Name: Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 학습하세요 심근 경색 후 줄기세포 이식을 위한 젤라틴 하이드로겔 기법을 murine 모델에서. 이 방법은 세포 유지율과 생존율을 높여 심장 조직 재생 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 교육부의 지원을 받는 한국국립연구재단(NRF)을 통해 기초과학 연구 프로그램에 의해 지원됩니다(NRF-2018R1D1A1A02049346)

모든 동물 연구 절차는 실험실 동물 복지법, 실험실 동물의 치료 및 사용 안내서 및 가톨릭 대학교 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)가 제공하는 설치류 실험지침 및 정책에 따라 제공되었습니다.
1. MSC 및 주사용 젤라틴 하이드로겔 의 준비
<ol><li>37°C및 5% CO2에서100mm 배양 접시에 있는 MsC 배양. MSC 의 성장이 80 %에 도달하면 DPBS로 접시를 두 번 씻고 3 7 °C에서 트립신 대체 1 mL을 3 분 동안 추가하십시오. 참고: MSP는 기존의 절차에 따라 뮤린 골수로부터 격리되었다16,덜벡코의 수정 독수리의 매체 (DMEM)에서 배양 10% 태아 소 혈청을 포함 (FBS) 및 1% 항생제-항 mycotic 솔루션, 이 연구를 위해 통과 사이 사용 7\u20129.</li>
	<li>배양 배지 와 원심분리기 9mL를 500 x g에서 3분 간 추가합니다. 다음으로, 결과 상체를 버리고, PBS의 1 mL에서 세포를 재일시 중지하고, 얼음에 세포 현탁액을 유지한다.</li>
	<li>트라이판 블루의 10 μL로 셀 서스펜션 10 μL을 희석하고 자동화된 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 얻습니다.</li>
	<li>1 x 107 셀/mL의 밀도로 MSC를 1mL 튜브로 다시 일시 중단하고 전송합니다.</li>
	<li>PBS에서 GH 컨쥬게이트 용액의 6.25 wt%를 준비하고 2개의 바이알로 분리합니다. 다음으로 GH 솔루션을 HRP(GH 솔루션 A)의 6μg/mL 또는 H2O2(GH 솔루션 B)의 0.07 wt%와 혼합합니다. 참고: 공지된프로토콜(12,15)에따라 젤라틴-하이드록시페닐 프로피오닉산(GH) 컨쥬게이트를 준비한다.<ol>
<li>HRP(GH 솔루션 A) 및 GH 컨쥬게이트 용액에 대한 GH 컨쥬게이트 용액의 9:1 체적 비율을 각각H2O2(GH 솔루션 B)에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>MSC를 GH 솔루션 A와 혼합하기 전에 셀 서스펜션을 1,000 x g로 잠시 원심 분리하고 결과 슈퍼나티를 조심스럽게 흡인시합니다. 이어서, MSC를 함유하는 펠릿을 GH 솔루션 A와 혼합한다.</li>
</ol>2. 시투 MSC 로딩 및 체외 문화에서 입체적 입체
<ol><li>듀얼 주사기의 양쪽에 GH 솔루션 A(MSC 포함) 및 GH 솔루션 B를 로드합니다. 8웰 챔버 슬라이드에 5 x 106 셀/mL의 최종 밀도에서 MSC와 결합된 GH 솔루션의 플레이트 300 μL.</li>
