Name: 세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 유방암 줄기 세포 분리 및 기능 평가 방법을 세포와 조직 샘플에서. 이 기술은 종양 형성과 전이를 연구하고 표적 치료 전략을 개발하는 데 활용됩니다.

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유용한 토론과 지원에 대해 실험실 구성원들에게 감사드립니다. 유방암 줄기 세포와 종양 미세 환경에 대한 우리의 연구는 캐나다 암 연구 학회 연구소와 미 육군 국방부 유방암 프로그램 (보조금 # BC160912)의 보조금으로 지원됩니다. VB는 Western Postdoctoral Fellowship (Western University)의 지원을 받고 있으며 ALA와 VB는 모두 캐나다 유방암 학회의 지원을 받고 있습니다. CL은 캐나다 정부의 Vanier Canada 대학원 장학금으로 지원됩니다.

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유방암 전이와 치료에 대한 내성은 전 세계 여성의 주요 사망 원인이되었습니다. 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 하위 집단의 존재는 전이 26,43,44,45,46 및 치료 내성 21,47,48의 향상에 기여합니다. 따라서 향후 치료의 초점은 더 나은 치료 결과를 달성하기 위해 BCSC를 근절하는 것을 목표로 해야 하며, 이를 위해서는 시험관 내 및 생체 내 방법을 모두 사용하여 BCSC의 기능적 특성을 분리하고 특성화하는 정확한 방법이 필요합니...

