Name: 절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 배우세요 절개된 임플란트 조직에서 세포를 분리하고 유세포 분석으로 면역 반응을 특성화하는 방법을. 마우스 사분근육과 소화 효소를 사용하며, 이 기술은 향상된 의료 임플란트 설계에 기여합니다.

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이 연구는 국립 생물 의학 이미징 및 생물 공학 연구소 (National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)를 포함한 NIH의 교내 연구 프로그램 (Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 면책 조항: NIH, 그 임원 및 직원은 회사, 제품 또는 서비스를 추천하거나 보증하지 않습니다.

참고: 그림 1 은 유세포 분석 프로토콜에 대한 개요를 제공합니다.
1) 시약 준비
<ol><li>효소 희석 및 조직 배양을 위한 배지를 준비합니다.<ol><li>5mL의 RPMI 배지에 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산(HEPES) 완충 용액을 넣고 잘 흔듭니다. 더 사용할 때까지 배지를 4°C에서 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>효소 용액의 부피를 계산합니다. 참고: 효소 용액의 부피는 6웰 플레이트에서 깍둑썰기한 조직을 소화하는 데 필요한 효소(콜라겐분해효소 및 DNase I)를 포함하는 배지의 부피입니다. 샘플 수에 따라 다릅니다.<ol><li>다음 방정식을 사용하여 필요한 부피를 계산하십시오. (분해할 시료 수) × 5mL의 무혈청 RPMI와 10mM HEPES 완충액 참고: 예를 들어, 0.1-0.3g의 절개된 비장에 대해 5mL의 배지를 사용하여 효소 용액을 준비합니다. 이 원고에 기술된 효소 소화 프로토콜은 주로 뇌, 신장, 피부, 간, 폐, 비장, 근육을 포함하는 마우스에서 해부된 연조직(0.1 내지 1 g)과 합성 물질 또는 세포외 기질 단백질로 만들어진 피하 임플란트 주위의 캡슐을 위한 것이다. 단단한 연골 조직을 소화하려면 다양한 조건과 소화 효소의 양이 필요할 수 있으며, 이는 최적화를 통해서만 확인할 수 있습니다.</li>
		<li>효소 용액에 필요한 콜라겐 분해 효소와 DNase의 양을 계산하십시오. 참고: 이 프로토콜에서는 0.25mg/mL의 콜라겐분해효소와 0.2mg/mL의 DNase I이 사용되었습니다. 콜라겐분해효소와 DNase에 필요한 작업 농도는 조직의 종류에 따라 다를 수 있다19.</li>
	</ol></li>
	<li>1μL의 인산염 완충 식염수(PBS)에 1μL의 생존도 염료( 재료 표 참조)를 첨가하고 용액을 와류시켜 1:1000 생존도 염료 용액을 준비합니다. 더 이상 사용할 때까지 용액을 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.</li>
	<li>PBS 100mL에 소 혈청 알부민(BSA) 1g을 첨가하여 염색 완충액을 준비하고 BSA가 완전히 용해될 때까지 용액을 소용돌이칩니다. 더 이상 사용할 때까지 용액을 4°C에서 보관하십시오.</li>
</ol>2) 효소 분해판 설정
<ol><li>각 웰에 70μm 셀 스트레이너가 있는 6웰 플레이트를 설정합니다. 1.1.1단계에서 준비한 배지 3mL를 각 웰에 넣고 얼음 위에서 배양합니다.</li>
	<li>나머지 배지(2mL/웰)를 37°C의 인큐베이터 또는 수조에 보관하여 계산된 양의 콜라겐분해효소 및 DNase I을 현탁시킵니다(단계 1.2.2).</li>
</ol>3) 세포 분리
<ol><li>절개한 임플란트/조직을 접시에 넣고 가위를 사용하여 곱게 깍둑썰기합니다. 또는 조직 해리기 또는 휴대용 균질화기를 사용하여 기계적 파괴 방법을 활용하십시오. 백혈구의 수가 많기 때문에 비장을 절개하여 각 실행에서 염색 대조군으로 활용하십시오. 알림: 일부 재료는 더 높은 수준의 섬유증을 유발하므로 이 프로토콜은 섬유화가 높은 재료와 최소 섬유화 재료 모두에 적용할 수 있습니다. 그러나 각 처리 방법은 염색 전에 분해 후 세포 수율과 생존력 모두에 대해 평가해야 합니다. 해부 중 말초 혈액 오염을 피하십시오.</li>
	<li>콜라겐분해효소 및 DNase I(1.2.2단계에서 계산된 부피)을 37°C로 데온한 나머지 RPMI(2mL)에 추가합니다. 각 웰에 완전한 효소 용액 2mL를 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 배양된 셰이커에 넣고 37°C 및 100rpm에서 45분 동안 보관합니다. 알림: 플레이트를 쌓을 때 적절한 열 전달을 방해할 수 있으므로 주의하십시오.</li>
