Name: 니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 29 s
Description: 배우세요 Nicotiana benthamiana에서 GFP 융합 IgG 단백질을 발현하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 식물 생산 항체의 시각화와 대학 실습실 교육에 활용됩니다.

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우리는 비디오를 편집 마리아 피아 디팔마 감사합니다. 우리는 또한 그들의 관대 한 출판 수수료 지원에 대한 애리조나 주립 대학의 교육 봉사 및 학생 서비스 사무실에 감사드립니다. 이 프로토콜에 대한 연구는 생명 과학 의 학교에 의해 지원되었다, 애리조나 주립 대학.

1. N. 벤타미안 식물 을 재배
<ol><li>토양 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은, 여전히 뜨거운 (~ 40-45 °C), 전체 확장을위한 토탄 펠릿 위에 물을 부어. 펠릿이 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2-3 N. 벤타미안 씨앗을 놓습니다.</li>
	<li>트레이의 바닥을 덮기 위해 물 에서 약 0.5를 붓습니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정합니다. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다. 비료(수용성 다목적 식물 식품) 농도는 일반적으로 2.5-2.8g/L이다.</li>
	<li>성장 챔버에 놓을 때 휴미돔 상의로 트레이를 덮습니다. 16h 포토기간과 60% 상대 습도를 가진 23-25°C의 성장 챔버에 시드 토탄 펠릿을 보관하십시오.</li>
	<li>1 주일 후, 한 모종으로 각 펠릿을 떠나 여분의 식물을 제거합니다.</li>
	<li>식물이 2-3 주 오래되면 각 토탄 펠릿을 수분 제어 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮기십시오. 이 데모는 기적-그로 수분 제어 포팅 토양을 사용했습니다.</li>
	<li>매일 1 g/L 비료로 물을 섭취하십시오. 토양을 완전히 건조하게 두지 마십시오. 식물은 5-6 주 된 때 침투 할 준비가되어 있습니다.</li>
</ol>2. 침투를 위한 아그로박테리움 tumefaciens의 준비
참고: GFP-IgG 융합 구문은 본제31에기재된 바와 같이 얻을 수 있다. asGFP 유전자는 이 연구 결과로부터 수득및 식물에최적화되었다(45). 다음 단계는 Bunsen 버너 옆에 수행해야하며 오염을 방지하기 위해 기본 무균 기술을 적용해야합니다.
<ol><li>줄무늬 A. tumefaciens EHA105 항두 노란 왜성 바이러스 (BeYDV)19 각 구조에 대한 식물 발현 벡터 (asGFP-IgG, GFP-IgG, 라이트 체인) LB 한천에 글리세롤 주식에서 (10 g/L 트립톤, 10 g/L NaCl, 5 g 효모 추출물, 15 g/L/L/l/ lgar) 5g/ lgar.</li>
	<li>30°C 서 인큐베이터에서 하루 동안 성장하십시오. 표준 콜로니 스크린 PCR 프로토콜에 의해 검증을 위해 단일 콜로니를 분리합니다.</li>
	<li>각 구문에 대해 검증된 콜로니를 사용합니다. 10mL의 LB 미디어(10g/L 트립톤, 10g/L NaCl, 효모 추출물 5g, 50 μg/mL)로 원뿔튜브를 채웁니다. 다음으로 100 μg/mL 카나마이신의 10 μL을 추가합니다. 대장균 오염을 방지하기 위해 2.5 μg/mL 리팜피신의 10 μL을 추가합니다. 하룻밤 사이에 30°C및 120-150 rpm에서 배양하십시오.</li>
