COMSTAT 소프트웨어를 사용하여 체외 생물막 아키텍처에 대한 항균제의 효과 정량화

이 프로토콜의 중요성은 다양한 항균 조건에서 체외 생물막 구조를 정량화하기 위한 간단하고 재현 가능한 프레임워크를 제공한다는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 COMSTAT의 수동 작동과 관련된 주관적인 변형을 제거하는 데 도움이 되며, 궁극적으로 연구 센터 전반에 걸쳐 실험의 표준화 및 투명성을 용이하게 한다는 것입니다. 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양을 이미징하려면 적절한 레이저 여기 파장과 필터 세트가 장착된 컨포칼 현미경의 스테이지에 플레이트를 놓습니다.

또한 20-25x 침수 렌즈를 사용하여 하층에서 각 생물막 세그먼트의 상단까지 0.3마이크로미터 단위로 최소 6개의 레이어드 z-stack 이미지를 캡처합니다. 그런 다음 COMSTAT 분석을 위해 이미지를 OME-TIFF로 저장합니다. 모든 이미지를 획득했으면 ImageJ에서 COMSTAT2 패키지를 열고 바탕 화면에 소스 폴더를 만듭니다.

폴더에 단일 OME-TIFF를 추가하고 소스 폴더에서 OME-TIFF를 엽니다. 바이오매스가 없는 빈 레이어를 삭제합니다. 파일(File), 가져오기(Import) 및 이미지 시퀀스(Image Sequence)를 선택하여 파일을 ImageJ로 가져옵니다.

소스 폴더를 열지 않고 찾아서 강조 표시하고 선택을 클릭합니다. 시퀀스 옵션 창이 나타나면 확인을 클릭합니다. 이미지(Image), 변환(Transform) 및 대칭 이동 Z(Flip Z)를 선택하여 하위층이 스택의 맨 위에 오도록 생물막의 방향을 대칭 이동합니다. 이미지 속성을 정의하려면 이미지 및 속성을 선택하면 소스 창이 나타납니다.

길이 단위를 미크론으로 지정하고, 복셀 깊이를 0.3으로 정의한 다음 확인을 클릭합니다. 이미지(Image), 조정(Adjust) 및 임계값(Threshold)을 선택합니다. 임계값 창에서 이미지 임계값을 조정하려면 아래쪽 슬라이더를 맨 오른쪽에 배치하여 최대 임계값을 수동으로 설정하고 위쪽 슬라이더를 사용하여 최소 임계값을 설정합니다. 그런 다음 이미지 창의 슬라이더를 사용하여 각 레이어를 스크롤하여 스택 전체에서 배경 노이즈가 충분히 제거되었는지 확인하고 설정을 선택하여 낮은 임계값을 수정합니다.

임계값 수준 설정 창에서 확인을 선택하고 최대 임계값을 비슷하게 설정하고 수정합니다. Apply(적용)를 선택하고, 표시되는 convert stack to binary(스택을 바이너리로 변환) 창에서 OK(확인)를 클릭하고, 임계값 창을 종료합니다. 플러그인, Bio-Formats 및 Bio-Formats Exporter를 선택하여 소스 폴더에 새 파일 이름으로 파일을 저장합니다.

Bio-Formats Exporter multiple files 창이 나타나면 확인을 선택합니다. Bio-Formats Exporter 옵션 창이 나타나면 확인을 다시 선택합니다. COMSTAT를 실행하려면, 플러그인을 선택하고 COMSTAT2, 정보 창이 나타나고, 관찰된 디렉토리 창을 OK.In 선택하고, 추가를 선택하고, 소스 폴더를 찾아 강조 표시하고, 선택을 강조 표시하고, 선택을 클릭합니다. 분석할 OME-TIFF를 나열하는 Images in Directories 창이 나타납니다.

COMSTAT2.1 창에서 자동 임계값 Otsu의 방법 및 연결된 볼륨 필터링을 선택 취소하여 소프트웨어가 개별 OME-TIFF에 대해 사전 설정된 임계값을 사용하도록 합니다. COMSTAT2.1 창에서 Biomass, Thickness Distribution 및 Surface Area를 선택하고 Go를 클릭하여 프로그램을 실행합니다. 출력 데이터가 로그 창에 표시됩니다.

측정값은 소스 폴더에 TXT 파일로 자동 저장됩니다. 이 대표적인 분석에서는 감염된 낭포성 섬유증 환자로부터 배양한 녹농균 분리물을 사용하여 체외 생물막 구조에서 항균 유도 변화를 부정확하게 정량화하는 이 접근법의 강점을 입증했습니다. 또한 생세포 이미징은 생물막 특이적 단클론 및 토브라마이신 처리 전후에 녹농균 생물막 구조의 변화를 시각화할 수 있습니다.

COMSTAT 데이터 분석은 대조군 배양과 비교하여 처리된 생물막 구조 간에 상당한 차이를 보여주었습니다. 토브라마이신을 처리한 배양물에서 평균 두께와 바이오매스의 명확한 감소가 관찰되었습니다. 그러나, 항체의 존재 하에서, P.aeruginosa 생물막은 이러한 토브라마이신에 의해 유도된 구조적 변화에 내성이 있었다.

표면 대 바이오 부피 비율을 조사할 때, 토브라마이신에 노출된 생물막과 노출되지 않은 생물막 모두에서 항체의 존재 상태에서 상당한 감소가 관찰되었으며, 이는 항체 처리된 배양물에서 응집체가 형성됨을 나타냅니다. 이 절차는 생물막 매트릭스를 파괴하는 데 사용되는 다양한 항균제의 효과를 정량적으로 평가하거나 비교하기 위해 수행할 수 있습니다. 이 기술을 일반적인 프레임워크로 사용하여 연구원들은 생물막 이질성을 더 잘 묘사하기 위해 ImageJ에 새로운 수학적 모델과 알고리즘 플러그인을 포함하도록 프로토콜을 개선하는 다양한 방법을 모색할 수 있습니다.