	<li>한편, 가위로 3μL 팁 끝에서 4-1000mm를 잘라 현탁액 디스펜싱 팁을 준비합니다. 배양 후 웰의 현탁액을 위아래로 피펫팅하여 잘게 썬 팁을 사용하여 완전히 혼합합니다. 세포 여과기를 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓고 소화된 용액을 세포 여과기에 통과시킵니다. 참고: 70μm 세포 여과기는 알긴산과 같은 이식된 생체 재료에서 세포를 분리하기에 충분합니다. 더 높은 순도가 필요한 경우 밀도 구배 분리와 같은 공정을 사용하여 농축된 백혈구 집단을 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>1x PBS 용액으로 웰을 헹구고 스트레이너를 통해 헹굼량을 옮긴 다음 튜브의 부피가 50mL에 도달할 때까지 1x PBS 용액으로 스트레이너 세척액을 추가합니다. 참고: 1x PBS는 분해물의 점도 증가를 방지하고 원심분리 중에 세포 펠릿을 허용하기 위해 실온에 있어야 합니다.</li>
	<li>실온에서 300× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 펠릿을 방해하지 않고 혈청학적 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. 펠릿을 1x PBS의 1000μL에 다시 현탁시키고 현탁액을 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 혼합하고 자동 세포 계수기를 사용하여 세포를 계수하기 위한 계수 챔버 슬라이드 또는 현미경으로 기존 방법을 통해 계수하기 위해 혈구계에 현탁액을 로드합니다. 또는 유세포 분석 세포 계수 비드를 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>4) 유세포 분석을 위한 염색
<ol><li>그림 2는 45개의 샘플, 형광 마이너스 1(FMO) 대조군, 보정 대조군 및 완전히 염색된 비장 시료 대조군이 있는 14색 실험의 플레이트 레이아웃 예를 참조하십시오. 총 세포 수를 추정한 후 각 샘플에 대해 1 × 10 6 세포를 염색하는 데 필요한 세포 현탁액의 부피를 계산하고 각 보정 및 FMO 제어에 대해 0.5 × 106 세포를 계산합니다. 필요한 부피의 셀 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트의 웰에 분주하고 1x PBS로 부피를 100μL로 구성합니다. 참고: 예를 들어, 단계 3.6에서 얻은 1000μL의 셀 현탁액이 40 × 10 6 셀을 포함하는 경우 1 × 10 6 셀에 대해 1000/40 × 106 = 25μL의 셀 현탁액이 필요합니다.</li>
	<li>플레이트를 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인한 다음 100μL의 1:1000 생존도 염료 용액을 사용하여 시료 웰 및 보상 제어 웰에 세포를 재현탁시켜 생존율을 결정합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>FMO 및 염색되지 않은 웰뿐만 아니라 다른 보정 웰에 있는 세포의 경우 100μL의 1x PBS로 재현탁합니다.</li>
	<li>어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>그 동안 샘플 및 FMO 대조군을 염색하기 위한 표면 항체 칵테일을 준비합니다(샘플당 50μL 또는 FMO). 항체 칵테일의 예에 대해서는 표 1 을 참조한다.</li>
	<li>배양 후 각 웰에 1x PBS 100μl를 추가하고 4°C에서 300× g 에서 5분 동안 스핀다운합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 200μL의 염색 완충액(1x PBS + 1% BSA)에 재현탁시킵니다. 300 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 50μL의 1x PBS로 보상, FMO 및 염색되지 않은 웰에 세포를 재현탁시킵니다. 항체 칵테일 50μL를 각 샘플 웰 및 FMO 웰에 추가합니다. 각각의 항체를 서로 다른 보상 웰에 추가합니다.</li>