	<li>다음 날, 아그로박테리움 배양이 OD600 = 0.6-0.9로 성장하면 침투에 사용될 수 있다. 자란 경우(OD600 > 1), 1-2mL은 항생제로 신선한 LB로 이전되어야 하며 필요한 OD600으로성장해야 한다. 초기 배시의 농도에 따라 OD600 = 0.6-0.9로 성장하는 데 2 일이 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>적절한 OD600에한 번, 원심분리기에 배양을 배치하고, 20분 동안 4,500 x g, 실온(RT)으로 원심분리로 박테리아를 펠렛한다.</li>
	<li>두 샘플모두에서 극치상, 1x 침투 완충제(10mMM 2-(N-morpholino) 에탄설포닉산, 10mM 마그네슘 황산, KOH로 pH 5.5로 조정된 각 펠릿을 최종 OD600 = 0.4로 재연한다. 이것은 초기 배양 밀도에 따라 침투 버퍼의 대략 15-45 mL를 취해야 합니다. 각 IgG 퓨전 구조와 라이트 체인 구조의 동일한 볼륨을 결합하여 각 튜브의 구조당 최종 OD600 = 0.2를 얻습니다.</li>
</ol>3. 바늘없는 주사기 농나무 침전
<ol><li>1단계에서 는 곧게 펴진 종이 클립과 5-6주 된 N. 벤타미안 식물을 가져 가라. 종이 클립의 날카로운 가장자리를 사용하여 adaxial 표면에 있는 잎의 첫 번째 표피 층에 작은 구멍을 만듭니다. 끝까지 구멍을 뚫지 마십시오. 참고: 하부 잎은 침투가 더 쉬운 반면 식물 의 상단의 잎은 더 어렵습니다. 일반적으로, 재조합 단백질의 발현은 식물의 중간에 있는 잎에서 가장 높으며, 이러한 잎은 또한 덜 괴사합니다.</li>
	<li>2단계에서 준비된 아그로박테리움 용액을 바늘없이 1mL 주사기를 채우세요. 주사기의 끝으로 이전 단계에서 만든 구멍을 덮고 천천히 잎 뒤에서 부드러운 반압을 적용하면서 잎에 박테리아를 주입밀어. 주사기에 너무 많은 압력을 가하지 않고 용액이 주입됨에 따라 잎이 어두워지는 것을 지켜보십시오.</li>
	<li>잎 부위의 대부분을 최대 3-4배까지 침투하여 과도한 잎 손상으로 인해 단백질 수율을 저해할 수 있습니다. 침투된 식물 잎은 아래쪽 보기에서 대부분 어둡게 나타납니다. 참고: 이 세균용 용액은 구조당 적어도 3-4 식물에 충분해야 합니다. 폐기하기 전에 남은 세균용 용액을 자동 복제합니다.</li>
</ol>4. 침투한 N. 벤타미안나 에서 성장하고 관찰
<ol><li>침수된 식물을 다시 성장 챔버에 놓고 매일 물을 계속합니다.</li>
	<li>침투 된 지역에서 클로로시스와 괴사잎을 관찰하십시오. 길고 단파 UV 램프 아래에서 GFP 형광(GFP가 존재하는 경우)에 대한 식물을 관찰한다.</li>
	<li>일 4-5 잎에서 두 GFP 구조의 가장 높은 형광을 보여줍니다. 모든 잎을 4-5 dpi(침전 후 일)로 수확하고 총 잎 재료의 무게를 측정합니다.</li>
	<li>다운스트림 처리또는 -80°C에서 사용할 준비가 될 때까지 즉시 사용하십시오.</li>
</ol>5. 단백질 추출
<ol><li>사용 전에 버퍼와 블렌더 컵을 얼음이나 4°C로 유지하십시오.</li>
	<li>식물 재료 1 g 당 2-3 mL의 얼음 냉기 추출 버퍼 (100 m Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA, pH 8 HCl)를 준비하십시오. 추출 직전에 추출 버퍼에 재고(100mMMM)와 50mM 나트륨 아스코르베이트에서 2m mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 추가합니다.</li>
	<li>4단계에서 식물 조직을 미리 냉각된 블렌더 컵에 넣습니다. 블렌더 컵에 측정된 양의 냉장 추출 버퍼를 추가합니다(5.2단계에서 나타낸 대로). 블렌더 컵을 블렌더에 놓습니다. 파라필름의 사전 컷 시트를 가지고 블렌더 컵의 상단에 스트레칭. 20초 간격으로 균일성에 블렌딩하여 필요에 따라 블렌드 사이클 간에 잘 저어줍니다.</li>
