Name: 지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 배우세요 역상 HPLC와 열적 어닐링을 이용하여 알레르겐에서 내인성 지질 리간드를 제거하고 교체하는 방법. 이 기술은 알레르겐 구조와 면역원성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 톰 커비 박사, 스콧 가벨, 그리고 로버트 런던 박사의 도움과 도움에 감사드리며, 밥 페트로비치 박사와 로리 에드워즈 박사와 함께 이 연구에서 사용되는 Bla g 1 구체를 생성하는 데 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 우리는 질량 분석에 대한 안드레아 아담스와 NMR 계측에 대한 지원을 유진 DeRose 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다, 환경 보건 과학의 국립 연구소, Z01-ES102906 (GAM). 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 환경 보건 과학 연구소의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. 블라 g 1 복제
<ol><li>바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1.0101 (잔류물 34-216)에 대한 유전자를 획득, MA 도메인의 단일 반복을 나타내는. 단순성을 위해, 블라 g 1은 전체 Bla g 1.0101 성적 증명서가 아닌이 단일 반복을 나타내는 작업 전반에 걸쳐 사용됩니다.</li>
	<li>블라 g 1 유전자를 원하는 벡터로 서브클론한다. 본 연구에서는, 담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제 분열 부위에 결합된 N-말단 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 태그를 함유한 유전자는이전에설명된 바와 같이 발현을 위한 pGEX 벡터로 삽입되었다.</li>
	<li>블라 g 1 pGEX 벡터를 BL21 DE3 대장균 세포로 변환합니다.<ol>
<li>원하는 벡터의 10 ng/μL 스톡을 준비합니다.</li>
		<li>제조업체가 제공한 BL21 DE3 세포의 50 μL과 10 ng/μL DNA 스톡의 1 μL을 결합합니다.</li>
		<li>BL21 DE3-DNA 혼합물을 얼음에 30분 동안 배양합니다. 42°C 수조로 1분 간 이동한 다음 즉시 얼음으로 다시 이동하여 1분 추가 로 배양합니다.</li>
		<li>세포에 LB 매체의 200 μL을 추가하고 37°C에서 1h를 추가로 배양합니다.</li>
		<li>100 mg/L 암피실린을 포함하는 LB-Agar 플레이트에 변형된 세포를 접시에 접시와 하룻밤 동안 37°C에서 성장.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 초기 식및 정제
<ol><li>1.3에 기술된 블라 g 1 벡터로 변형된 BL21 DE3 세포의 단일 콜로니를 함유한 100 mg/L 암피실린을 함유한 LB 매체의 접종 1 L. 하룻밤 사이에 37 °C에서 성장하십시오.</li>
	<li>다음 날, 수확 세포 (OD600 ~1.5) 원심 분리를 통해 6,000 x g에서 10 분 동안 10 분 및 100 mg /L 암피실린을 포함하는 2 x YT 매체의 2 L에서 다시 중단합니다. 세포가 37°C에서 1h를 추가로 증가시키는 것을 OD600 > 0.6으로 한다.</li>
	<li>0.5 mM IPTG의 첨가를 통해 단백질 발현을 유도한다. 세포를 18°C로 옮기고 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음 날, 2.2에 설명된 대로 수확 세포. 결과 세포 펠릿은 -20°C에서 동결 및 저장될 수 있다.</li>
	<li>리시스 완충제(50m Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl)에서 배양 1L로부터 얻은 펠릿을 재차해서 1개의 프로테아제 억제제 정제(또는 이와 동등한) 및 1μL의 벤조나제 뉴클레아제1을 함유한다.</li>
	<li>프로브 초음파 처리기(500W, 20kHz)를 사용하는 Lyse 세포는 50%의 듀티 사이클로 4분 동안 30~50%의 전력으로 설정됩니다. 초음파 처리 중에 얼음 욕조에 lysate를 유지</li>