	<li>4°C의 어두운 곳에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 배양 후 각 웰에 150μL의 염색 완충액을 추가하고 세포 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고, 200μL의 염색 완충액으로 세포를 재현탁하고, 세포 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>고정하지 않고 검체를 분석하는 경우 200μL의 염색 완충액에 재현탁하고 유세포분석기 설정 및 검체 분석에 대한 섹션 6으로 진행합니다. 세포를 고정하는 경우 세척 후 상청액을 흡인하고 4 % 파라 포름 알데히드와 같은 고정제 100μL를 첨가합니다. 세포 내 마커를 염색하는 경우 세포 내 염색에 대한 섹션 5로 진행하여 세포를 고정하고 투과시킵니다( 재료 표 참조). 4°C의 어두운 곳에서 20분 동안 세포를 배양합니다. NOTE: 고정은 일부 형광단의 형광 강도에 영향을 줄 수 있으므로 고정 여부와 관계없이 각 패널을 평가하십시오.</li>
	<li>배양 후 1x PBS 100μL를 첨가한 후 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상층액을 흡입하고 1x PBS에 재현탁한 다음 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>200μL의 염색 완충액에 세포를 다시 현탁시키고 유세포 분석 전에 4°C에서 보관합니다.</li>
</ol>5) 세포내 염색
<ol><li>세포 내 마커에 대한 고정 및 투과화를 위해 4.11단계에서 계속하여 적절한 완충액 100μL를 추가합니다. 세포를 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고, 펠릿을 200 μL의 고정제-투과성 용액에 다시 현탁시키고; 세포를 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 적절한 완충액에 희석된 세포내 항체로 펠릿을 재현탁시킵니다. 참고: 항체 유형 및 희석액은 표적 세포에 따라 다릅니다. 예를 들어, 일반적인 세포 내 마커 중 하나는 조절 T 세포를 위한 포크헤드 박스 P3이며, 이는 1:100 희석으로 자주 사용됩니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 어두운 곳에서 4°C에서 45분 동안 배양합니다. 배양 후 적절한 완충액 150μL를 추가하고 현탁액을 350× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 200μL의 염색 완충액에 세포를 다시 현탁시킨 후 4°C에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 유세포 분석을 위해 200μL의 염색 완충액에 세포를 흡입하고 다시 현탁시킵니다.</li>
</ol>6) 세포분석기 및 보상 설정
<ol><li>샘플을 실행하기 직전에 세포 기반 보상과 달리 비드 기반 보정을 사용하는 경우 보정 비드( 재료 표 참조)를 준비합니다.<ol><li>각 형광 크롬 접합 항체에 대해 별도의 마이크로 원심분리기 튜브에 라벨을 붙이고 1x PBS 100μL를 추가한 다음 각 튜브에 항마우스 음성 대조군 보상 비드 1방울과 양성 대조군 보상 비드 1방울을 추가합니다. 각 개별 튜브에 적절한 항체 1μL를 추가합니다. 획득하기 전에 5분 동안 와류하고 배양합니다. 알림: BUV737과 같은 일부 염료는 비드에 결합할 수 없으므로 셀 기반 컨트롤을 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>추적 비드로 유세포분석기 설정을 실행하여 각 실험 전에 유세포분석기를 보정하고 각 실험에 대한 유세포분석기 설정을 유지합니다.</li>
	<li>시료를 분석하기 전에 염색되지 않은 시료를 실행하여 측면 산란(SSC) 대 전방 산란(FSC) 플롯에서 세포 집단을 조정하여 세포 집단이 플롯의 중앙에 있고 스케일을 벗어나지 않도록 유세포 분석기를 조정합니다.</li>
	<li>염색된 샘플을 잠깐 실행하여 FSC 및 SSC와 각 채널에 대한 전압을 조정하여 이벤트가 각 채널의 로그 스케일을 벗어나지 않도록 합니다. 각 보상 제어에 대해 5,000개의 이벤트를 기록한 다음 양성 및 음성 모집단의 게이팅을 수행합니다. 보상 행렬을 계산한 다음 표본을 실행하여 관심 있는 모집단에 대해 최소 1,000개의 이벤트를 수집합니다. 알림: 더 큰 색상 패널에 대한 보정은 자동 보정이 과대 또는 과소 보정되기 쉬울 수 있으므로 확인해야 합니다. 각 매개변수는 과잉 또는 과소 보정의 징후를 모니터링하기 위해 다른 모든 매개변수에 대해 그래프로 표시되어야 하며 각 단일 색상 컨트롤을 평가해야 합니다. 더 큰 색상의 실험에 대한 복잡한 보정은 광범위한 유세포 분석 경험이 있는 공동 연구자 또는 핵심 시설의 도움을 받아 수행해야 합니다. 스펙트럼 세포분석기와 같은 새로운 유형의 유세포 분석기는 스펙트럼 불혼합(spectral unmixing)으로 알려진 프로세스를 통해 형광단의 전체 스펙트럼을 활용하며, 이는 표준 보상만 사용하는 것에 비해 형광 중첩을 더 명확하게 구분할 수 있습니다22.</li>
</ol>