	<li>혼합 된 재료를 비커로 옮기. 교반 바를 넣고 단백질 용해도를 높이고 고체의 강수량을 허용하기 위해 30 분 동안 4 °C에서 저어줍니다.</li>
	<li>얼음 위에 깨끗한 비커 위에 미라클로스 2층을 놓고 추출물을 부어 큰 잎 파편을 제거합니다. 모든 추출물을 붓은 후 미라클로스를 접어 잔류 잎 추출물을 짜냅니다. 추출은 눈에 보이는 미립자 없이 어두운 녹색 으로 표시 되어야 합니다.</li>
	<li>이 샘플의 50 μL을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고 나중에 분석을 위해 "총 추출물"을 라벨로 지정합니다. 추출물을 원심분리기 튜브로 옮기습니다. 원심 분리기 는 20 분, 4 °C에 대한 16,000 x g에서 식물 추출물의 나머지를 원심 분리하고 원적 튜브로 상류체를 전송합니다.</li>
	<li>50mL 주사기 및 주사기 유리 섬유 필터(0.75 μm)를 사용하여 수용성 추출물을 필터링합니다.</li>
	<li>원심분리 후 시료의 50μL을 수집하고, 나중에 분석을 위해 "용해 추출물"이라고 라벨을 붙입니다.</li>
</ol>6. 단백질 G 컬럼 크로마토그래피 시술
참고: 여기서 설명된 프로토콜은 피어스 단백질 G 아가로즈 수지의 중력 흐름 크로마토그래피를 위한 것입니다. 다른 수지를 사용하는 경우 제조업체의 조정 지침을 참조하십시오. 수지가 건조하게 달리지 말고 모든 액체가 배수되는 것을 방지하십시오. 필요에 따라 콘센트를 다시 캡합니다.
<ol><li>20mL의 시료를 포함하는 폴리프로필렌 컬럼을 설정합니다.</li>
	<li>대상 면역글로불린 유형및 수지에 대한 선호도에 따라 필요한 슬러리의 양을 추정한다. 일반적으로, 총 슬러리 3mL1.5 mL 침대 부피를 가진 Ab의 여러 밀리그램의 정화에 충분하다.</li>
	<li>필요한 양의 재일시 슬러리를 덮은 기둥에 조심스럽게 붓습니다. 열 아래쪽에서 열 콘센트를 열고 대부분의 버퍼가 사라질 때까지 드레인할 수 있습니다.</li>
	<li>즉시 10mL의 워시 버퍼 1x PBS(137m NaCl, 2.7m KCl, 10mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4,pH 7.4)를 위에 붓습니다. 이 세척 단계를 2x로 배출하고 반복하십시오.</li>
	<li>5단계에서 컬럼에 여과된 샘플을 적용하고 흐름통과(이후 분석을 위해 50μl의 흐름)를 수집합니다. Ab가 수지에 바인딩되지 않은 경우 흐름의 나머지 부분을 저장합니다. 참고: 새 열에 흐름을 다시 적용해도 일반적으로 좋은 수율을 초래하지는 않습니다. 따라서 새로운 잎 재료로 시작하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>수지 10mL1x PBS로 두 번 세척하여 비특이적 결합을 줄입니다. 원하는 경우, 버퍼가 컬럼을 통해 배수됨에 따라 알리쿼트 50 μL의 세척을 알리쿼트하여 대상 Ab가 세척 버퍼로 용출되지 않았는지 확인합니다.</li>
	<li>pH 8에서 멸균 1M Tris-HCl의 125 μL로 5개의 튜브를 설정하고 라벨을 부착합니다. 이는 잠재적인 구조적 변화를 피하기 위해 산성 용출 버퍼에서 Abs를 중화시키는 것입니다. 또는 2M Tris 베이스의 30 μL을 추가하여 희석된 시료를 적게 얻습니다. 주의: 용출 시 UV 광이 시각화에 사용될 수 있습니다. 용출 기간 동안 이 작업을 수행할 필요가 없습니다. 자외선을 사용하는 경우 눈과 피부의 손상을 피하기 위해 적절한 PPE를 착용하십시오. 용출 단계에서 는 UV 광을 사용할 필요가 없습니다.</li>