	<li>시투 하이드로겔 형성 및 효소 교차 연결을 통한 후속 MSC 캡슐화 후, 10% FBS 및 1% 항생제-항진용액을 함유한 700 μL의 DMEM을 추가합니다.</li>
	<li>슬라이드를 37°C 및 5% CO2에서 배양하고 2\u20123일마다 배양 배지를 교체한다.</li>
</ol>3. GH 하이드로겔 내의 체외 증식 및 생존 확인
<ol><li>GH 하이드로겔 내에서 3D 배양 된 MSC의 생존가능성을 확인하려면 미리 정해진 인큐베이션 시간 후에 라이브/죽은 세포 염색 분석체를 사용하십시오.</li>
	<li>3, 5, 7 또는 14 일 동안 GH 하이드로겔에서 캡슐화된 MSC의 배양에 따라 매체를 흡면하고 PBS로 두 번 잘 씻는다.</li>
	<li>DPBS의 10mL에서 칼세인 AM 5 μL 및 에디듐 호모디머-1(EthD-1)의 20 μL을 포함하는 염색 용액을 준비한다.</li>
	<li>스테인링 용액 200μL을 우물에 넣고 실온에서 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>염색 용액을 흡인하고 PBS로 우물을 두 번 씻으세요.</li>
	<li>조심스럽게 슬라이드에서 챔버를 분리하고 GH 하이드로 겔 위에 전체 커버 슬립을 배치합니다. 캡슐화된 MSC의 증식 및 형태학적 변화의 정도를 시각화하기 위해 공초점 현미경 검사를 사용합니다. 참고: 형광 화상은 200배율 하에서 획득되었고, 칼세인의 경우 470/540 nm의 여기/방출 파장에서, EthD-1의 경우 516/607 nm로 이미지되었습니다.</li>
</ol>4. 마우스에서 심근 경색의 유도
<ol><li>7주 된 남성 C57BL/6 마우스(20\u20122g)를 식염수의 졸레틸(30 mg/kg)과 롬펀(10 mg/kg)의 혼합물을 인트라보네주사로 마취한다.</li>
	<li>수술 전에는 제모 크림을 사용하여 마우스 가슴을 뒤풀이고 요오드로 피부를 살균하십시오.</li>
	<li>수술대에 마우스를 놓고 카테터를 기관체에 삽입하여 기계 환기를 통해 산소를 보충합니다.</li>
	<li>외과 가위를 사용하여 피부를 부드럽게 잘라낸 다음 마이크로 가위로 늑간 근육을 관통합니다. 2차 및 3번째 왼쪽 갈비뼈를 5-0 실크 봉합사를 사용하여 분리하여 가슴 구멍을 유지합니다.</li>
	<li>8-0바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 전방 내림차순(LAD) 관상 동맥을 조심스럽게 리게이트합니다. 폴리 프로필렌 봉합사 및 전기 카우테리를 사용하여 봉합사를 잘라.</li>
	<li>전방 좌심실 벽의 즉각적인 색상 변화를 관찰하십시오.</li>
</ol>5. MSC 로딩 GH 하이드로겔의 인트라미카르탈 이식
<ol><li>LAD 결찰에 의한 심근 경색을 유도한 후, 26G 바늘을 장착한 이중 주사기를 사용하여 경색 국경 영역(총 2 x 105 MSC/20 μL)의 두 가지 지점에 MSC 로딩 GH 용액 10μL을 주입합니다.<ol>