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<li>Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+leukocyte+populations+in+fresh+and+cryopreserved+sputum+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B%3A+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry.</a> Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).</li>
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본 연구에서는 균일한 세포 현탁액을 얻기 위해 생체재료 임플란트에서 세포를 분리하는 상세한 방법론을 기술한다. 또한 multicolor 유세포 분석을 위한 세포 현탁액을 염색하기 위한 자세한 프로토콜과 최적의 결과를 위해 유세포 분석기를 구성하는 단계가 제공되었습니다. 세포 분리 방법은 여러 단계를 포함할 수 있으며, 종종 수동 조직 절개 후 단백질 분해 효소를 사용한 효소 분해를 사용하여 조직의 세포외 기질을 해리하고 세포-세포 접합을 파괴하여 조직에서 개별 세포를 해방합니다. 분해 후, 남아 있는 파편을 제거하고 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 세포 변형과 같은 추가 처리가 필요합니다. 높은 수준의 파편 또는 다른 세포 유형(예컨대, 종양)을 갖는 일부 샘플은 밀도 분리 배지(23)의 사용을 통해 보다 철저한 클린업을 필요로 할 수 있다. 적절한 샘플 세척이 없으면 파편이나 관심 모집단을 가리는 다른 세포 집단으로 인해 데이터가 왜곡될 수 있습니다. 과도한 파편은 또한 세포분석기 ...