인간 유방암 줄기 세포 (BCSC)의 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 유방암 치료에서 직면하는 문제를 해결하는 데 중요합니다. BCSC 개념의 출현은 21세기 초로 거슬러 올라가며, CD44+CD24-/저유방암 세포의 작은 집단이 마우스 1,2에서 이질적인 종양을 생성할 수 있는 것으로 밝혀졌습니다. 그 후, 알데히드 탈수소 효소 (ALDHhigh)의 높은 효소 활성을 갖는 인간 유방암 세포도 유사한 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 관찰되었다3. 이러한 BCSC는자가 재생 및 분화가 가능한 작은 세포 집단을 나타내며 벌크 종양 1,2,3의 이질성에 기여합니다. 축적 된 증거는 진화 적으로 보존 된 신호 전달 경로의 변화가 BCSC 생존 및 유지를 유도한다는 것을 시사합니다 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . 또한, 세포 외인성 미세 환경은 상이한 BCSC 기능을 지시하는데 중추적인 역할을 하는 것으로 나타났다15,16,17. 이러한 분자 경로와 BCSC 기능을 조절하는 외부 요인은 유방암 재발, 전이18 및 치료법에 대한 내성 발달19,20,21에 기여하며, 치료 후 BCSC의 잔류 존재는 유방암 환자의 전체 생존에 큰 도전이 됩니다.22,23 . 따라서 이러한 요인에 대한 전임상 평가는 유방암 환자의 더 나은 치료 결과와 전체 생존 개선을 달성하는 데 도움이 될 수 있는 BCSC 표적 요법을 식별하는 데 매우 중요합니다.
몇몇 시험관내 인간 유방암 세포주 모델 및 생체내 인간 이종이식 모델은 BCSC 24,25,26,27,28,29를 특성화하기 위해 사용되었다. 모든 연속 계대 후에 지속적으로 다시 채워지는 세포주의 능력은 이러한 세포를 오믹스 기반 및 약물유전체학 연구를 수행하는 이상적인 모델 시스템으로 만듭니다. 그러나 세포주는 종종 환자 샘플에서 관찰된 이질성을 요약하지 못합니다. 따라서 환자 유래 샘플로 세포주 데이터를 보완하는 것이 중요합니다. 가장 순수한 형태의 BCSC를 분리하는 것은 BCSC의 상세한 특성 분석을 가능하게 하는 데 중요합니다. 이러한 순도를 달성하는 것은 BCSC에 특정한 표현형 마커의 선택에 달려 있습니다. 현재, ALDH높은CD44+CD24- 세포 표현형은 최대 순도1을 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 벌크 유방암 세포 집단으로부터 인간 BCSC를 구별하고 분리하는 데 가장 일반적으로 사용되며, 3,26. 또한, 자가 갱신, 증식 및 분화와 같은 단리된 BCSC의 특성은 시험관내 및 생체내 기술을 사용하여 평가할 수 있습니다.
예를 들어, 시험관내 콜로니 형성 분석은 상이한 치료 조건(30)의 존재하에50개 이상의 세포의 콜로니를 형성하기 위해 자가갱신하는 단일 세포의 능력을 평가하는데 사용될 수 있다. 유방권 분석은 또한 앵커리지 독립적 조건에서 유방암 세포의 자가 재생 잠재력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석은 무혈청 비부착성 배양 조건31에서 각각의 연속 계대에서 구체(BCSC 및 비-BCSC의 혼합물)로서 생성 및 성장하는 단일 세포의 능력을 측정합니다. 추가적으로, 3차원(3D) 배양 모델을 사용하여 생체 내 미세환경을 밀접하게 요약하고 잠재적인 BCSC-표적 요법의 활성을 조사할 수 있는 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 포함하는 BCSC 기능을 평가할 수 있다(32). 시험관내 모델의 다양한 응용에도 불구하고, 시험관내 분석만을 사용하여 생체내 조건의 복잡성을 모델링하는 것은 어렵다. 이러한 과제는 생체 내에서 BCSC 거동을 평가하기 위해 마우스 이종이식 모델을 사용함으로써 극복할 수 있습니다. 특히, 이러한 모델은 유방암 전이를 평가하고33, 질병 진행 동안 미세환경과의 상호작용을 조사하고(34), 생체내 영상화(35), 및 항종양제(34)의 환자 특이적 독성 및 효능을 예측하기 위한 이상적인 시스템으로서 기능한다.
이 프로토콜은 이질적인 유방암 세포의 벌크 집단으로부터 최대 순도로 인간 ALDH고 CD44+CD24- BCSC의 분리에 대한 자세한 설명을 제공한다. 또한 BCSC의 다양한 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 세 가지 시험관 내 기술(콜로니 형성 분석, 유방권 분석 및 3D 배양 모델)과 생체 내 종양 이종이식 분석에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이러한 방법은 BCSC 생물학을 이해하고 새로운 BCSC 표적 요법을 조사할 목적으로 인간 유방암 세포주 또는 1차 환자 유래 유방암 세포 및 종양 조직으로부터 BCSC를 분리 및 특성화하는 데 관심이 있는 연구자가 사용하기에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>7-Aminoactinomycin D (7AAD)</td><td>BD</td><td>51-68981E</td><td>제안: 0.25 &마이크로; g/1x106 세포</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A18-1</td><td></td></tr><tr><td>알데히드 탈수소효소(ALDH) 기질</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>ALDEFLOUR 분석 키트의 일부로 상업적으로 판매; ALDH 기질 준비에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오</td></tr>. <tr><td>기저막 추출물(BME)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>이라는 상품명으로 판매됩니다.세포 배양 플레이트: 6웰</td><td>Corning</td><td>877218</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트: 60mm</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트: 96웰 초저 부착</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기: 40 미크론</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Collagen</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7001</td><td>PBS에서 3 mg/mL 콜라겐의 1:30 희석 준비</td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소</td><td>시그마</td><td>11088807001</td><td>1x</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 : 50 mL</td><td>Fisher scientific</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>크리스탈 바이올렛</td><td>시그마</td><td>C6158</td><td>염색을 위해 물에 0.05 % 크리스탈 바이올렛 용액 사용</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td>5U/mL</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, L-글루타민 및 15 mM HEPES 포함</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma</td><td>D5052</td><td>0.1 mg/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm Lifescience</td><td>97068-085</td><td>&nbsp; </td></tr><tr><td>Flow 튜브: 5ml</td><td>BD</td><td>352063</td><td>폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher</td><td>84124</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-Human CD24 항체</td><td>BD</td><td>561646</td><td>R-phycoerythrin 및 Cyanine 염료 접합 클론: ML5</td></tr><tr><td>마우스 anti-Human CD44 항체</td><td>BD</td><td>555479</td><td>R-phycoerythrin conjugated, 클론: G44-26</td></tr><tr><td>N, N-디에틸아미노벤즈알데히드 (DEAB)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td>ALDEFLOUR 분석 키트의 일부로 상업적으로 판매; 제조사의 지시를 따르십시오. DEAB 준비</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Inc</td><td>311-425-CL</td><td>1x, 칼슘 및 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mammosphere Media 구성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F2006</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioshop</td><td>ALB003</td><td>04%</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, L-글루타민 및 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>SIGMA</td><td>E9644</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>16634</td><td>5 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3D 오가노이드 배지 조성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-44</td><td>1x</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>1x, L-글루타민 및 15mM HEPES</td></tr><tr><td>EGF</td><td>시그마</td><td>E9644</td><td>5ng/mL</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>Neuregulin &beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>R-spondin3</td><td>R& D</td><td>3500</td><td>250ng/mL</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067</td><td>500nM</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>5 &마이크로; 미디엄</td></tr></tbody></table>