<li>1단계에서 설명된 동일한 절차에 따라 MSC 로딩 GH 솔루션을 듀얼 주사기로 준비하고 전송합니다. 참고: 경질 지역 내에서 MSC 로딩 GH 하이드로겔의 이식을 평가하기 위해 MSC와 GH 컨쥬게이트는 각각 PHK26 및 형광제 이소티오카네이트(FITC)로 사전 표지되었다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>열린 가슴 구멍을 복원하고 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 닫습니다. 참고: 가슴 이닫기 전에 카테터 주사기를 사용하여 공기를 제거합니다.</li>
	<li>기관관을 제거하고 복구 하는 동안 적외선 램프 아래 케이지에 마우스를 배치 합니다.</li>
	<li>수술 후 진통의 경우 피하 케토프로펜 주사(하루 5 mg/kg)를 최소 72시간 동안 투여하십시오. 모든 마우스는 수술 후 적절한 회복뿐만 아니라 적절한 통증 치료를 보장하기 위해 적절한 시간 동안 면밀히 모니터링해야합니다.</li>
</ol>6. 에코카르디그래피
<ol><li>이식 후 4주 후, 처음에는 5%의 이소플루란으로 마우스를 마취한 다음 이소플루란 농도를 1%로 조절한다.</li>
	<li>제모 크림을 사용하여 가슴을 뒤처질시키고 마우스를 가열 패드에 놓습니다. 가슴에 초음파 트랜스듀서 젤을 바치면 됩니다.</li>
	<li>2차원 파라스테랄 짧은 축 뷰를 획득하고 유두 근육 수준에서 M 모드 추적을 기록합니다. 참고: 왼쪽 파라스테럴 라인에 선형 어레이 변환기(7\u201215 MHz)를 배치하고 해부학 구조를 봅니다.</li>
	<li>LVAW, LVID 및 LVPW에 대한 해당 라인을 측정하여 심장 벽 두께, 챔버 치수 및 분수 단축을 얻습니다. 참고: 동일한 해부학 적 위치에서 적절한 평가를 보장하기 위해 유두 근육의 수준에서 배출 분수 (EF), 분수 단축 (FS), 및 최종 수축부(ESV)를 포함한 심장 기능을 비교합니다.</li>
</ol>7. 조직학적 평가
<ol><li>MSC-로딩 GH 하이드로겔을 경각심에 이식한 후 소정의 시간에,CO2 챔버에서 마우스를 안락사시키고 조직학적 분석을 위해 심장을 수집한다15.</li>
	<li>헤마톡시린과 에오신(H&E) 및 마슨의 트리크롬(MT) 염색의 경우, 해부된 심장 조직을 4% 파라포름알데히드(PFA)로 수정하고 파라핀에 포함시한다. 다음으로, 표준프로토콜(17)에따라 MT 얼룩으로 미세토메를 사용하여 파라핀 임베디드 심장 블록을 4 μm 직렬 섹션으로 잘라냅니다.</li>
	<li>20배 배율로 슬라이드 스캐너에서 이미지를 획득하고 치료 그룹의 경색 크기를 계산합니다. 광원 크기 (%) = 총 경색 주위 / 총 LV 둘레 × 100</li>
	<li>중간 선 길이 측정하여 둘 다 둘다 계산합니다. LV 미드라인 둘레의 경우 내막과 상골 표면 사이의 중심선 길이를 측정합니다. 미드라인 경외도의 경우, 심근18의전체 두께의 50% 이상을 포함하는 경색의 길이를 측정한다. 참고: ImageJ 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지 분석을 수행했습니다.</li>
	<li>유두 근육 수준에서 흉터의 벽 두께를 측정합니다.</li>
	<li>콜라겐 영역의 일부를 계산합니다. 콜라겐 영역 (%) = 간질 섬유증 /심근 세포 영역 x 100의 총 면적</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품으로 선언 하는 이해의 충돌이 없습니다.