의학 분야의 발전으로 인해 손상된 조직의 기능 또는 재성장을 지원하기 위해 이식된 재료가 자주 사용되었다 1,2. 여기에는 심박 조율기, 재건 미용 임플란트 및 골절 고정에 사용되는 정형외과 플레이트와 같은 장치가 포함됩니다 3,4. 그러나 이러한 임플란트를 만드는 데 사용되는 재료와 임플란트가 이식되는 위치는 이러한 임플란트의 성공을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다 5,6,7. 이러한 임플란트는 이물질로서 숙주로부터 면역 반응을 일으켜 거부 반응 또는 내성을 유발할 수 있다8. 이 요인은 착상 후 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 물질을 생성하기 위한 생체 재료 연구를 주도했습니다 9,10,11,12.
면역 반응은 손상된 조직 또는 장기를 교체하기 위해 실험실에서 생체 재료 골격(스캐폴드) 주위에 조직 또는 장기를 성장시키는 재생 의학 분야에서 필수적인 요구 사항입니다13,14,15,16. 재생 의학의 목표는 세포, 신호 및 지지체를 사용하여 누락되거나 손상된 조직을 대체하는 것이며, 각각은 면역 반응에 의해 크게 조절될 수 있습니다17. 더욱이, 면역 반응의 결핍이 원하는 경우에도, 면역 활성의 결핍은 매우 드물게 바람직한 조절 프로파일의 존재가 아니라 면역 활성의 부재이다18. 유세포 분석과 같은 기술은 임플란트 장치를 코팅하거나 조직 공학을 위한 스캐폴드를 개발하는 데 사용되는 다양한 생체 재료에 대한 면역 반응 패턴을 특성화하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다19.
이 정보는 궁극적으로 면역 체계가 잘 견딜 수 있는 임플란트용 생체 재료를 개발하거나 조직 공학에서 건설적인 역할을 할 수 있는 지지체를 개발하는 데 도움이 될 것입니다. 유세포 분석에 의한 분석을 위한 시료의 적절한 준비는 형광 활성화 세포 분류를 통한 면역 특성 분석에서 부정확한 결과를 피하기 위한 중요한 단계입니다20,21. 따라서 본 연구는 스캐폴드 조직에서 세포를 분리하고, 세포 현탁액을 염색하고, 유세포 분석을 통해 분석하는 데 활용할 수 있는 상세한 방법론을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-000-646</td><td></td></tr><tr><td>BD Brilliant Stain Buffer Plus</td><td>BD Biosciences</td><td>566385</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td> 세포 <td>고정만 용</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Millipore Sigma</td><td>A7906</td><td>FACS 준비용 염색 완충액</td></tr><tr><td>CD11b AF700</td><td>Biolegend</td><td>101222</td><td>클론: M1/70</td></tr><tr><td>CD11c PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>117325</td><td>클론: N418</td></tr><tr><td>CD197 PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120121</td><td>클론: 4B12</td></tr><tr><td>CD200R3 APC</td><td>Biolegend</td><td>142207</td><td>클론: Ba13</td></tr><tr><td>CD206 PE</td><td>Biolegend</td><td>141705</td><td>클론: C068C2</td></tr><tr><td>CD45 BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612778</td><td>클론 : 104 / A20</td></tr><tr><td>CD86 BUV395</td><td>BD Biosciences</td><td>564199</td><td>클론 : GL1</td></tr><tr><td>CD8a BV421</td><td>Biolegend</td><td>100737</td><td>클론 : 53-6.7</td></tr><tr><td>Comp Bead anti-mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>552843</td><td>보상 제어</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore Sigma</td><td>11284932001</td><td>Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I</td></tr><tr><td>)F4/80 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>123113</td><td>클론: BM8</td></tr><tr><td>Fc 블록</td><td>Biolegend</td><td>101301</td><td>클론: 93</td></tr><tr><td>고정/투과화 솔루션 키트</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>세포의 고정 및 투과화용.</td></tr><tr><td>HEPES 완충액</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td>세포 배지를 보충하기 위한 완충액</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>정제된 콜라겐 분해 효소 I 및 콜라겐 분해 효소 II</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 혼합물 Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L23105</td><td>Viability dye</td></tr><tr><td>Ly6c AF488</td><td>Biolegend</td><td>128015</td><td>Clone: HK1.4</td></tr><tr><td>Ly6g BV510</td><td>Biolegend</td><td>127633</td><td>클론: 1A8</td></tr><tr><td>MHCII BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>742894</td><td>클론: M5/114.15.2</td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염</td>수 <td>Thermo Fisher</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875176</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>Siglec F BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>740388</td><td>클론: E50-2440</td></tr><tr><td>V-bottom 96-well plate</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