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

유방암 줄기 세포 (BCSC)는 유전 또는 후천성 줄기 세포와 유사한 특성을 가진 암세포입니다. 낮은 빈도에도 불구하고 유방암 시작, 재발, 전이 및 치료 저항의 주요 원인입니다. 유방암 치료를위한 새로운 치료 표적을 식별하기 위해서는 유방암 줄기 세포의 생물학을 이해하는 것이 필수적입니다. 유방암 줄기 세포는 CD44, CD24와 같은 독특한 세포 표면 마커의 발현 및 알데히드 탈수소 효소 (ALDH)의 효소 활성을 기반으로 분리 및 특성화됩니다. 이러한 ALDH높은CD44+CD24- 세포는 BCSC 집단을 구성하며 다운스트림 기능 연구를 위한 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 분리될 수 있습니다. 과학적 질문에 따라 BCSC의 기능적 특성을 평가하기 위해 다양한 시험관 내 및 생체 내 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 유방암 환자의 이질적인 유방암 집단과 원발성 종양 조직 모두에서 인간 BCSC를 분리하기 위한 상세한 실험 프로토콜을 제공합니다. 또한 BCSC 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 콜로니 형성 분석, 유방권 분석, 3D 배양 모델 및 종양 이종이식 분석을 포함한 다운스트림 시험관 내 및 생체 내 기능 분석을 강조합니다.

설명 된 프로토콜은 세포주 또는 해리 된 종양 조직으로부터 유방암 세포의 이질적인 집단으로부터 인간 BCSC의 분리를 허용한다. 주어진 세포주 또는 조직 샘플에 대해, 특히 연구 목적이 BCSC를 표적으로 하는 치료제의 효능을 평가하는 것이라면 오염된 비 BCSC 집단이 다양한 세포 반응을 유발할 수 있으므로 BCSC를 최대 순도로 분리하기 위해 균일한 단일 세포 현탁액을 생성하는 것이 중요합니다. 엄격한 분류 전략을 적용하면 오염된 비 BCSC의 존재를 최소화하고 유방암 세포의 비율을 수집할 수 있습니다. 암세포의 대량 집단과 구별되는 세포 표현형을 나타내는 줄기 세포와 같은 특성을 가지고 있습니다. 향상된 ALDH 효소 활성을 나타내고, 높은 수준의 세포 표면 마커 CD44를 발현하고, CD24의 낮은/음성 발현을 나타내는 인간 유방암 세포는 ALDH높은CD44+CD24-표현형을 가지며 BCSC로 분류될 수 있습니다. 벌크 집단 내에서 BCSC의 비율은 세포주 또는 ...