	<li>열에 5mL의 용출 버퍼(100m 글리신, HCl로 pH 2.5)를 적용하여 복근을 엘테우트와 이전 단계로부터 지정된 각 튜브에 1mL 분획을 수집한다.</li>
	<li>20mL의 워시 버퍼를 적용하고 10mL의 워시 버퍼를 적용하여 컬럼을 즉시 재생합니다. 수지는 장시간 산성 환경에 남아 있지 않은지 확인합니다. 용출은 형광으로 나타나야하며, 종종 가장 높은 형광은 두 번째 용출에서 보이지만 추출에서 추출에 이르기까지 다를 수 있습니다.</li>
	<li>수지용으로 는 PBS에서 20% 에탄올의 10mL로 수지세척하여 중간배수하게 합니다. 상단을 다시 한 다음 열의 아래쪽을 다시 한 번 4°C에서 똑바로 세워보세요. 참고: 일반적으로 단백질 G 수지는 효율성의 상당한 손실 없이 최대 10회 재사용할 수 있습니다. 특정 세부 사항에 대 한 제조업체의 지침을 참조 하십시오.</li>
	<li>용출 버퍼를 공백으로 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 분광계를 사용하여 Ab 농도를 결정합니다. 추가 분석을 위해 각 분획의 -80°C 및 알리쿼트 50 μL에 용출을 저장합니다.</li>
</ol>7. GFP-Ig 융합 검출을 위한 SDS-PAGE
<ol><li>SDS-PAGE를 설정하기 전에 모든 샘플을 준비합니다.<ol>
<li>샘플 버퍼 4 μL 추가 (6 x 감소 샘플 버퍼: 글리세롤 3.0 mL, DTT의 0.93 g, SDS 1 g, 4 x Tris의 7 mL (pH 6.8) 0.5 M, 브로모페놀 블루의 1.2 mg); (6x 비감소 시료 버퍼: 글리세롤 3.0mL, SDS 1g, 4x Tris(pH 6.8) 0.5M, 브로모페놀 블루 1.2 mg) ~ 20 μL(총 추출물, 용해 추출물, 유동, 세척, 모든 용출 분수) 분석. 튜브 캡을 안전하게 고정해야 합니다.</li>
		<li>끓는 수조에서 5분 동안 만 샘플을 줄이는 데 만 치료한 다음 얼음에 5분 동안 샘플을 넣습니다. 마이크로센심분리기에서 샘플을 ~5s로 스핀하고 각 샘플의 20 μL을 젤 우물에 수집하는 순서로 로드합니다. 이중 색 단백질 사다리의 3 μL을 별도의 우물에 적재합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>원하는 단백질 밴드 분리에 일정한 100 V에서 SDS-PAGE 젤을 실행; 약 1.5시간이 걸립니다. 단백질 분리의 지표로 사다리를 모니터링합니다.</li>
	<li>GFP 형광을 관찰하기 위해 UV 아래의 젤을 시각화합니다.</li>
	<li>원하는 경우, 각 샘플에서 총 단백질을 평가하기 위해 Coomassie 얼룩으로 젤을 얼룩지게합니다. 대안적으로, 특정 Abs를 사용하여 표적 단백질을 평가하기 위하여 서쪽 얼룩을 능력을 발휘합니다. 참고: 쿠마시 염색 및 서부 얼룩 모두 표준 프로토콜47,48에따라 수행될 수 있다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이러한 프로토콜은 N. 벤타미안 식물에서 생산되는 임의의 재조합 Ab 또는 재조합 단백질의 시각적 검증을 위해 활용될 수 있으며, 여기에는 열 정화목적42,43,44에대한 산성 환경에 일시적으로 노출이 필요한 단백질이 포함된다. 더욱이, 다른 발현 시스템에서 다른 단백질에 asGFP의 융합은 실험적인 시각화 및 교육을 위한 유용한 도구가 될 수 있다. 본 원에서 프로토콜은 재조합 단백질의 원하는 양을 생성하기 위해 더 크고 적은 양의 잎 물질로 확장될 수 있다. 설명된 방법은 산성 조건 하에서 안정적으로 유지되는 GFP의 버전을 확인하고 만든 이전 연구를활용(46). 포괄적인 사전 연구는 관심있는 단백질에 융합된 면역글로불린 도메인을 만들었습니다, 수시로 이 프로토콜은또한 ...