실험실에서 배양한 조직이나 의료 기기를 개인에게 이식하는 성공 여부는 이식 숙주의 면역 반응에 달려 있습니다. 임플란트를 이물질로 간주하면 적대적이고 조절되지 않는 면역 반응은 임플란트의 거부 반응을 초래할 수 있는 반면, 조절된 반응과 항상성의 회복은 임플란트의 수용으로 이어질 수 있습니다. in vivo 또는 ex vivo 환경에서 해부된 임플란트의 미세환경을 분석하면 면역 반응 패턴을 이해하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 궁극적으로 차세대 생체 재료 개발에 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 세포 표면 마커를 기반으로 면역 세포와 그 하위 집합을 특성화하는 데 잘 알려진 기법입니다. 본 연구에서는 절개된 임플란트 조직에서 균일한 세포 현탁액을 분리하기 위해 세포 스트레이너를 통한 수동 다이싱, 효소 분해 및 여과를 기반으로 하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 유세포 분석을 통해 이러한 분리된 세포를 특성화하고 정량화하기 위한 초기 유세포 분석기 설정 단계와 함께 multicolor 유세포 분석 염색 프로토콜이 설명되었습니다.

면역 분석을 위한 유세포 분석 패널의 개발 과정은 종종 기존 데이터 및 해당 분야의 문헌과 결과를 비교하는 데 의존합니다. 유세포 분석에서 집단이 어떻게 존재할 수 있는지에 대한 지식은 데이터의 적절한 해석에 매우 중요합니다. 어쨌든 개체군과 세포 유형은 조직마다 다르게 나타날 수 있으므로 약간의 변동성이 예상됩니다. 잘 정의된 대조 조직의 맥락에서, 이러한 염색 최적화는 잘 연구된 세포 유형을 가진 알려진 조직에 대해 평가될 수 있습니다. 그림 3 은 대조군 마우스 조직에 대한 14색 FACS의 결과를 보여줍니다. 이 경우, 비장은 염색된 모든 마커를 식별하고 염색이 기술적으로 기능적임을 보여주기 위해 사용되었습니다. 이 시점부터 미지의 조건에서 테스트하고, 형광단 선택에 확신을 갖고, 다양한 조직 소스에 대한 프로토콜을 최적화하는 것이 더 쉬워졌습니다. 도 3 ...

절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 통한 세포 특성 분석은 임플란트에 대한 면역 반응 패턴을 이해하는 데 크게 기여할 수 있습니다. 이 논문은 절개된 임플란트에서 세포를 분리하고 유세포 분석을 위한 염색을 위한 정확한 방법을 설명합니다.

