hTGF-&베타; 1)</td> <td>세포 신호</td><td>: 8915LF</td><td></td></tr>, <tr><td>Humulin R</td>, <td>Lilly</td><td>HI0210</td><td></td></tr>, <tr><td>IBMX</td><td>, Millipore Sigma</td>, <td>I5879</td>, <td>일컬어 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>I9516</td>, <td>일컬어 2-propanol</td></tr><tr><td>Lewis Rat, 여성</td><td>Charles River Kingston</td><td>004 (스트레인 코드)</td> <td>200-250 그램 사용</td></tr><tr><td>LSRFortessa X-20 벤치탑 세포분석기</td><td>Beckton Dickenson</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>EP-5417R</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-CD31::FITC 항체</td><td>Abcam</td><td>ab33858</td><td>클론 TLD-3A12</td></tr><tr><td>마우스 Anti-CD45::FITC 항체</td><td>Biolegend</td><td>202205</td><td>Clone OX-1</td></tr><tr><td>Mouse Anti-CD106::P E 항체</td><td>Biolegend</td><td>200403</td><td>VCAM-1</td></tr><tr><td>마우스 Anti-MHC 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>N/A</td><td>일컬어 MF20</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Pax7 항체</td><td>발달 연구 Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린, 10 %</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Millipore Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 결합 키트</td><td>Abcam</td><td>ab102903</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>(-)Calcium Chloride (-)Magnesium Chloride </td></tr><tr><td>Potassium Bicarbonate, 시약 등급</td><td>Bioshop</td><td>PBC401.250</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) 항체</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-32347</td><td>FSP-1 , 일명 S100A4</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Integrin-a7 항체</td><td>Abcam</td><td>ab203254</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Laminin 항체</td><td>Sigma</td><td>L9393</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Perilipin-1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab3526</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Anti-Sca-1 항체</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB4336</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I 항체</td><td>Abcam</td><td>ab260043</td><td>Col1a1</td></tr><tr><td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR이라고도 함 알파 항체</td><td>Abcam</td><td>ab203491</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 FGF-basic</td><td>Gibco</td><td>PHG0266</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Troglitazone</td><td>Millipore 시그마</td><td>T2573</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (fap) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

섬유-adipogenic 전조자 (FAP) 골격 근육에 거주 성 간질 세포, myogenic 전조와 함께 (의원), 근육 항상성에 중요 한 역할을, 부상, 그리고 수리. FAP 식별 및 절연 사용에 대한 현재 프로토콜은 혈류 세포측정제/형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 현재까지 생체내에서 의 기능을 평가하는 연구가 마우스에서만 수행되고 있다. 쥐의 더 큰 내재 크기는 골격 근육 부상 모델, 특히 가혹하게 위축성 근육또는 조사관이 여러 다운스트림 분석을 수행하기 위해 상당한 조직 질량을 필요로 할 때 FAP의 보다 포괄적 인 분석을 할 수 있습니다. 쥐는 또한 동물 진정 또는 희생을 필요로하지 않는 근육 기능적 인 연구의 더 큰 선택을 제공하므로 직렬 평가를 가능하게하여 이환율과 동물 사용을 최소화합니다. 마우스에 최적화된 유동 세포종/FACS 프로토콜은 종특이적이며, 특히 시판되는 항체의 특성에 의해 제한됩니다. 그(것)들은 쥐 또는 높게 섬유질 근육에서 FAP를 분리하기 위해 최적화되지 않았습니다. 표면 마커 CD31, CD45, Sca-1 및 VCAM-1의 차동 발현에 의존하여 건강하고 기질이 강한 쥐 골격 근육에서 FAP 및 MP의 식별 및 격리를 위한 유동 세포계/FACS 프로토콜이 개발되었다. 쥐 특이적, 유동 세포측정-검증된 1차 항체는 심각하게 제한되고, Sca-1을 표적으로 하는 항체의 사내 융합이 수행되었다. 이 프로토콜을 사용하여 성공적인 Sca-1 연상이 확인되었으며, FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 FACS 격리 FAP 및 의원의 세포 배양 및 면역 스테인링에 의해 검증되었습니다. 마지막으로, 우리는 장기간 (14 주) 쥐 기종 모델에서 새로운 FAP 시간 과정을보고합니다. 이 방법은 조사자에게 새로운 동물 모델에서 FAP를 연구할 수 있는 기능을 제공합니다.