주사용 GH 하이드로겔은 상균하게 시상에 다양한 치료제를 통합하는 능력 때문에 생체 내 응용 분야에서 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, 그들의 물리적 및 생화확적인 속성은 질병 의존적 요구 사항에 따라 쉽게 조작될 수 있습니다. 이러한 점에서, 주사용 하이드로겔은 현재 심장 줄기 세포 치료의 주요 한계를 해결하기 위해 제안된 생존 및 세포 보존(즉, 24시간 이식 후 10% 이내)에서19,20. 이러한 열악한 결과를 극복하기 위해, 본 원에 기재된 프로토콜은 심근 이식 후 시상에서 교차 연결할 수 있는 GH 하이드로겔을 사용하여 세포 보유 및 생존을 개선하는 간단하고 실행 가능한 방법을 제공하며, 이는 뮤린 MI 모델에서 심장 구조및 기능에 유리한 영향을 미쳤다.
이 기술의 주요 이점 특징은 모든 유형의 세포 및 생체 분자와 함께 광범위한 생체 내 적용성이며, 이는 단순히...

심장 줄기 세포 치료는 심근 수리 및 재생1,2에대한 잠재적 인 접근법으로 부상하고있다. 최근 동물모델 및 임상시험에서 양성결과에도 불구하고 심근수리를 위한 줄기세포 기반 요법의 적용은 극각심장조직에서 주입된 세포의 생존율이 낮고 생존율이낮아서3,4. 그 결과, 주사용 생체재료5,심장 패치6,세포시트7을포함한 세포 기반 조직 공학의 사용은 숙주 심근 내의 세포 보존 및 통합을 개선하기 위해 집중적으로 연구되고 있다.
생체 공학 심장 조직 수리에 대한 다양한 잠재적 접근법 중, 관해 줄기 세포 (MSC), 배아 줄기 세포 (ESC), 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)와 같은 적절한 세포 유형과 결합 된 주사용 하이드로겔은 심근 부위에 세포를 효과적으로 전달하는 매력적인옵션입니다 8,9. 잘 알려진 천연 폴리머인 젤라틴은 생체 적합성, 상당한 생분해성 및 생체 의학 응용 분야에서 사용되는 광범위한 생체 재료와 비교할 때 면역원성을 감소시키기 때문에 주사용 매트릭스로 사용할 수 있습니다. 젤라틴 기반 주 사용 플랫폼은 큰 잠재력을 가지고 있지만, 생체 내의 적용성은 낮은 기계적 강성과 생리 환경에서 쉽게 저하성에 따라 제한된 남아있다.
이러한 한계를 극복하기 위해 하이드록시페닐 프로피온산으로 구성된 젤라틴 기반 하이드로겔의 참신하고 간단한 디자인이 생체 내 적용을 위해 제안되었습니다. 젤라틴-하이드록시페닐 프로피오닉산(GH) 컨쥬게이트는 효소, 고추냉이 과산화효소(HRP)의 존재 시정에서 교차연결될 수 있으며, 그 후 하이드로겔 내의 다양한 약물, 생체분자또는 세포를 캡슐화하여 조직 공학 응용 분야에서 큰 잠재력을시사한다. 또한, 최근 캡슐화된 MSC를 함유한 GH 하이드로겔의 치료 효과를 조사하고, 뮤린모델(15)에서MI 후 성공적인 심장 수리 및 재생에 대한 사용을 입증하였다. 이 프로토콜에서, 우리는 GH 하이드로겔 내의 캡슐화 및 체외 3차원 (3D) 증식을 위한 간단한 기술을 설명합니다. 또한 관상 동맥 결찰및 MSC 로딩 GH 하이드로겔의 자궁 내 이식을 통해 뮤린 MI 모델을 생성하도록 설계된 외과 적 수술을 원각 심장으로 소개합니다.