이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

이 기술을 통해 연구자들은 시험관 내 및 생체 내 기능 특성화 분석의 성능을 위해 유방암 줄기 세포를 최대한의 순도와 생존력으로 분리할 수 있습니다. 분리된 유방암 줄기세포는 종양원성과 전이를 조절하는 분자 사건을 밝히고 이러한 세포를 표적으로 하는 치료 전략을 설계하는 데 도움이 될 수도 있습니다. 관심 있는 세포 및 조직 유형에 특이적인 약간의 변형을 통해 이 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.세포 배양에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면 PBS로 80% confluent 유방암 세포 배양을 세척하고 실온에서 5분 동안 적절한 세포 해리 용액으로 세포를 처리합니다. 세포가 분리되면 5ml의 배양 배지를 추가하여 세포 해리 용액을 중화하고 원심분리를 위해 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 계수를 위해 펠릿을 5ml의 PBS에 재현탁합니다.계수 후, 세포를 다시 원심 분리한 다음 ALDH 기질 완충액 밀리리터당 10-6개의 세포를 한 번에 재현탁합니다. 조직 샘플에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면 십자형 기법으로 수술용 블레이드를 사용하여 종양 조직을 약 1mm 크기의 조각으로 다집니다. 10ml의 해리 완충액이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 조각을 넣습니다.셰이커에서 섭씨 37도에서 40분 동안 배양하기 위해 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 원심분리로 소화된 조직 조각을 침전합니다. 5ml 피펫을 사용하여 펠릿을 5ml의 트립신에 재현탁시키고 37도 수조에서 5분 동안 조직을 배양합니다. 배양이 끝나면 조직을 여러 번 격렬하게 피펫팅하여 단일 세포를 방출하고 튜브의 총 부피를 25ml로 끌어올리기에 충분한 DMEM/F-12 배지를 추가합니다.원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠릿을 1ml의 Displace DNAse에 재현탁시킨 다음, 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS로 총 부피를 10 밀리리터로 가져옵니다. 피펫팅으로 세포를 혼합하고 40 미크론 세포 여과기를 통해 50 ml 튜브에 주입합니다.원심분리 후, 계수를 위해 5ml의 새로운 PBS에 세포를 재현탁합니다. 콜로니 형성 분석을 수행하기 위해, 분류 후, 세포를 완전한 배지에 재현탁시키고 튜브당 2밀리리터의 배지를 포함하는 3개의 튜브 각각에 적절한 수의 유방암 줄기세포를 추가하고, 두 번째 세포에 10 곱, 두 번째 세포에 10 곱 또는 두 번째 세포에 10 곱으로 표시한다. 피펫을 위아래로 5회 사용하여 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 세포를 6웰 플레이트의 개별 웰에 플레이트합니다.플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 균일한 세포 분포를 얻고 콜로니가 나타날 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 배양이 끝나면 웰당 1ml의 PBS로 세포를 세척하고 웰당 500마이크로리터의 0.05% 크리스탈 바이올렛 용액으로 세포를 30초 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 우물당 2ml의 물로 우물을 두 번 세척하여 과도한 염료를 제거하고 4배 또는 10배 배율로 광학 현미경으로 우물당 총 집락 수를 세고 기록합니다.유방권 분석을 수행하기 위해, 분류 후, 세포를 완전한 유방권 배지에 재현탁시키고 96 웰 초저 부착 세포 배양 플레이트에서 웰당 평방 센티미터 면적당 두 번째 세포의 5배 10의 좌석 밀도로 플레이트를 플레이팅합니다. 광학 현미경으로 웰당 유방구의 수를 세기 전에, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 5-10일 동안 넣습니다. 3D 배양 모델을 설정하려면 기포가 없는 96웰 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 기저막 추출물을 조심스럽게 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배치하여 용액이 중합될 수 있도록 합니다.겔 층이 건조되지 않도록 10분 후에 100마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 배양 종료 시, 분류된 세포를 3D 배양 배지 농도 200마이크로리터당 3번째 세포의 5-50배로 현탁하고 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 PBS를 세포를 포함하는 200마이크로리터의 배지로 교체합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 10-14일 동안 넣은 후 배양물의 오가노이드 형성을 평가합니다.향상된 ALDH 효소 활성을 보이는 인간 유방암 세포는 CD44 수치가 높고 CD24 발현 수준이 낮거나 음으로 나타나며 유방암 줄기세포로 분류할 수 있습니다. 벌크 집단 내에서 유방암 줄기세포의 비율은 세포주 또는 환자에 따라 다를 수 있으며 종종 질병 단계에 따라 다르며, 일반적으로 더 공격적인 유방암이 유방암 줄기세포의 비율이 더 높습니다. 단일 유방암 세포가 자가 재생하고 50개 세포의 콜로니를 생성하는 능력은 콜로니 형성 분석법으로 평가할 수 있습니다.유방암 줄기세포가 앵커리지와 무관한 실험 조건에서 자가 재생하는 능력은 유방권 분석법으로 평가할 수 있습니다. 유방암 세포와 기저막 추출물을 배양하면 유방암 줄기세포가 생체 내 조건을 재현하는 3D 구조를 형성할 수 있습니다. 또한 생체 내 마우스 이종이식 모델을 사용하여 비유방암 줄기세포 또는 벌크 세포 집단과 비교하여 유방암 줄기세포의 성장, 자가 재생, 분화 및/또는 종양 시작 능력의 차이를 이해할 수 있습니다.이 절차에 따라 분리된 유방암 줄기세포는 전사체학, 키노믹 및 대사체 연구에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 연구자들에게 종양 시작, 전이, 재발 및 치료 저항성에서 유방암 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다.

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Research

연구

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Cancer Research

암 연구

암 줄기 세포 (CSCs)이 malignancies의 숫자에서 확인되었습니다. 이 프로토콜에서 우리는 인간의 췌장 선암의 xenografts에서 CSCs을 분리하는 알데히드 탈수소 효소의 활동과 CD44과 CD24 표현을 활용 흐름 cytometric 방법을 설명합니다. 이 가능한 전지는 다음 기능 분석 연구에 사용할 수 있습니다.

인간 췌장암의 Xenografts에서 줄기 세포의 분리

뇌 종양 세포 시작 (BTICs), 이기종 종양이 가진 줄기 세포의 속성 내에있는 희귀 한 세포의 식별은 인간의 뇌 종양의 pathogenesis에 새로운 통찰력을 제공합니다. 우리는 BTICs에 풍부하게 특정 문화 조건을 정제 한, 우리는 정기적으로 더 이러한 인구 풍부 유동 세포 계측법을 사용합니다. 단일 셀 RT-PCR에 의한 자기 갱신 assays 및 성적표 분석은 이후 이러한 절연 셀에 수행 할 수 있습니다.

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배우세요 유방암 줄기 세포 분리 및 기능 평가 방법을 세포와 조직 샘플에서. 이 기술은 종양 형성과 전이를 연구하고 표적 치료 전략을 개발하는 데 활용됩니다.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

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