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

이 프로토콜은 다양한 생체 재료에 대한 숙주 면역 반응을 특성화하는 데 도움이 될 수 있으며, 이는 나중에 더 나은 미래의 의료용 임플란트를 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다. 유세포 분석은 생체 물질에 침투하는 면역 세포에 대한 정보를 제공하여 세포가 손상 및 물질 이식에 반응하는 메커니즘과 개선된 치료법의 표적을 결정하는 데 도움이 됩니다. 동일한 프로토콜을 수정하여 다양한 환경에서 면역 반응을 특성화할 수 있습니다.일주일 전에 ECM 임플란트를 받은 쥐의 대퇴사두근을 해부하고 5밀리리터의 무혈청 배지가 들어 있는 50밀리리터 튜브에 모았습니다. 마지막으로 가위를 사용하여 조직을 깍둑썰기했습니다. 다음으로, 5m리터의 소화 효소 배지를 튜브에 넣는다.소화 배지와 깍둑썰기한 조직이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도, 100RPM에서 45분 동안 흔들리는 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 소화된 조직 현탁액을 70미크론 스트레이너를 통해 개별 50밀리리터 튜브로 여과합니다. 5밀리리터 주사기 헤드를 사용하여 단단한 조직 덩어리를 으깨고 실온 PBS로 여과기를 세척합니다.스트레이너에 남아 있는 잔여물을 버리고 실온 PBS에서 튜브의 부피를 50밀리리터로 조정합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 PBS에서 10밀리리터의 차가운 5밀리몰 EDTA 용액에 펠릿을 재현탁시킵니다. 샘플에 혈액 세포가 있는 경우 펠릿을 1밀리리터의 RBC 용해 완충액에 재현탁시키고 10분 동안 배양한 다음 9밀리리터의 EDTA를 추가합니다.서스펜션을 얼음 위에 10분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 콜드 PBS로 볼륨을 50밀리리터로 조정합니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿과 100마이크로리터의 콜드 PBS를 재현탁시킵니다.현탁액 10마이크로리터를 개별 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 10마이크로리터의 트립 및 카운팅을 위해 파란색과 혼합합니다. 남은 양의 세포를 V 바닥 96웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 웰에서 20마이크로리터의 세포를 제거하고 새 웰에 추가하여 염색되지 않은 대조군으로 사용합니다.그런 다음 PBS를 사용하여 각 웰의 최종 부피를 200마이크로리터로 가져옵니다. 원심분리에 의해 플레이트 웰의 바닥에 있는 세포를 수집하고 웰당 1 내지 1000 농도의 생존도 염료의 100 마이크로리터에 세포를 재현탁시킵니다. 배양이 끝나면 100 마이크로 리터의 신선한 PBS로 각 웰을 세척하고 웰 당 200 마이크로 리터의 염색 완충액에 펠릿을 재현탁시킵니다.두번째 원심분리 후에, 단핵구 차단제의 1 내지 100 희석액의 50 마이크로리터에 있는 세포를 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 얼음 위에서 5분 동안 배양한 다음 50마이크로리터의 항체 칵테일을 추가합니다. 빛으로부터 보호된 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.그런 다음 웰당 100마이크로리터의 염색 완충액으로 웰을 세척합니다. 세포를 다시 원심분리하고 200마이크로리터의 염색 완충액으로 세척합니다. 이 과정을 두 번 더 반복한 후 400마이크로리터의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.샘플을 분석하기 전에 염색되지 않은 샘플을 실행하여 측면 산란도와 전방 산점도에서 세포 집단을 조정할 수 있습니다. 그런 다음 염색된 샘플을 실행합니다. 자가형광 서명을 추출합니다.그런 다음 FCS 파일을 가져와서 혼합 해제를 위한 컨트롤로 사용합니다. 혼합 해제 아이콘을 클릭하여 혼합 해제 마법사를 열고 양성 및 음성 모집단을 게이팅하여 모든 단일 색상 컨트롤을 사용하여 혼합 해제를 수행합니다. 그런 다음 QC 섹션을 클릭하고 복잡성 지수를 확인합니다.복잡성 지수는 스펙트럼 서명이 함께 혼합되지 않을 때 스펙트럼 서명 모음이 얼마나 구별 가능한지를 측정한 것입니다. 마지막으로 live unmix(라이브 혼합 해제)를 클릭하여 샘플을 unmixing합니다. 여기에서, 대조군 마우스 조직에 대한 14가지 색상 사실의 결과를 관찰할 수 있습니다.이 분석에서는 ly6g 양성 호중구 및 ly6c 중간 및 높은 발현 단핵구 클래스와 같은 여러 로비스트 집단을 관찰할 수 있었습니다. CD11c 높은 MHC 두 개의 양성 수지상 세포는 대식세포와 호중구 및 단핵구와 같은 다른 골수성 계통 세포를 배제하기 위해 CD11b에 대해 게이트링되었을 때 쉽게 분명했습니다. CD206 양성 CD86 양성 수지상 세포의 하위 집합은 수지상 세포와 같은 CD86 높은 M1과 수지상 세포 집단과 같은 CD206 높은 M2를 모두 포함하는 이 CD11c 양성 집단에 초점을 맞춰 식별할 수 있습니다.F4/80은 다양한 대식세포 집단에서 흔히 관찰되는 발현 구배를 보여주었습니다. Siglec-F는 F4-80 양성 및 음성 집단 모두에 존재했으며, 각각 대식세포 하위 집합과 호산구에 해당할 가능성이 가장 높습니다. 세포 표면 마커로 염색하면 세포 유형을 이러한 지정이 가능하지만, 다른 마커를 발현하는 세포는 보다 이분법적인 분류가 아닌 기능적인 방식으로 관찰해야 한다는 점에 유의해야 합니다.이 프로토콜을 시도할 때, 패널을 설계하기 전에 언더스테인딩된 샘플의 자가형광 특성을 이해하는 것이 더 나은 혼합을 달성하는 데 중요하다는 점을 명심하십시오. 세포 분석 외에도 세포 분석을 통한 다운스트림 평가, in vitro, transcriptomic 분석 또는 세포 형태를 평가하기 위한 현미경 분석을 위해 분리된 세포를 특정 집단으로 분류할 수 있습니다. 생체 재료의 유세포 분석의 복잡성이 증가함에 따라 기초 면역학 연구와 새로운 치료제 엔지니어링 간의 격차를 해소하는 데 도움이 됩니다.