<table><tbody><tr><td>4 % 파라포름알데히드(PFA)</td><td>인트론</td><td>IBS-BP031-2</td><td></td></tr><tr><td>5-0 실크 봉합</td>사 <td>AILEE</td><td>SK534</td><td></td></tr><tr><td>8-0 폴리프로필렌 봉합</td>사 <td>ETHICON</td><td>M8732H</td><td></td></tr><tr><td>8웰 챔버 슬라이드</td><td>Nunc LAB-TEK</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>Angiocath Plus(22GA) 카테터</td><td>BD Angiocath Plus</td><td>REF382423</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항근코제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>GYROGEN</td><td>1582MGR</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 510</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>MARIENFELD</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>Deluxe 고온 소작 키트</td><td>Bovie</td><td>QTY1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>이중 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EOSIN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr> HT110116 <tr><td>에탄올</td><td>EMSURE</td><td>K49350783 739</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Fechtner 결막 겸자 티타늄</td><td>WORLD PRECISISON INSTRUMENTS</td><td>WP1820</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein 이소티오시아네이트 이성질체 I (FITC)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>Forcep</td><td>HEBU</td><td>HB0458</td><td></td></tr><tr><td>제모 크림</td><td>Ildong 제약</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가열 패드</td><td>Stoelting</td><td>50300</td><td>동종 담요 시스템</td></tr><tr><td></td><td></td><td>50301</td><td>교체용 가열 패드 50300 (10 x 12.5cm)</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HHS80</td><td></td></tr><tr><td>양고추냉이 과산화물(HRP; 250-330 U/mg)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P8375</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소(H2O2에서 30 wt %<>2O)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>Iodine</td><td>Green Pharmaceutical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 세포 염색 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>기계식 인공호흡기</td><td>하버드 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>HANIL</td><td>Micro 12</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 바늘 홀더</td><td>KASCO</td><td>37-1452</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위</td><td>HEBU</td><td>HB7381</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>OLYMPUS</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>MT 염색 키트</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>HT1079-1SET</td><td>Weigert& 알스코오; s 철 헤마톡실린 용액</td></tr><tr><td></td><td></td><td>HT15-1KT</td><td>트리크롬 염색(Masson) 키트</td></tr><tr><td>파라핀</td><td>LK LABKOREA</td><td>H06-660-107</td><td></td></tr><tr><td>PBS 버퍼</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>PHK26 염색 키트</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>MINI26</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>HEBU</td><td>HB7454</td><td></td></tr><tr><td>수술 테이프</td><td>3M micopore</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>조직 카세트</td><td>Scilab Korea</td><td>Cas3003</td><td></td></tr><tr><td>변환기 젤</td><td>SUNGHEUNG</td><td>SH102</td><td></td></tr><tr><td>송어 - 바라커 바늘 홀더 곡선</td><td>KASCO</td><td>50-3710c</td><td></td></tr><tr><td>초음파 시스템</td><td>Philips</td><td>Affiniti 50</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>JUNSEI</td><td>제25175-0430</td><td></td></tr></tbody></table>호

murine 모델에서 심근 경색 후 msc 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

Intramyocardial Transplantation of MSC-Loading Injectable Hydrogels after Myocardial Infarction in a Murine Model

포스트인파르트 심부전을 예방하기 위한 현재 심장 줄기 세포 치료법에 직면한 주요 문제 중 하나는 부상당한 심근 내의 이식된 세포의 낮은 유지율과 생존율이 치료 효능을 제한하는 것입니다. 최근에는 스캐폴딩 생체 재료의 사용이 줄기 세포 치료제를 개선하고 극대화하는 데 주목받고 있습니다. 이 프로토콜의 목적은 주사용 하이드록시페닐 프로피온산(GH) 하이드로겔을 사용하여 골수 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 이식하는 간단하고 간단한 기술을 도입하는 것입니다. 하이드로겔은 시투에서 교차 연결되는 능력과 높은 생체 적합성으로 인해 심장 조직 엔지니어링 응용 을 위한 세포 전달 플랫폼으로서 유리합니다. 우리는 MSC 로딩 GH 하이드로겔 (MSC/하이드로겔)을 제조하고 체외 배양에서 3차원 (3D)에서 생존과 증식을 평가하는 간단한 방법을 제시합니다. 또한, 마우스에서 MSC/하이드로겔의 자궁내 이식 기술을 시연하여 왼쪽 전방 내림차순(LAD) 관상 동맥 결찰 및 후속 MSC/하이드로겔 이식을 통해 심근 경색(MI)을 유도하는 수술 절차를 설명하고 있습니다.

광원심근에 효과적으로 MSC를 전달하기 위해 도 1에 설명된 시투 교차 연결 하이드로겔에서 MSC 로딩이 이 프로토콜에 사용되었다. 생체 내 이식 이전에, GH 하이드로겔에서 MSC의 증식 및 생존은 체외 라이브/죽은 세포 염색 분석서에서 3D에 의해 확인되었다(라이브: 녹색; 죽은: 빨강). 그림 2에도시된 바와 같이, 대표적인 이미지는 충분한 MSC 확산을 나타내며, GH 하이드로겔 내의 분기 네트워크를 보여 주었다. 또한, 14일째에 광범위한 다세포 3D 구조가 명확하게 관찰되었으며, 이는 GH 하이드로겔이 캡슐화된 세포에 적합한 미세 환경을 제공할 수 있음을 나타낸다.
LAD 결찰을 통해 MI를 유도한 후, MSC 로딩 GH 하이드로겔은 peri-farct영역(그림 3A)으로이식되었다. <strong class="...