	<li>원심분리기는 45,000 x g에서 20분 동안 lysate. 불용성 분수 (펠릿)를 폐기하십시오.<ol>
<li>용해성 단백질 28 μL을 제거하십시오. 5x SDS-PAGE 버퍼7 μL과 결합하고 SDS 페이지 분석을 위해 저장합니다. TEV를 통해 인큐베이션 전후의 GST 컬럼 흐름, 세척 및 용출 분획에 대해 이 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS pH 7.4에서 평형으로 평가되는 글루타티온 수지 컬럼(~10mL 총 침대 부피)에 수용성 단백질(supernatant)을 적용합니다.</li>
	<li>PBS의 50mL를 사용하여 모든 unbound 단백질을 씻어.</li>
	<li>엘루트 GST-Bla g 1 10 mM 감소 글루타티온을 포함 하는 PBS의 50 mL를 사용 하 여.</li>
	<li>4°C에서 하룻밤 동안 0.2 kU TEV 프로테아제, 또는 GST 태그를 제거하기 위해 6h의 실온으로 eluted 단백질을 배양합니다.</li>
</ol>3. 역상 HPLC를 통한 내인성 지질 제거
<ol><li>갈라진 블라 g 1을 수집하고 <10 kDa 분자량 컷오프가 있는 원심 필터 유닛을 사용하여 ~2mL에 농축한다.<ol>
<li><12mL 샘플을 농축기 상단에 넣고 스윙 버킷 로터에서 10-15분 동안 5,000 x g로 회전합니다. 참고: 샘플 볼륨 및 스핀 속도는 특정 필터와 사용 되는 로터의 종류에 따라 달라 집니다. 사용하기 전에 제조업체 설명서를 참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>97% 완충 A(물, 0.1% 트리플루오로아세트산) 및 3% 완충 B(아세토나이트, 0.1% 트리플루오로아세트산)로 평가된 C18 역상 크로마토그래피 컬럼을 장착한 250 x 10mm HPLC 시스템에 농축을 적재한다. 참고: 더 작은 컬럼이 사용될 수 있지만, 단백질은 감소된 결합 용량을 수용하기 위하여 다중 주기를 사용하여 적재되고 용출되어야 할 지도 모릅니다. 컬럼을 선택할 때 수지 구슬의 입자 크기가 < 5 μm의 입자 크기와 >200 Å의 모공 크기가 있어 단백질 크기의 분자의 효과적인 분리를 허용합니다. 주의: 트리플루오로아세트산은 부식성이 높으며 적절한 PPE(즉, 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 고글)를 사용하여 연기 후드 내에서 분배되어야 합니다. 아세토닐릴은 적당히 독성이 있고 휘발성이 높으며 인화성이 높으며 적절한 PPE(즉, 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 고글)를 사용하여 연기 후드 내에서 사용 및 분배되어야 합니다.</li>
	<li>Elute Bla g 1은 표 1에 표시된 프로토콜을 1.5-4.0 mL/min의 유량으로 사용합니다. 280nm에서 형광 흡수성을 사용하여 용출 공정을 모니터링한다.<ol>
<li>수집 및 풀 블라 g 1 분수. 블라 g 1 일반적으로 >74% 버퍼 B, 또는 ~34-40 분에서 elutes. 참고: 용출 시간은 유량 또는 열 크기에 따라 약간 달라집니다. 최상의 결과를 위해 A280을 기준으로 분수를 수집합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>시간 (최소)</td>
			<td>버퍼 A(%)</td>
			<td>버퍼 B (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td>97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td>35</td>
			<td>65</td>
		</tr>
<tr>
<td>55</td>
			<td>5</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td>65</td>
			<td>5</td>
			<td>95</td>
		</tr>
<tr>
<td>70</td>
			<td>97</td>
			<td>3</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 블라 g 1용 용출 프로토콜. C18 HPLC 컬럼을 사용하여 블라 g 1의 격리에 사용되는 용출 그라데이션을 설명하는 표입니다.