Sca-1 및 VCAM-1을 포함한 새로운 항체 패널을 사용하여 유동 세포측정을 통해 FAP 및 의원을 식별 쥐 근육에서 FAP를 식별하기위한 게이팅 전략은 CD31 (내피) 및 CD45 (혈토포이틱)의 게이트가 있는 마우스29의흐름 세포 측정 프로토콜을 기반으로하고 FAPs 마커 Sca-1 및 MpPs 마커 ITGA7의 형광 프로파일을 검사합니다. 쥐 Sca-1 및 ITGA7에 대한 시판, 불소- 컨쥬게이트 및 유동 세포측정 항체가 없는 경우, 우리는 쥐 Sca-1:APC 항체를 자체 수렴하고 의원을 식별하기 위한 대안 전략을 착수했습니다. VCAM-1은 최근 쥐의원(33)의 격리를 위한 효율적인 단일 양성 선택 마커로 나타났으며, VCAM-1을 대상으로 쥐 특이적, 공주, 유동 세포측정 검증 항체를 사용할 수 있게...

이 프로토콜은 쥐 골격 근에서 섬유-선화 선조 (FAP) 및 근생 선조 (의원)를 격리하는 방법을 설명합니다. 근육 상해 모형에 있는 쥐의 활용은 분석을 위한 위축근에서 증가한 조직 가용성및 자유로운 움직이는 동물에 있는 근육 강도 및 걸음걸이를 평가하기 위하여 검증된 방법의 더 큰 레퍼토리를 제공합니다.

