Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

이 방법은 경색된 심장에서 이식된 세포의 낮은 보유 및 생존에 대한 낮은 적용성과 같은 현재 악화된 심장 치료의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 이 방법은 쥐 모델에서 주사 가능한 하이드로겔을 사용하여 줄기세포를 사용한 심근 이식을 연구하는 신뢰할 수 있는 기술을 제공할 수 있으며, 이는 심근 손상 후 심장 조직 복구 및 재생을 조사하는 데 사용할 수 있는 훌륭한 플랫폼입니다. 이 기술의 주요 장점은 현장 가교 커버 주사 가능한 하이드로겔을 사용하여 심근 내 이식 후 이식된 줄기 세포의 보유 및 생존을 개선할 수 있는 실현 가능한 방법이라는 것입니다.

이러한 하이드로겔은 줄기세포뿐만 아니라 성장 인자, 유전 물질 및 약물을 전달하여 경색된 심장 조직에서 치료 효과를 극대화하는 등 심장 조직 공학에 다양한 기회를 제공합니다. 체외 실험 절차를 시연하는 것은 저희 연구실의 연구 기술자인 이은미입니다. 박은혜 교수와 성은화 연구기술자가 in-vivo 실험 절차를 시연합니다.

중간엽 줄기 세포 또는 MSC를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 100mm 배양 접시에 배양합니다. 세포가 80% 합류점에 도달하면 DPBS로 접시를 두 번 씻고 섭씨 37도에서 3분 동안 1ml의 트립신 대용품을 배양합니다. 그런 다음 9ml의 배양 배지를 세포에 추가하고 500배 G에서 3분 동안 원심분리합니다.

생성된 상등액을 폐기합니다. 1ml의 PBS에 세포를 재현탁시키고 얼음 위에서 세포 현탁액을 유지합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 10마이크로리터의 트리판 블루로 희석하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.

MSC를 10의 1배의 밀도로 1밀리리터당 7번째 세포로 재현탁하고 1밀리리터 튜브로 옮깁니다. PBS에서 6.25%GH 접합 용액을 준비하고 두 개의 바이알로 분리합니다. 다음으로 GH 용액을 HRP 밀리리터당 6마이크로그램 또는 0.07%과산화수소와 혼합합니다.

세포 현탁액을 1000배 G로 잠시 원심분리하고 생성된 상등액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 GH 용액 A와 혼합합니다.GH 용액 A와 GH 용액 B의 MSC를 이중 주사기의 양쪽에 넣습니다. 300마이크로리터의 MSC와 결합된 GH 용액을 밀리리터당 500만 개의 최종 밀도로 8개의 웰 챔버 슬라이드에 플레이트화합니다.

현장 하이드로겔 형성 및 효소 가교를 통한 후속 MSC 캡슐화 후 10% FBS와 1% 항생제 항진균 용액을 함유한 700마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양하고 2-3일마다 배양 배지를 교체합니다. 수술 전에 제모 크림을 사용하여 마우스 가슴을 제거하고 요오드로 피부를 살균합니다.

마우스를 수술대에 놓고 기관에 카테터를 삽입하여 삽관하여 기계적 환기를 통해 산소를 보충합니다. 수술용 가위를 사용하여 피부를 부드럽게 자릅니다. 그런 다음 마이크로 가위로 늑간 근육을 관통하십시오.

열린 흉강을 유지하기 위해 5-O 실크 봉합사를 사용하여 두 번째와 세 번째 왼쪽 갈비뼈를 분리합니다. 8-0 바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 전방 하행 관상 동맥을 조심스럽게 결찰합니다. 폴리프로필렌 봉합사를 봉합하고 전기소작을 사용하여 봉합사를 절단합니다. 전방 좌심실 벽에서 즉각적인 색 변화를 관찰하십시오.

심근경색을 유도한 후, 10마이크로리터의 MSC 로딩 GH 용액을 경색 경계 구역의 두 개의 다른 지점에 주입합니다. 열린 흉강을 복원하고 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 봉합합니다. 기관 튜브를 제거하고 마우스를 적외선 램프 아래의 케이지에 넣습니다. 회복하는 동안.

심초음파검사를 수행하고 LV 전벽, LV 내벽 및 LV 후벽에 해당하는 선을 측정하여 심벽 두께, 챔버 치수 및 분획 단축을 얻습니다. 생체 내 이식 이전에 GH hydragels에서 MSC의 증식 및 생존은 3D 체외 사체 염색 분석으로 확인되었습니다. 대표 이미지는 GH 하이드로겔 내 분지형 네트워크를 보여주는 충분한 MSC 증식을 보여주었습니다.

MSC의 광범위한 다세포 3D 구조가 14일째에 명확하게 관찰되었으며, 이는 GH 하이드로겔이 캡슐화된 세포에 적절한 미세환경을 제공할 수 있음을 나타냅니다. 심근경색 유도 후, MSC 로딩 GH 하이드로겔을 심근 경색 주위 부위에 심근 내 이식했습니다. MSC와 겔은 경색 부위 내에서 적절하게 유지되었습니다.

MSC는 GH 하이드로겔에 잘 통합되었습니다. MSC 로딩 GH 하이드로겔의 치료 효과를 확인하기 위해 이식 후 28일째에 심장초음파와 조직학적 분석을 통해 심장 기능 및 구조의 변화를 평가하고 다른 치료 그룹 간에 비교했습니다. 대표적인 심장초음파검사에서는 MSC 겔 처리군에서 분획 단축(fractional shortening), 박출률(ejection fraction), 수축기 말단 용적(end systolic volume) 등 심장 기능이 개선된 것으로 나타났습니다.

또한, 조직학적 분석은 MSC 겔 처리군이 다른 그룹보다 섬유화가 적고, 경색벽이 더 두꺼우며, 경색 크기가 더 작았으며, 이는 이 프로토콜이 좌심실 리모델링을 현저히 약화시켰음을 나타냅니다. 이 기술을 사용하여 장기적으로 줄기세포와 증식을 달성하고 쥐 모델에서 심근경색 후 심장 구조와 기능을 크게 개선했습니다. 이 기술은 심장 조직 복구 및 재생을 제공하여 경색 후 심부전을 예방하기 위한 새로운 전략으로 대형 동물에 사용하기 위해 확장될 수 있으며 임상 번역으로 확장될 수 있습니다.