업계 보고서에 따르면 미국에서 가장 많이 매출을 기록한 20개 중 13개 약물은 생물학적 제제(단백질 기반 의약품)였으며, 그 중 9개가 항체였습니다. 2019년 현재, 다양한 임상 개발상에서570개 이상의 항체(Ab) 치료제가1,2,3하였다. 현재 글로벌 Ab 매출은 1,000억 달러를 초과하며, 단일클론 Ab(mAb) 치료제 시장은 2025년1,4년까지최대 3,000억 달러를 창출할 것으로 예상됩니다. 이러한 높은 수요와 예상 된 수익 증가로, 연구원은 더 높은 품질과 낮은 비용으로, 그 어느 때보 다 큰 규모로 Ab 치료제를 생산하는 방법을 개발하기 위해 노력하고있다. 식물계 발현 시스템은 Ab 치료제5,6의저렴하고 대규모 제조를 위해 전통적인 포유류 세포주보다 몇 가지 장점이 있다. 식물에서 단백질 치료제의 생산("분자 파밍")은 전통적인 포유류 세포 배양기술7,8과같이 고가의 생물반응기 또는 세포 배양 시설을 필요로 하지 않는다. 식물은 인간의 병원균을 계약할 수 없으므로 잠재적 오염 을 최소화할 수 없습니다 9. 과도 및 형질 전환 식물 기반 단백질 발현 은 포유류 또는 세균 성 생산 시스템(10)에대한 저비용 대안으로 활용 될 수있다. 형질 전환 식물은 작물 생산을 위해 선호되지만,이 방법을 사용하여 재조합 단백질 생산은 몇 주에서 몇 달이 필요할 수 있습니다. 주사기 또는 진공 농약침을 통해 바이러스 벡터를 이용한 과도발현의 어드밴스는11일,12,13,14일에원하는 단백질의 각각 소규모 및 대규모 생산을허용한다. 에볼라, 뎅기열 및 지카 및 수많은 다른 재조합 단백질에 대한 mAbs의 생산은 N. 벤타미안 식물15,16,17,18,19에서일시적인 발현을 사용하여 신속하고 효율적으로 생산및 정제되었다. 이러한 상황은 과도 식물 기반 발현을 다중 Ab 치료제 및 이프로토콜(20)에서입증된 방법을 개발하기 위한 매력적인 옵션으로 만든다.
1세대 mAbs는 뮤린 유도체였으며, 인체실험(21)에서사용될 때 비특이적 면역원성으로 귀결되었다. 시간이 지남에 따라, 키메라, 인간화, 그리고 결국, 완전히 인간 복근은 Ab 치료에 의해 유도된 면역원성을 감소시키기 위하여 생성되었다. 불행히도, 이러한 복근 중 일부는 여전히글리코실화(21)의차이로 인해 숙주 면역원성을 유발한다. 식물 공학의 개발은 Ab glycans의 수정을 허용했으며, 이는 Ab의 안정성과 기능이 글리코실화상태(22)의영향을 크게 받을 수 있기 때문에 필수적입니다. 어드밴스는 인간 글리칸을 함유하고 그 결과 대량 생산된 인간 약제19,21의원하는 생물학적 특성을 포함하는 인간화된 mAbs의 높은 수준의 발현의 식물 시스템에서 생산을 허용하고 있다.
재조합 복근 이외에, Ab 융합 분자 (Ab 퓨전) 최근 수십 년 동안 다양한 목적을 위해 탐구되었습니다. Ab 퓨전은 종종 분자 또는 단백질에 융합된 Ab 또는 Ab 단편으로 구성되며 면역 이펙터세포(23)로부터반응을 유도하도록 설계되었습니다. 이들 분자는암 및 자가면역질환(24,25,26,27)과같은 다양한 병리를 치료하는 잠재적 치료 내정간섭으로 만들어졌다. 재조합 면역 복합체(RIC)는 백신지원자(28)로채용된 또 다른 종류의 Ab 퓨전이다. RI는 Ab fusions의 Fc 영역을 인식하는 면역 계통의 능력을 이용하고 다른 백신플랫폼(29,30,31)과결합될 때 면역원성을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
녹색 형광 단백질 (GFP)은 자외선32,33에의해 흥분 될 때 녹색 빛을 방출 해파리 Aequorea 빅토리아에서 파생 된 생물 발광 단백질이다. 수년에 걸쳐, 유전자 발현의 시각적 마커로서의 GFP의 사용은 에샤리치아 대장균의 발현에서 N. 벤타미안 식물34,35,36,37,38을포함한 수많은 단백질 발현 시스템으로 확장되었다. GFP와 같은 눈에 보이는 마커는 과학적 개념의 가르침과 학습에 풍부한 영향을 미칩니다. 수많은 엔트리 레벨 학생들은 가르쳐지는 아이디어가 분자 생물학 및 관련 분야39의개념과 같은 육안으로 보이지 않을 때 과학적 개념을 파악하는 데 어려움을 설명합니다. GFP와 같은 시각적 마커는 과학적 과정과 관련된 정보 처리에 기여할 수 있으며 학생들이 수많은 과학적 개념을 배우는 데 보고하는 어려움을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
GFP는 생체 내에서유전자와 발현을 나타내는 마커로 자주 사용되지만 산성 조건을 사용하는 경우 다운스트림 공정에서 시각화하기가 어렵습니다. 이러한 상황은 주로 GFP가 낮은 pH40에서구조및 그 결과 형광을 유지하지 않기 때문이다. 일시적인 산성 환경은 단백질 G, 단백질 A 및 단백질 L 크로마토그래피와 같은 다양한 정제 공정에서 종종 요구되며, 종종 Ab 정제41,42,43,44에활용된다. GFP 돌연변이체는 산성 조건 하에서 형광을 유지하기 위해 사용되어 왔다45,46.
본 원에서 우리는 N. 벤타미안 식물에서 재조합 IgG 융합 단백질의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 인간화된 IgG 헤비 체인의 N 종단에 융합된 전통적인 GFP를 생산하여 GFP-IgG 융합을 만들었습니다. 동시에, 우리는 인간화 된 IgG 무거운 체인의 N 종기에 산 안정 GFP (asGFP)에 대한 식물 코돈 최적화 서열의 융합을 개발하여 asGFP-IgG 융합을 만들었습니다. GFP-IgG를 생산하는 장점은 발현 중에 표적 단백질의 존재를 시각화하는 기능을 포함하고, asGFP-IgG는 발현 및 추출 단계뿐만 아니라 단백질의 정제 단계에서 재조합 단백질의 존재를 볼 수 있게 한다. 이 프로토콜은 N. benthamiana에서 생산된 다양한 GFP 융합 단백질의 생산, 정제 및 시각화에 적응하고 낮은 pH를 요구하는 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다. 