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연구

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생명공학

이 비디오는 면역글로불린 G(IgG)로 코팅된 종양 세포를 사용하여 수지상 세포의 활성화를 평가하는 프로토콜을 보여줍니다. 수지상 세포는 IgG로 코팅된 종양 세포를 내부화하고, 종양 항원을 처리하고, 공동 자극 분자 CD86의 공동 발현과 함께 MHC-II 분자를 통해 표면에 존재합니다. 그런 다음 이러한 수지상 세포는 MHC-II 및 CD86 표적 면역 염색 및 유세포 분석 분석을 거쳐 활성화 상태를 확인합니다.

면역 복합체를 사용한 수지상 세포 활성화에 대한 유세포 분석 기반 분석

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

이 문서에서는 지방 조직 및 cytometry 사용 하 여 이후 분석에서 면역 세포의 고립에 의해 지방 조직의 면역 세포 콘텐츠를 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Cytometry 사용 하 여 인간 지방 조직에서 면역 세포의 특성

대량 유전자 식 측정 클라우드 개별 셀 차이 이종 세포 인구에서. 여기, 우리는 프로토콜 설명 어떻게 단일 셀 유전자 표정 분석 및 인덱스에 대 한 분류로 개화 활성화 셀 정렬 (FACS)이 윤곽을 그리 다 결합 될 수 있다 및 immunophenotypically 특성 분자로 뚜렷한 세포 인구.

분자 특성 조합 단일 셀 접근 및 인간의 줄기 및 조상 인구 Immunophenotypic이

여기, 선물이 murine thymus, 림프절, 비장 추가 연구를 cytometry를 사용 하 여 이러한 셀을 배출 췌 장에서 단일 셀을 준비 하는 프로토콜. 또한,이 프로토콜 cytometry 사용 규제 T 세포의 하위 집합을 결정 하는 데 사용 되었다.

Murine Thymus, 림프절, 비장 Cytometry 사용 하 여 배출 췌 장 하위 집합 규제 T 세포의 결정

여기, 선물이 CD4를 식별 하는 흐름 cytometric 프로토콜+ 와 CD8+ T 세포, γ T 세포, B 세포, NK 세포와 7 대신만 두 형광을 사용 하 여 인간의 말 초 혈액에 monocytes. 이 방법을 5 추가 마커 대부분 교류 cytometers에 기록할 수 있습니다.

2 형광 색소에 의해 7 개의 면역 세포 하위 집합의 차별 Cytometry 흐름

여기에서는, 우리는 포르말린 고정된 파라핀 내장된 종양 조직 단면도에 있는 면역 세포를 구상하고, 정량화하고, 매핑하기 위한 간단하고 접근가능한 전략을 기술합니다. 이 방법론은 기존의 이미징 및 디지털 분석 기법과 이미징 분석의 다중 분석 기능 및 다중 매개 변수 분석을 확장하는 목적으로 결합합니다.

종양 미세 환경에서 면역 세포 집단의 시각화, 정량화 및 매핑

여기에는 면역형광 현미경으로 5개 이상의 형광 파라미터를 이미지화하는 데 사용할 수 있는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 이미지에서 단일 세포를 추출하고 유세포 분석과 같은 게이팅 전략을 통해 단일 세포 분석을 수행하기 위한 분석 파이프라인이 간략하게 설명되어 있으며, 이를 통해 조직 절편의 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

Histoflow Cytometry를 이용한 High-parameter Histology 이미지 생성 및 분석

이 프로토콜은 간세포 암종(HCC)에서 전신 및 국소 면역 반응을 모두 평가하기 위한 포괄적인 질량 세포 분석(CyTOF(Cytometry by time-of-flight]) 분석 방법을 설명합니다. 이 접근법은 간세포암의 면역 환경에 대한 통찰력을 제공하여 종양 미세환경 및 관련 면역 메커니즘에 대한 더 깊은 이해를 제공하는 것을 목표로 합니다.

간세포암(Hepatocellular Carcinoma)의 전신 및 국소 면역 반응에 대한 질량 세포 분석

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

배우세요 절개된 임플란트 조직에서 세포를 분리하고 유세포 분석으로 면역 반응을 특성화하는 방법을. 마우스 사분근육과 소화 효소를 사용하며, 이 기술은 향상된 의료 임플란트 설계에 기여합니다.

절개된 임플란트 조직의 면역 기능 분석을 위한 고차원 유세포 분석

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