줄기 세포 기지를 둔 치료는 심근 경색 후에 부상당한 심장 조직을 복구하는 능률적인 전략으로 부상했습니다. 우리는 효소적으로 교차 연결 될 수있는 젤라틴 하이드로 겔을 사용하여 줄기 세포 이식에 대한 최적의 생체 내 응용 프로그램을 제공합니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

One of the major issues facing current cardiac stem cell therapies for preventing postinfarct heart failure is the low retention and survival rates of ...

이 방법은 경색된 심장에서 이식된 세포의 낮은 보유 및 생존에 대한 낮은 적용성과 같은 현재 악화된 심장 치료의 주요 문제를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 이 방법은 쥐 모델에서 주사 가능한 하이드로겔을 사용하여 줄기세포를 사용한 심근 이식을 연구하는 신뢰할 수 있는 기술을 제공할 수 있으며, 이는 심근 손상 후 심장 조직 복구 및 재생을 조사하는 데 사용할 수 있는 훌륭한 플랫폼입니다. 이 기술의 주요 장점은 현장 가교 커버 주사 가능한 하이드로겔을 사용하여 심근 내 이식 후 이식된 줄기 세포의 보유 및 생존을 개선할 수 있는 실현 가능한 방법이라는 것입니다.이러한 하이드로겔은 줄기세포뿐만 아니라 성장 인자, 유전 물질 및 약물을 전달하여 경색된 심장 조직에서 치료 효과를 극대화하는 등 심장 조직 공학에 다양한 기회를 제공합니다. 체외 실험 절차를 시연하는 것은 저희 연구실의 연구 기술자인 이은미입니다. 박은혜 교수와 성은화 연구기술자가 in-vivo 실험 절차를 시연합니다.중간엽 줄기 세포 또는 MSC를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 100mm 배양 접시에 배양합니다. 세포가 80% 합류점에 도달하면 DPBS로 접시를 두 번 씻고 섭씨 37도에서 3분 동안 1ml의 트립신 대용품을 배양합니다. 그런 다음 9ml의 배양 배지를 세포에 추가하고 500배 G에서 3분 동안 원심분리합니다.생성된 상등액을 폐기합니다. 1ml의 PBS에 세포를 재현탁시키고 얼음 위에서 세포 현탁액을 유지합니다. 10마이크로리터의 세포 현탁액을 10마이크로리터의 트리판 블루로 희석하고 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 농도를 측정합니다.MSC를 10의 1배의 밀도로 1밀리리터당 7번째 세포로 재현탁하고 1밀리리터 튜브로 옮깁니다. PBS에서 6.25%GH 접합 용액을 준비하고 두 개의 바이알로 분리합니다. 다음으로 GH 용액을 HRP 밀리리터당 6마이크로그램 또는 0.07%과산화수소와 혼합합니다.세포 현탁액을 1000배 G로 잠시 원심분리하고 생성된 상등액을 조심스럽게 흡인합니다. 그런 다음 세포 펠릿을 GH 용액 A와 혼합합니다.GH 용액 A와 GH 용액 B의 MSC를 이중 주사기의 양쪽에 넣습니다. 300마이크로리터의 MSC와 결합된 GH 용액을 밀리리터당 500만 개의 최종 밀도로 8개의 웰 챔버 슬라이드에 플레이트화합니다.현장 하이드로겔 형성 및 효소 가교를 통한 후속 MSC 캡슐화 후 10% FBS와 1% 항생제 항진균 용액을 함유한 700마이크로리터의 DMEM을 추가합니다. 슬라이드를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양하고 2-3일마다 배양 배지를 교체합니다. 수술 전에 제모 크림을 사용하여 마우스 가슴을 제거하고 요오드로 피부를 살균합니다.