<ol start="4"><li>유리 테스트 튜브에 샘플을 알리쿼트, 절반 이상 테스트 튜브를 작성 (~ 4 mL). 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 두 개의 구멍으로 덮개를 천공하여 환기를 허용합니다.<ol>
<li>별도의 1mL 알리쿼트(테스트 알리쿼트)를 준비한다. 이 예상 수율을 결정하는 데 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플을 동결하고 1 h에 대한 -80 °C 냉동고에 배치하거나 액체 질소에 침지하여 알리쿼트를 테스트합니다. 나중에의 경우, 동결 시 액체 상의 팽창으로 인한 시험관 파손을 피하기 위해 튜브를 지속적으로 회전시켜야 한다.</li>
	<li>리오필라이저를 사용하여 생성된 탈지 단백질 샘플을 건조시. 말린 단백질은 밀봉된 용기에 몇 달 동안 4°C에서 보관될 수 있다.</li>
</ol>4. 아포 및 화물로드 블라 g 1의 재구성
<ol><li>예상 블라 g 1 수율을 결정합니다.<ol>
<li>리오필화, 디피케이트(HPLC 이후) 5mL의 재폴딩 버퍼, (50m HEPES pH 7.4, 100mM NaCl, 2% DMSO)에서 알리쿼트(aliquot)를 재보종한다.</li>
		<li>혼합물을 수조(250mL 물로 500mL 비커)에서 가열하고 뜨거운 접시 위에 바를 저어 95°C로 가열합니다. 소용돌이 용액은 간헐적으로 0.5-1 h에 대한 95 °C에서 배양.</li>
		<li>불을 제거하고 천천히 물 목욕이 실온 (~1h)에 평형하게 합니다. Annealed 단백질은 필요한 경우 4 °C에서 하룻밤 사이에이 형태로 저장 될 수 있습니다.</li>
		<li>0.22 μM 주사기 필터를 통해 어닐블라 g 1지질 혼합물을 통과하여 미립자를 제거합니다.</li>
		<li>완충제는 3.1에서 논의된 바와 같이 10kDa 컷오프가 있는 원심 필터를 사용하여 여과된 단백질 3x를 PBS pH 7.4로 교환하여 잔류 지방산 및 유기 용매를 제거한다.</li>
		<li>BCA 분석 또는 UV 흡광도와 같은 다른 바람직한 방법을 사용하여 단백질 농도를 평가합니다. 이 것을 사용하여 나머지 Bla g 1 알리쿼트의 예상 수율을 결정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아포 또는 화물로 적재된 블라 g 1 재구성<ol>
<li>4.1.1에 설명된 대로 다시 접이식 버퍼에서 블라 g 1 알리쿼트를 다시 일시 중지합니다.</li>
		<li>아포-블라 g 1을 생성하려면, 원하는 수율을 얻기 위해 4.1.2-4.1.6 단계를 반복한다.</li>
		<li>지방산으로 블라g 1을 적재하려면 메탄올 또는 DMSO에 원하는 지방산 화물의 20mM 스톡 솔루션을 준비하십시오.  그런 다음 4.2.5 단계로 건너뜁니다.</li>
		<li>인지질으로 블라 g 1을 적재하려면 유리 테스트 튜브 내부의 클로로포름에 원하는 화물의 10 mg/mL 재고를 준비하십시오.<ol>
<li>엽록체를 증발하여 지질 필름을 생성합니다. 20mMM의 최종 인지질 농도를 생성하기 위해 시험관에 PBS를 추가합니다. 주의: 클로로폼은 흡입하거나 삼킨 경우 유해합니다. 화학 연기 후드에 사용하거나 부적절한 환기가 가능한 경우 호흡보호구를 사용하십시오. 취급시 니트릴 장갑, 실험실 코트 및 고글을 사용하십시오. 사용하기 전에 MSDS에 문의하십시오.</li>
			<li>지질화물의 위상 전이 온도 이상으로 가열하고 용액이 흐리게 될 때까지 소용돌이를 통해 지질 필름을 재수화합니다. 일부 화물을 완전히 재일시 중단하고 재수화하려면 초음파 처리가 필요할 수 있습니다.</li>
			<li>초음파 처리가 필요한 경우, 욕조 초음파 처리기 (100 W, 42 kHz)에 테스트 튜브를 배치하고화물이 다시 중단 될 때까지 최대 전력으로 초음파 처리합니다. 대안적으로, 프로브 초음파 처리기(2.6에 기술)는 50%의 듀티 사이클을 사용하여 10-20%의 전력을 사용할 수 있다. 주의: 초음파 처리는 청력에 손상을 줄 수 있는 고주파 음파를 사용합니다. 소음 억제 PPE(귀마개 또는 머플러)를 사용합니다. 가능하면 음초음파처리기를 사운드 감쇠 캐비닛 이나 챔버 내부에 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4.1에서 결정된 예상 수율에 기초하여 블라 g 1에 비해 리간드의 20배 를 초과하는 리간드를 생성하기 위해 원하는 지방산 또는 인지질화물을 첨가한다. 이 단계에서 추가된 유기 용매의 총 부피는 2%를 초과해서는 안 됩니다. 혼합 소용돌이. 참고: 1 L of Bl 21 DE3 세포는 전형적으로 튜브 당 ~400 μM 리간드에 해당하는 ~0.25-0.4 nmol 단백질을 산출합니다.</li>
		<li>4.1에 기술된 바와 같이 단백질을 안닐.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 31P-NMR을 통한 인지질화물 제거/적재 확인
<ol><li>3.1에 설명된 바와 같이 원심 필터 장치를 사용하여 Apo- 또는 화물로드 블라 g 1 내지 >100 μM의 농축 샘플.</li>
	<li>PBS 버퍼에서 기준 인지질을 2, 1.5, 1, 0.5 및 0.25 mMM의 최종 농도로 재수화합니다.</li>
	<li>초라트 버퍼(100m Tris pH 8.0, 100mMM NaCl, 10% w/v cholate)로 샘플을 1:1을 희석하여 총 부피 ~600 μL에 희석합니다. 참고: Cholate는 블라 g 1 소수성 캐비티에서 지질을 완전히 추출하고 용해시키기 위해 이 단계에서 사용됩니다. 이것은 인지질 헤드 그룹을 둘러싼 화학 환경이 다른 샘플 간에 일관되도록 보장하여 31P-NMR을 사용하여 정량적 평가를 가능하게합니다. 초레이트 사용은 이전에 설명된 바와 같이 클로로폼/메탄올을 대체할 수있다.</li>