이 과정은 또한 잎 재료의 다양한 양에 맞게 조정할 수 있습니다. GFP 또는 asGFP로 태그된 Abs 및 융합 단백질은 치료에 사용되지 않지만, 이러한 방법은 실험 중 대조군으로 유용할 수 있으며, 직접 및 사실상 분자 및 세포 생물학 및 생명 공학을 위한 교육 도구로 더 활용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>5mL 주사기</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>50mL 주사기</td><td>N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>블렌더(컵 포함</td><td></td>) <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Bio-Rad</td><td>1610404</td><td></td></tr><tr><td>DTT(DL-Dithiothreitol)</td><td>MP BIOMEDICALS</td><td>219482101</td><td></td></tr><tr><td>EDTA( 에틸렌 디니트릴로) 테트라 아세트산</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E-6760</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>N</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>G-Biosciences</td><td>BTNM-0037</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G7126-500G</td><td></td></tr><tr><td>HCl (염산)</td> <td>EMD MILLIPORE CORPORATION</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록 평판이</td><td>좋은 공급 업체</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Jiffy-7 727 w/hole 이탄 펠릿</td><td>Hummert International</td><td>14237000</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>K-120-100</td><td></td></tr><tr><td>KCl (염화칼륨)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (인산칼륨)</td><td>J.t.baker</td><td>3248-05</td><td></td></tr><tr><td>KOH (수산화칼륨)</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>황산 마그네슘 헵타 하이드레이트</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M2773</td><td></td></tr><tr><td>MES (2- (N- 모르 폴리노) 에탄 술폰산)</td> <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Millipore</td><td>4 75855-1R</td><td></td></tr><tr><td>수분 조절 포팅 믹스</td><td>Miracle-Gro</td><td>755783</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 (인산 나트륨)</td> <td>J.t.baker</td><td>3827-01</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (염화나트륨</td><td>) Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203274C</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>평판이 좋은 공급</td><td>업체 N / A</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride)</td> <td>G-Biosciences</td><td>786-787</td><td></td></tr><tr><td>폴리 프로필렌 컬럼</td><td>: 모든</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>정밀 플러스 단백질 이중 색상 표준</td><td>Bio-Rad</td><td>1610394</td><td></td></tr><tr><td>단백질 G 수지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20399</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Gold Biotechnology Inc</td><td>R-120-25</td><td></td></tr><tr><td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td><td>G-Biosciences</td><td>DG093</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A7631-500G</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>평판이 좋은 공급 업체</td><td>없음</td><td></td></tr><tr><td>Titan3 0.75 &마이크로; m 유리 섬유 필터</td><td>ThermoScientific</td><td>40725-GM</td><td></td></tr><tr><td>트레이 돔이있는 이탄 펠릿</td><td>모든</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 베이스</td><td>J.t.baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Amresco</td><td>M108-1KG</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>17221</td><td></td></tr><tr><td>UV 램프</td><td>모든</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>수용성 다목적 식물성 식품</td><td>Miracle-Gro</td><td>2000992</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>9182</td><td></td></tr></tbody></table>