마우스를 수술대에 놓고 기관에 카테터를 삽입하여 삽관하여 기계적 환기를 통해 산소를 보충합니다. 수술용 가위를 사용하여 피부를 부드럽게 자릅니다. 그런 다음 마이크로 가위로 늑간 근육을 관통하십시오.열린 흉강을 유지하기 위해 5-O 실크 봉합사를 사용하여 두 번째와 세 번째 왼쪽 갈비뼈를 분리합니다. 8-0 바늘 홀더를 사용하여 왼쪽 전방 하행 관상 동맥을 조심스럽게 결찰합니다. 폴리프로필렌 봉합사를 봉합하고 전기소작을 사용하여 봉합사를 절단합니다. 전방 좌심실 벽에서 즉각적인 색 변화를 관찰하십시오.심근경색을 유도한 후, 10마이크로리터의 MSC 로딩 GH 용액을 경색 경계 구역의 두 개의 다른 지점에 주입합니다. 열린 흉강을 복원하고 5-0 봉합사를 사용하여 근육과 피부를 봉합합니다. 기관 튜브를 제거하고 마우스를 적외선 램프 아래의 케이지에 넣습니다. 회복하는 동안.심초음파검사를 수행하고 LV 전벽, LV 내벽 및 LV 후벽에 해당하는 선을 측정하여 심벽 두께, 챔버 치수 및 분획 단축을 얻습니다. 생체 내 이식 이전에 GH hydragels에서 MSC의 증식 및 생존은 3D 체외 사체 염색 분석으로 확인되었습니다. 대표 이미지는 GH 하이드로겔 내 분지형 네트워크를 보여주는 충분한 MSC 증식을 보여주었습니다.MSC의 광범위한 다세포 3D 구조가 14일째에 명확하게 관찰되었으며, 이는 GH 하이드로겔이 캡슐화된 세포에 적절한 미세환경을 제공할 수 있음을 나타냅니다. 심근경색 유도 후, MSC 로딩 GH 하이드로겔을 심근 경색 주위 부위에 심근 내 이식했습니다. MSC와 겔은 경색 부위 내에서 적절하게 유지되었습니다.MSC는 GH 하이드로겔에 잘 통합되었습니다. MSC 로딩 GH 하이드로겔의 치료 효과를 확인하기 위해 이식 후 28일째에 심장초음파와 조직학적 분석을 통해 심장 기능 및 구조의 변화를 평가하고 다른 치료 그룹 간에 비교했습니다. 대표적인 심장초음파검사에서는 MSC 겔 처리군에서 분획 단축(fractional shortening), 박출률(ejection fraction), 수축기 말단 용적(end systolic volume) 등 심장 기능이 개선된 것으로 나타났습니다.또한, 조직학적 분석은 MSC 겔 처리군이 다른 그룹보다 섬유화가 적고, 경색벽이 더 두꺼우며, 경색 크기가 더 작았으며, 이는 이 프로토콜이 좌심실 리모델링을 현저히 약화시켰음을 나타냅니다. 이 기술을 사용하여 장기적으로 줄기세포와 증식을 달성하고 쥐 모델에서 심근경색 후 심장 구조와 기능을 크게 개선했습니다. 이 기술은 심장 조직 복구 및 재생을 제공하여 경색 후 심부전을 예방하기 위한 새로운 전략으로 대형 동물에 사용하기 위해 확장될 수 있으며 임상 번역으로 확장될 수 있습니다.

intramyocardial-transplantation-msc-loading-injectable-hydrogels

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 동영상은 심근 국소 빈혈의 pathobiological 및 pathophysiological 프로세스를 연구하기위한 빠르고 안정적​​인 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

내사 - 결합 : 심근 경색의 Murine 모델

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

심장 초음파 유도 경피적 심근 주입 뮤린 마음에 유전자 전달 제 또는 세포의 전달을위한 효율적인 신뢰성 있고 타겟팅 양상을 나타낸다. 이 프로토콜에 설명 된 단계에 따라, 운전자는 신속하게이 다재 다능 한, 최소 침습 기술에서 경쟁력이 될 수 있습니다.