	<li>초레이트 용윤화 블라 g 1 샘플의 1D 31P-NMR 스펙트럼을 획득하고 광대역 프로브를 사용하여 인지질 표준을 참조한다. 참고: 이 작업에 제시된 31P-NMR 분광은 600MHz 분광기를 사용하여 획득하였다. 그러나, 유사한 기술을 채택하는 이전 연구는 허용 감도가 150-200 MHz15의낮은 필드 강도에서 달성 될 수 있음을 시사한다.</li>
	<li>적절한소프트웨어(16)를사용하여 결과 데이터를 처리합니다.</li>
	<li>선호하는 NMR 보기소프트웨어(17)를사용하여 피크 강도를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>블라 g 1 31P-NMR 스펙트럼을 인지질 기준 시료에 대해 얻은 것과 비교하여 가시 피크의 화학적 변화에 기초하여 내인적으로 바운드된 리간드 및/또는 원하는 리간드의 결합을 확인한다.<ol>
<li>블라 g 1 스펙트럼의 피크 강도를 인지질 기준 표준의 강도와 비교하여 전체 결합 스토이치오메트리를 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 블라 g 1 접이식 확인
<ol><li>CD 버퍼에서 블라 g 1의 0.5 μM 샘플을 준비하십시오(100mM KH2PO4,버퍼 pH 7.5). 시료 2mL를 마그네틱 스터드 바가 있는 10mm CD 커벳에 넣습니다.</li>
	<li>블라 g 1의 CD 스펙트럼을 측정하여 이차 구조의 재구성을 확인합니다. Photomultiplier(PMT) 전압이 제조업체 권장 사항(일반적으로 1kV)을 초과하지 않는지 확인합니다.<ol>
<li>데이터 통합 시간 0.2 nm및 20 nm/s의 스캔 속도로 25°C에서 260-200 nm에서 CD 신호를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CD 셀의 온도를 0.5°C/min의 속도로 25°C-95°C에서 늘립니다. 마그네틱 교반바를 활성화하여 샘플 전체에서 온도가 균일하도록 합니다.</li>
	<li>222 nm에서 CD를 모니터링하여 2 °C마다 판독값을 복용합니다.</li>
	<li>결과 데이터를 2상태 Boltzman 곡선에 맞게 용융 온도를 결정합니다. 블라g 1의 높은 안정성으로 인해, 용융온도(MT 25)는단백질이 222nm에서 초기 CD의 25%를 잃은 온도로 정의되었다.</li>
</ol>

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<li>Bublin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+gastrointestinal+digestion+and+heating+on+the+allergenicity+of+the+kiwi+allergens+Act+d+1%2C+actinidin%2C+and+Act+d+2%2C+a+thaumatin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+and+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).</li>
<li>Griesmeier, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+thermal+stability+of+Lep+w+1%2C+the+major+allergen+of+whiff%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Nutrition+and+Food+Research%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff.</a> Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).</li>
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<li>Aalberse, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+amino-terminal+fragment+of+Ara+h+1+as+a+major+target+of+the+IgE-binding+activity+in+the+basic+peanut+protein+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction.</a> Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).</li>
<li>Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+lipids+influence+the+allergic+sensitization+process%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Do lipids influence the allergic sensitization process.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).</li>
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이 작품에 기재된 프로토콜은 블라g 1의 지질 결합 특성을 체계적으로 연구하기 위해 성공적으로 적용되었다. 이는 화물 결합, 열안정성 및 내구 처리 사이의 상관관계를 드러냈으며, 후자는 면역원성9,18에대한 잠재적 의미와 알려진 T세포 에피토프의 생성 감소와 상관관계가 있었다. 블라 g 1 외에도, Pru p 3 및 Bet v 1과 같은 다른 알레르겐은 표준 친화성 및 크기 배제 크로마토그래피방법(13,19,20,21,22)을사용하여 정제될 때 내인성 바운드 화물을 유지하는 것으로 나타났다. 이 원치 않는 손님은 유사한 방식으로 이 단백...