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

FAP는 근육 재생 및 병리학 섬유증의 중재자이기 때문에, 우리의 프로토콜은 FAP 역학의 특성화를 허용합니다 근육 상해 및 시험관 내 또는 전 생체 연구에 대한 FAP의 격리를 게시. 현재까지, 연구는 쥐에서 분리 된 FAP에 독점적으로 수행되었습니다. 우리의 프로토콜은 더 큰 쥐에서 FAP의 효과적인 격리를 가능하게, 다운 스트림 분석에 대한 훨씬 더 큰 조직 가용성을 제공.장기간 된 조직 처리 시간은 FAP의 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 여러 샘플이 동시에 처리되는 경우 두 명의 작업자가 격리된 셀 생존 가능성을 최대화하기 위해 프로토콜을 나란히 수행하는 것이 좋습니다. 먼저 수확한 근육 조직을 멸균 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.부드럽게 찢어서 집게로 조직을 다진 다음 결합 조직을 제거하여 약 3~4밀리미터 의 큐브 조각을 얻습니다. 민스터 조직을 DMEM 6밀리리터 및 1%페니실린-연쇄절제술을 함유한 멸균 50밀리리터 원내튜브로 이송한다. 다음으로 300밀리알라 칼슘 염화칼슘 용액 10마이크로리터를 추가하여 콜라게나아제 II 용액 365마이크로리터를 활성화합니다.밀리리터당 250단위의 최종 농도를 위해 활성 콜라게나아제 II 용액을 조직 슬러리에 추가합니다. 튜브를 1시간 동안, 240xg의 섭씨 37도에서 튜브 측면에 부착된 조직을 빼내기 위해 15분마다 수동 교반을 사용합니다. 1시간 동안 잠복한 후 콜라게나아제 II 100마이크로리터와 50마이크로리터의 디스파를 샘플에 추가합니다.그런 다음, 파이펫은 용액이 균일할 때까지 혈청 피펫으로 15~20회 샘플링합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 30분, 15분마다 수동 교반으로 240xg의 배양합니다. 10사이클 동안 20게이지 바늘로 20밀리리터 주사기를 통해 근육 용액 샘플을 천천히 전단합니다.그런 다음 멸균 50 밀리리터 원내 튜브에 40미크론 셀 스트레이너를 배치하고 10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄절제술을 보충한 DMEM의 5밀리리터를 배관하여 적십니다. 스트레이너를 통해 한 번에 1 밀리리터의 샘플을 피펫합니다. 전체 샘플을 여과하면, 10%의 FBS와 1%페니실린-연쇄 절제술로 보충된 DMEM으로 세포 스트레이너를 세척하여 총 샘플 량을 25 밀리리터로 가져옵니다.샘플 볼륨을 섭씨 15도, 400 x g에서 15분간 2개의 15밀리리터 원심튜브와 원심분리기로 균등하게 분할합니다. 원심 분리 후, 상류체를 흡인하고 7 분 동안 실온에서 RBC 용해 버퍼의 1 밀리리터에서 펠릿을 재연합니다. 그런 다음 9 밀리리터의 워시 버퍼를 추가하여 10 밀리리터와 원심분리기의 15도, 15분 동안 400 x g의 부피를 가져옵니다.원심 분리 후, 슈퍼나탄을 흡인하고 펠릿을 세척 버퍼 1밀리리터로 재보펜한다. 별도의 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브에 적절한 양의 세포를 전송하고 트라이판 블루 염료와 혼합합니다. 혈전계를 사용하여 가벼운 현미경으로 살아있는 세포를 계산합니다.유동 세포측정을 위해 실험 샘플당 1~200만 개의 세포를 멸균 1.5밀리리터 미세센심분리기 튜브로 이송한다. 세척 버퍼로 샘플 볼륨을 1 밀리리터로 가져와 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 실험에 대한 모든 컨트롤을 설정합니다.세포 컨트롤의 경우, 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브의 세척 버퍼 1 밀리리터에서 알리쿼트 500, 000 ~ 1백만 개의 세포가 얼음 위에 놓습니다. 실험이 처음으로 수행되는 경우, 단하나 염색된 세포 현탁액도 포함되어야 한다. 비드 컨트롤을 설정하려면 1.5밀리리터 원심분리기 튜브에 약 150, 000개의 긍정적인 보상 구슬을 추가합니다.1.5 밀리리터 미세 센심 분리제 튜브를 새로 고치도록 생존성 튜브로부터 세포 부피의 절반을 전달하여 생존 력 조절을 준비합니다. 죽은 튜브를 섭씨 65도에서 2~3분간 배양한 다음 얼음 위에 놓습니다. 인큐베이션 후 죽은 세포를 생존 튜브로 되돌리십시오.원심분리기는 500 x g및 섭씨 4도에서 500 x g 및 섭씨 4도에서 실험 및 제어 샘플을 포함하는 단일 세포 현탁액을 원심분리하고, 상피탄을 흡입한 후 세척 버퍼100 마이크로리터로 세포 펠릿을 재연한다. 제어 또는 실험 조건에 따라 항체를 추가하고 샘플을 부드럽게 쓸어 서 완전한 혼합을 보장합니다. 그런 다음 어둠 속에서 얼음에 15 분 동안 배양하십시오.보상 구슬의 경우 어두운 실온에서 15 분 동안 튜브를 배양하십시오. 단일 셀 서스펜션에 900 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하고 보상 비드 컨트롤을 위해 PBS의 900 마이크로리터를 추가하여 각 샘플의 부피를 1 밀리리터로 가져옵니다. 원심분리기 단일 셀 서스펜션은 5분 동안 500 x g, 섭씨 4도, 보상 비드 컨트롤은 300 x g, 섭씨 4도에서 5분간 보정합니다.시료의 원심분리 후, 300 마이크로리터의 세척 버퍼에서 체퍼를 흡인하고 세포 펠릿을 재연하고, PBS 및 150, 000 개의 음의 보상 구슬의 300 마이크로 리터에서 비드 컨트롤을 억제합니다. 셀 샘플을 알루미늄 호일 아래 실온에서 얼음과 비드 샘플에 보관하십시오. 섬유-사이포겐성 선조및 근생선조를 식별하기 위하여 게이팅 전략을 설정하여 유동 세포측정 취득을 진행합니다.대표적인 분석에서, 건강한 쥐 위트로네미즘 근육에서 생성된 보상 구슬 및 세포 현탁액의 단일 염색을 가진 Sca-1 APC 항체의 성공적인 결합이 확인되었다. Sca-1 APC의 5개의 상이한 농도는 단세포 현탁액에 적정되었고, 항체의 최적 농도는 최소한의 배경 염색을 가진 가장 큰 형광 강도를 기반으로 확인되었다. 쥐 위장혈증에서 FAP와 의원의 흐름 세포 식별은 여기에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 수행되었다.샘플은 먼저 구슬을 계산하는 파편을 제외하기 위해 문이 있었습니다. 그런 다음 세포는 전면 분산 및 측면 분산 특성모두에 의해 이중을 배제하기 위해 게이트되었습니다. 결과 세포의 생존력은 SYTOX 블루로 염색하여 평가되었다.SYTOX 블루 네거티브 싱글은 CD31 및 CD45에 대해 평가되어 Lin+분획을 제외했습니다. 린 인구는 평가되었다. Sca-1에 대한 단일 양성 세포는 FAP로 지정되었고, VCAM-1에 대한 단일 양성세포는 의원을 지정하였다.분류 직후 의면염색을 통해 FAP의 갓 분리된 인구는 Pax7 양성 세포에 의한 오염 없이 PDGF랄마에 대한 긍정적인 염색을 표시했습니다. 반대로, 의원의 정렬 된 인구는 PDGFRalpha 양성 세포의 부재와 Pax7에 대한 긍정적 인 스테인드. FAP는 섬유아세포 특이단백질 1과 페리립핀 1의 발현을 각각 발현하는 사이포겐성 분화 매체에서 12일째에 분화된 섬유아세포와 사이포세포를 시연했다.성숙한 지방세포에서 중성 트리글리세라이드와 지질의 존재는 오일 레드 O 염색으로 분명하게 드러났습니다. 추가적으로, FAP는 콜라겐 타입 I의 존재 및 심근세포 오염의 부재를 보여주었습니다. 12일 근생분암매체에서 자란 의원들은 성숙한 심낭과 융합된 다중핵심튜브의 존재를 보여주었으며, 섬유아세포와 세포질 오염이 분명했다.이 기술을 사용하여 장기 배양을 위해 살아있는 세포를 격리할 때, 연구원은 좋은 세포 생존성을 보장하기 위하여 동시에 효율적으로 작동하는 동안 무균 기술을 사용하는 것을 확인해야 합니다.