마우스의 초음파 유도 경 흉부 심근 내 주입

이 프로토콜은 하이드로겔 시스템과 피브린 기반 접착제를 사용하여 심근 경색의 줄기 세포 치료를 위한 불량한 세포 생착의 한계를 완화하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 사용하면 경색 후 세포와 조직의 접촉을 유지할 수 있어 손상 부위에서 유익한 제제의 치료 잠재력을 높일 수 있습니다.

하이드로 겔은 구축 및 쥐 심근 경색 모델에서 치료를 제공하기 위해 접착제 접근을 섬유소 기반.

장 염증의 모델에서 murine 연구 중간 엽 줄기 세포 (MSC)의 작은 비율 (1 ~ 5%) 또는 정 맥 주입 intraperitoneally 집 염증이 콜론과1,2에 설명 했다. 이 연구는 MSCs의 초음파 유도 intracardiac 주사 소장을 증가 지역화 될 보여줍니다.

초음파 유도 Intracardiac 주입 실험 선 동적인 장 질병의 Murine 모델에 사용 하기 위해 내장을 추적 증가 인간 중간 엽 줄기 세포의

이 프로토콜에서, 우리는 심근 세포 분화 및 정제를 위해 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하는 방법에 대해 설명하고 정교하게, 그리고 더 나아가, Rho 관련 단백질 키나아제 억제제와 함께 이식 효율을 개선하는 방법에 대해 마우스 심근 경색 모델에서 전처리.

로 키나아제 활성의 일시적인 억제를 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포의 생착을 강화

우리는 좌측 경부 동맥 막힘과 세포 기반 치료를 위한 줄기 세포의 심혈 투여의 효과 및 안전성 을 테스트하기 위해 신속한 속도에 의해 유도된 심부전의 돼지 모델을 확립하고자 했습니다.

줄기 세포 치료를위한 심근 경색 심부전의 돼지 모델 설립

줄기 세포는 심근 손상을 가진 개별을 위한 잠재적인 처리로 지속적으로 조사됩니다, 그러나, 부상당한 조직 내의 그들의 감소된 생존및 보존은 그들의 장기 효험에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 원고에서 우리는 허혈 재관전 손상의 뮤린 모델에서 줄기 세포 전달을위한 대체 방법을 설명합니다.

뮤린 모델에서 허혈혈 재관류 부상 후 줄기 세포의 지연 된 자궁 내 납품

이 프로토콜은 심부전 모델링하는 경질 마우스의 에피카듐에 3D 생체 인쇄 패치를 이식하는 것을 목표로합니다. 그것은 마취에 관한 세부 사항을 포함, 수술 가슴 개폐, 왼쪽 전방 내림차순 (LAD) 관상 동맥의 영구 결찰 및 심장의 경각진 영역에 생체 인쇄 패치의 적용.

심근 경색의 뮤린 모델에서 3D 생체 인쇄 패치의 이식

생쥐의 심근 경색 부위 주변의 초음파 유도 세포 전달은 안전하고 효과적이며 편리한 세포 이식 방법입니다.

심근 경색 마우스에서 초음파 유도 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 이식

이 기사에서는 29G x 88mm 바늘을 사용하여 심근경색의 쥐 모델에서 심초음파 유도 심근내 주사를 위한 최적화된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 이 기술은 경색 주위 부위에 직접 치료제를 강력하고 정확하며 재현 가능한 전달을 보장합니다.

심근경색의 쥐 모델에서 표적적이고 신뢰할 수 있는 심근내 줄기세포 전달을 위한 심초음파 유도 주사

학습하세요 심근 경색 후 줄기세포 이식을 위한 젤라틴 하이드로겔 기법을 murine 모델에서. 이 방법은 세포 유지율과 생존율을 높여 심장 조직 재생 연구에 활용됩니다.

Murine 모델에서 심근 경색 후 MSC 로딩 주사용 하이드로겔의 자궁 내 이식

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