세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

이 기술을 통해 연구자들은 시험관 내 및 생체 내 기능 특성화 분석의 성능을 위해 유방암 줄기 세포를 최대한의 순도와 생존력으로 분리할 수 있습니다. 분리된 유방암 줄기세포는 종양원성과 전이를 조절하는 분자 사건을 밝히고 이러한 세포를 표적으로 하는 치료 전략을 설계하는 데 도움이 될 수도 있습니다. 관심 있는 세포 및 조직 유형에 특이적인 약간의 변형을 통해 이 방법은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다.

세포 배양에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면 PBS로 80% confluent 유방암 세포 배양을 세척하고 실온에서 5분 동안 적절한 세포 해리 용액으로 세포를 처리합니다. 세포가 분리되면 5ml의 배양 배지를 추가하여 세포 해리 용액을 중화하고 원심분리를 위해 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 계수를 위해 펠릿을 5ml의 PBS에 재현탁합니다.

계수 후, 세포를 다시 원심 분리한 다음 ALDH 기질 완충액 밀리리터당 10-6개의 세포를 한 번에 재현탁합니다. 조직 샘플에서 단일 세포 현탁액을 생성하려면 십자형 기법으로 수술용 블레이드를 사용하여 종양 조직을 약 1mm 크기의 조각으로 다집니다. 10ml의 해리 완충액이 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브에 조각을 넣습니다.

셰이커에서 섭씨 37도에서 40분 동안 배양하기 위해 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 원심분리로 소화된 조직 조각을 침전합니다. 5ml 피펫을 사용하여 펠릿을 5ml의 트립신에 재현탁시키고 37도 수조에서 5분 동안 조직을 배양합니다. 배양이 끝나면 조직을 여러 번 격렬하게 피펫팅하여 단일 세포를 방출하고 튜브의 총 부피를 25ml로 끌어올리기에 충분한 DMEM/F-12 배지를 추가합니다.

원심분리를 통해 세포를 수집하고, 펠릿을 1ml의 Displace DNAse에 재현탁시킨 다음, 섭씨 37도의 수조에서 5분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 PBS로 총 부피를 10 밀리리터로 가져옵니다. 피펫팅으로 세포를 혼합하고 40 미크론 세포 여과기를 통해 50 ml 튜브에 주입합니다.

원심분리 후, 계수를 위해 5ml의 새로운 PBS에 세포를 재현탁합니다. 콜로니 형성 분석을 수행하기 위해, 분류 후, 세포를 완전한 배지에 재현탁시키고 튜브당 2밀리리터의 배지를 포함하는 3개의 튜브 각각에 적절한 수의 유방암 줄기세포를 추가하고, 두 번째 세포에 10 곱, 두 번째 세포에 10 곱 또는 두 번째 세포에 10 곱으로 표시한다. 피펫을 위아래로 5회 사용하여 세포 현탁액을 철저히 혼합하고 세포를 6웰 플레이트의 개별 웰에 플레이트합니다.

플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 균일한 세포 분포를 얻고 콜로니가 나타날 때까지 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓습니다. 배양이 끝나면 웰당 1ml의 PBS로 세포를 세척하고 웰당 500마이크로리터의 0.05% 크리스탈 바이올렛 용액으로 세포를 30초 동안 염색합니다. 배양이 끝나면 우물당 2ml의 물로 우물을 두 번 세척하여 과도한 염료를 제거하고 4배 또는 10배 배율로 광학 현미경으로 우물당 총 집락 수를 세고 기록합니다.

유방권 분석을 수행하기 위해, 분류 후, 세포를 완전한 유방권 배지에 재현탁시키고 96 웰 초저 부착 세포 배양 플레이트에서 웰당 평방 센티미터 면적당 두 번째 세포의 5배 10의 좌석 밀도로 플레이트를 플레이팅합니다. 광학 현미경으로 웰당 유방구의 수를 세기 전에, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 5-10일 동안 넣습니다. 3D 배양 모델을 설정하려면 기포가 없는 96웰 플레이트의 각 웰에 50마이크로리터의 기저막 추출물을 조심스럽게 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배치하여 용액이 중합될 수 있도록 합니다.

겔 층이 건조되지 않도록 10분 후에 100마이크로리터의 PBS를 추가합니다. 배양 종료 시, 분류된 세포를 3D 배양 배지 농도 200마이크로리터당 3번째 세포의 5-50배로 현탁하고 96웰 플레이트의 각 웰에 있는 PBS를 세포를 포함하는 200마이크로리터의 배지로 교체합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 10-14일 동안 넣은 후 배양물의 오가노이드 형성을 평가합니다.

향상된 ALDH 효소 활성을 보이는 인간 유방암 세포는 CD44 수치가 높고 CD24 발현 수준이 낮거나 음으로 나타나며 유방암 줄기세포로 분류할 수 있습니다. 벌크 집단 내에서 유방암 줄기세포의 비율은 세포주 또는 환자에 따라 다를 수 있으며 종종 질병 단계에 따라 다르며, 일반적으로 더 공격적인 유방암이 유방암 줄기세포의 비율이 더 높습니다. 단일 유방암 세포가 자가 재생하고 50개 세포의 콜로니를 생성하는 능력은 콜로니 형성 분석법으로 평가할 수 있습니다.

유방암 줄기세포가 앵커리지와 무관한 실험 조건에서 자가 재생하는 능력은 유방권 분석법으로 평가할 수 있습니다. 유방암 세포와 기저막 추출물을 배양하면 유방암 줄기세포가 생체 내 조건을 재현하는 3D 구조를 형성할 수 있습니다. 또한 생체 내 마우스 이종이식 모델을 사용하여 비유방암 줄기세포 또는 벌크 세포 집단과 비교하여 유방암 줄기세포의 성장, 자가 재생, 분화 및/또는 종양 시작 능력의 차이를 이해할 수 있습니다.

이 절차에 따라 분리된 유방암 줄기세포는 전사체학, 키노믹 및 대사체 연구에 사용할 수 있습니다. 이 방법은 연구자들에게 종양 시작, 전이, 재발 및 치료 저항성에서 유방암 줄기세포의 역할을 탐구할 수 있는 기회를 제공합니다.