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 igg 융합 단백질의 생산

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

다양한 전염성, 대사, 자가면역, 신플라스틱 및 기타 질병에 대한 치료 개입으로서 항체에 대한 수요가 높아지면서 재조합 항체 생산을 위한 효율적인 방법을 개발할 필요성이 증가하고 있다. 2019년 현재, FDA승인 단일클론 항체가 70개 이상 있었으며 기하급수적인 성장 잠재력이 있습니다. 그들의 약속에도 불구하고, 광범위한 사용에 대한 제한 요인은 제조 비용과 복잡성입니다. 잠재적으로 식물은 저비용, 안전하며 쉽게 확장 가능한 단백질 제조 전략을 제공합니다. 니코티아나 벤타미안과 같은 식물은 복잡한 포유류 단백질을 올바르게 접고 조립할 수 없을 뿐만 아니라 포유류 세포 배양에서 제공하는 것과 유사한 중요한 번역 후 수정을 추가할 수 있습니다. 본 작품에서는, 인간 단일클론 항체에 융합된 녹색 형광 단백질(GFP)의 원종 GFP 및 산안정변체를 사용하여, 우리는 N. 벤타미안 식물로부터 의 전체 과도 항체 발현 및 정화 과정을 시각화할 수 있었다. 실험의 목적에 따라 네이티브 GFP 융합은 식물의 발현 단계에서 쉽게 시각화할 수 있으며, 산안정성 GFP 융합은 다운스트림 처리 중에 시각화를 가능하게 합니다. 이 확장 가능하고 간단한 절차는 몇 가지 작은 식물을 사용하여 며칠 만에 고도로 순수한 항체 또는 항체 융합 단백질의 밀리그램 양을 생산하는 단일 연구원에 의해 수행 될 수있다. 이러한 기술은 식물 및 기타 발현 시스템에서 모든 유형의 항체 정제 공정 및 잠재적으로 많은 다른 단백질의 시각화로 확장될 수 있다. 또한, 이러한 기술은 가상 지침에 도움이 될 수 있으며 분자 생물학 기술에 대한 최소한의 사전 경험을 가진 학부 생에 의해 교육 실험실에서 실행될 수 있으며, 실제 응용 프로그램과 프로젝트 기반 탐사를위한 토대를 제공합니다.

이 연구는 재조합 단백질을 생성하고 다운스트림 프로세스 전반에 걸쳐 시각화하는 쉽고 빠른 방법을 보여줍니다. N. 벤타미안을 사용하고 제공된 프로토콜을 따르고, 여기에 설명된 재조합 단백질 생산은 1주일 이내에 달성될 수 있다. 식물 발현, 추출 및 정제의 전체 워크플로우가 도 1에표시됩니다. 2주 된 묘목, 4주 된 식물, 6주 된 식물의 식물 성장 단계는 각각 도 1A(1-3)에 표시되며, 도 1B는 괴사(그림 1B-1)또는 클로로시스(그림 1B-2)로인한 잎 형태학적 변화를 묘사한다. 괴사는 침윤 후 3-5 일 사이에 주사 부위에서 발생할 수 있습니다. ...

우리는 니코티아나 벤타미안에서GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법을 여기에서 설명한다. 이 프로토콜은 열 크로마토그래피를 활용하는 수많은 단백질의 정제 및 시각화로 확장될 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 직접 및 가상 대학 교육 실험실에 적용되어 프로젝트 기반 탐사를 제공합니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

이는 담배 관련 니코티아나 벤타미안 식물에서 GFP에 융합된 재조합 인간 IgG의 발현, 추출 및 정제를 위한 간단한 방법의 데모이다. 이 프로토콜은 식물생산 항체, 항체 융합 및 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제될 수 있는 대부분의 단백질의 정화 및 시각화를 위해 활용될 수 있다. 이 프로토콜은 대학 작업 실험실에서 연구원과 학생들이 단백질 생산 과정의 대부분의 단계에서 GFP 태그 단백질을 시각화 할 수 있습니다.흙 토탄 펠릿을 트레이에 놓고 이전에 삶은 뜨거운 물을 토탄 펠릿 위에 부어 완전한 확장을 합니다. 펠릿은 완전히 확장하는 데 몇 분 정도 걸릴 것입니다. 팔레트가 완전히 확장된 후 핀셋을 사용하여 각 토탄 펠릿에 2~3개의 니코티아나 벤타미안 씨앗을 놓습니다.이 작업이 완료되면 트레이의 바닥을 덮기 위해 약 0.5 인치의 물을 부어야합니다. 트레이에 시드 날짜로 레이블을 지정하는 것을 잊지 마십시오. 매일 모종에 적절한 양의 비료로 물을 계속 합니다.트레이는 허미돔 상단으로 덮여 성장 챔버에 배치해야합니다. 시드 토탄 펠릿은 섭씨 23~25도의 성장챔버에 보관해야 하며, 16시간 사진 주기와 60%의 상대 습도를 유지해야 합니다. 일주일 후, 펠릿에서 추가 식물을 제거하여 각 토탄 팔레트를 한 번의 모종으로 남깁니다.식물이 2~3주 생후, 각 토탄 펠릿을 수분 조절 토양을 포함하는 개별 냄비로 옮깁니다. 리터 비료 당 1 그램으로 매일 물 묘목을 계속, 토양을 완전히 건조 떠나지 마십시오. 식물은 5~6주 전에 침투할 준비가 되어 있습니다.다음 단계는 분젠 버너 옆에 수행해야하며 오염을 방지하기 위해 기본 무균 기술을 적용해야합니다. 당신은 Lb 카나마이신 플레이트가 필요합니다. 밀리리터 카나마이신 농도당 1마이크로그램.원하는 카나마이신 내성 구조를 수용하고 하룻밤 사이에 재배되는 두 가지 돌연변이 EHA105가 엄격하게 증가합니다. EHA105는 아그로박테리움 2개의 돌연변이의 가장 일반적으로 이용되는 긴장의 한개입니다. 문화를 시작하려면, lb 매체의 10 밀리리터와 원내 관을 채우기, 다음, 10 밀리리터 당 10 마이크로 리터 10 밀리리터 당 카나마이신, 당신은 또한 전자 대장균 오염을 방지하기 위해 리팜피신의 밀리리터 당 2.5 마이크로 그램의 10 마이크로 리터를 추가 할 수 있습니다.접시에서, 당신은 당신의 새로운 문화를 성장하기 위해 PCR에 의해 검증 된 하나의 고립 된 식민지를