identification-isolation-characterization-fibro-adipogenic

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

효소 분리, fibro / adipogenic 및 murine 골격근에서 myogenic progenitors의 유동세포계측법에 의해 표면 라벨 및 정화를위한 방법.

골격근에서 Progenitors의 정화

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섬유아세포의 순수한 인구를 얻는 것은 상처 수선 및 섬유증에 있는 그들의 역할을 공부하는 것이 중요합니다. 여기에 기재된 상세한 방법은 면역형광, RTPCR, 형광 보조 세포 선별에 의한 순도 및 기능성의 특성화에 이어 부상을 입지 않은 마우스 하트로부터 섬유아세포 및 근섬유아세포를 분리하는 상세한 방법이며, 콜라겐 젤 수축.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

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교란되지 않고 손상된 마우스 골격근에서 섬유 지방 형성 전구 세포 및 근육 줄기 세포의 FACS 분리 및 배양

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근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

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구강 안면 근육 섬유증 모델을 확립하기 위해 마우스 교근의 동결 손상

여기에 제시된 프로토콜은 단일 세포 질량 세포분석을 통한 근육 줄기 및 전구 세포의 식별 및 고차원 분석을 가능하게 하고 FACS에 의한 정제를 통해 기능에 대한 심층적인 연구를 가능하게 합니다. 이 접근법은 질병 모델의 재생 역학을 연구하고 약리학적 중재의 효능을 테스트하는 데 적용할 수 있습니다.

High-dimensional Single-Cell Mass Cytometry에 의한 급성 골격근 손상 중 In Vivo의 Myogenic Progenitors 식별 및 분석

이 프로토콜은 효소 해리 및 형광 활성화 세포 분류를 통해 가시쥐(Acomys)에서 골격 및 심장 근육 섬유-지방 생성 전구세포(FAP)를 분리하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에서 얻은 FAP는 근섬유아세포 및 지방세포로 효과적으로 확장되고 분화될 수 있습니다.

Fibro-Adipogenic Progenitor Isolation, Expansion, and Differentiation from the Spiny Mouse Model(스파이니 마우스 모델로부터의 섬유-지방형성 전구세포 분리, 확장 및 분화)

마이크로 해부 explants 기술은 골격 근육 줄기 세포의 원천으로 청소년, 성인이나 배아 근육에서 proliferative 골격근 세포를 분리를위한 강력하고 안정적​​인 방법입니다. 유니 클리,이 세포는 clonally 생체내 이식에 사용되는 골격 근육 줄기 세포 라인을 생산하기 위해 파생되었습니다.

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

학습하세요 쥐 골격 근육에서 섬유 선화(FAP) 및 근생 전구자(MP)를 격리하고 특성화하는 방법을. 콜라게나제 처리와 유세포 분석을 통해 근육 재생 및 섬유화 연구에 활용할 수 있습니다.

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

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