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 공장에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 테스트하는 기술을 개발했습니다. 노란색 형광 단백질 (YFP은) 2 비 중복 조각으로 분할합니다. 각 조각은 융합 단백질의 표현을 활성화, 게이트웨이 시스템을 통해 관심의 유전자에 프레임에 복제됩니다. 심리 단백질이 상호 작용을 때 YFP 신호의 Reconstitution에만 발생합니다.

게이트웨이 가능 Bimolecular의 형광 Complementation (BiFC) 시스템을 사용하여 공장에서 단백질 상호 작용의 검출

식물은 현재의 표현 패러다임을보다 더 확장 가능한 비용 효율적이고 안전 상업적 규모에 제약 단백질의 생산을위한 새로운 시스템을 제공합니다. 본 연구에서는, 우리는 포함하는 대상 유전자를 소개하는 간단하고 편리하면서도 확장 가능한 접근...

재조합 단백질의 높은 수준의 과도 발현 식물의 효율적인 Agroinfiltration

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

최적화 및 활용<em&gt; 아그로 박테 리움</em에서&gt; 매개 과도 단백질 생산<em&gt;는 담배</em

이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

이 연구에서는 서로 다른 생산 플랫폼에서 표적 인간 재조합 단백질의 발현을 비교했습니다. 우리는 전통적인 발효기 기반 배양과 식물에 초점을 맞추고, 각 시스템의 설정을 설명하고, 보고된 결과를 기반으로 각 플랫폼의 고유한 한계와 장점을 강조했습니다.

박테리아, 곤충 세포 및 공장 시스템 : 재조합 단백질 다른 Biofactories에서 표현의 비교 분석

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

이 원고 luciferase 활동의 측정에 기반 하는 단백질 단백질 상호 작용을 결정 하기 위한 간단 하 고 신속한 실험 절차를 설명 합니다.

Luciferase 보완성 이미징 분석 결과 Nicotiana benthamiana 잎 뚜렷이 결정 단백질 단백질 상호 작용 역동성에 대 한

공동 기존 방법의 어려움을 극복 하기 위해 공장에서 여러 공상 형광 성 융해 단백질을 표현 하기 위한 새로운 방법을 개발 했습니다. 그것은 단백질 공동 식 달성 하기 위해 카세트를 표현 하는 여러 기능적으로 독립적인 단백질을 포함 하는 단일 식 플라스 미드를 사용 하 여 활용 합니다.

식물에는 효율적인 방법으로 여러 공상 형광 성 융해 단백질의 공동 식

Nicotiana benthamiana 잎에서 생 합성 효소의 일시적인 분리 식 생 공급 2, 3-oxidosqualene 새로운 고부가가치 보관 제품의 생산으로의 착륙 장이 있습니다. 여기는 triterpenes 그리고이 강력한 식물 기반 플랫폼을 활용 하 여 아날로그의 빠른 (5 일) 대리점 규모 생산을 위한 상세한 프로토콜을 설명.

Nicotiana Benthamiana 에 과도 식 보관 생산 대리점 규모에 대 한 나뭇잎

이것은 Xenopus laevis oocytes에서 클​​램프의 녹음 패치에 대한 소개로서 것입니다. 그것은 vitelline 막 제거, gigaohm 인감 (gigaseal)의 형성, 그리고 외부 아웃 토폴로지에 패치의 선택 변환을 다룹니다.

Xenopus Oocytes의 표현 이온 채널 패치 클램프 녹음

배우세요 Nicotiana benthamiana에서 GFP 융합 IgG 단백질을 발현하고 칼럼 크로마토그래피로 정제하는 방법을. 이 프로토콜은 식물 생산 항체의 시각화와 대학 실습실 교육에 활용됩니다.

니코티아나 벤타미안나에서 과도하게 표현된 IgG 융합 단백질의 생산

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