알레르겐 데이터베이스를 조사한 결과 알레르겐은 알려진 모든 단백질 가족의 2%만에서 발견되는 것으로 나타났으며, 이는 일반적인 기능성 및 생체학적 특성이 알레르기성1에기여한다는 것을 시사한다. 이러한 특성 중, 지질 화물을 결합하는 능력은 알러지 원 들 사이에서 강하게 과대 대표되는 것으로 보이며, 이러한 화물이 민감화 과정1에영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 실제로, 브라질 너트 알레르겐 Ber e 1은 내인성 지질과 함께 완전한 감이 있는 잠재력2를실현하는 데 협력해야 한다는 것을 보여주었습니다. 이들 지질은 잠재적으로 mite 알레르겐 Der p 2 및 Der p 7에 의해 도시된 바와 같이 면역 체계를 자극할 수 있으며, 둘 다 LPS 결합 단백질3,4,5와함께 강한 구조적 동성학을 공유할 수 있다. 이러한 관찰에 기초하여 Derp 2 및 Der p 7은 세균지질을 결합하고 TLR4 매개 신호를 통해 숙주 면역 체계를 직접 자극하여 민감화 과정5,6을용이하게 할 수 있다고 제안되었다. 내인성 으로 결합된 지질이 알레르기 성 단백질 자체의 생물학적 특성을 바꿀 수 있습니다. 예를 들어, 신a2(겨자) 및 아라 h1(땅콩)이 인지질 소포와 상호작용하는 능력은 위 및 내외 저하7에대한 저항력을 크게 향상시켰으며, 주요 자작나무 꽃가루 알러지 유발 물질 내기 v 1에 결합하는 동안 내구 처리속도와 결과 펩타이드의 다양성을 모두 변화시켰다8. 이는 Bet v 1 및 Bla g 1과 같은 단백질에 대한 안정성, T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 사이에서 관찰된 상관관계를 고려하여 알레르기성과 특히 관련이 있습니다. 후자는 이 작품의 주제가 될 것입니다9,10.
블라g 1은 곤충 주요 알레르겐(MA) 단백질 패밀리의 프로토타입 멤버를 나타내며, 비정상적으로 큰 소수성 충치9,11을둘러싸는 12개의 수륙양용 알파 헬기로 구성된 독특한 구조를 갖는다. 블라 g 1의 사용 가능한 X 선 결정 구조는 결합 된 인지질 또는 지방산 리간드와 일치하는이 캐비티 내의 전자 밀도를 보여줍니다. 31P-NMR 및 질량 분석법에 의해 확인된 추측. 이러한 화물은 본질적으로 이질적이었고, 이들의 조성물은 알레르겐 소스에 크게 의존했으며, 대장균과 P. 목회에서 발현된 재조합 블라 g 1을 위해 관찰된 다른 지질 프로파일이 관찰되었다. 흥미롭게도, 블라 g 1 천연 알레르겐 소스에서 정제 (바퀴벌레 frass) 그것의 결합 부위 내에서 주로 지방산을 포함, 팔미타테의 혼합물, 올레아테, 그리고 stearate의 혼합물로 식별 되는 "자연" 리간드9,11. 여러 정화 단계에 따라 지질과 지방산을 유지하는 Bla g 1의 능력은 격리된 단백질을 연구하는 노력을 방해합니다. 반대로, 블라g 1의 천연 팔미타테, 스테레이트 및 올레아테 리간드가 알레르기성 및 토착 생물학적 기능9모두에서 핵심적인 역할을 한다는 것이 제안되고 있다. 그러나, 이러한 리간즈는 재조합 소스에서 얻은 블라 g 1에 존재하지 않으며, 이 가설을 평가하기 어렵게 만듭니다. Bet v112,13과같은 다른 지질 결합 알레르겐에 대해도 유사한 문제가 관찰되고 있다. 지질 알레르겐 상호 작용의 체계적인 연구를 용이하게하기 위해 우리는 알레르겐이 내인성 바운드 지질을 정량적으로 제거하고 아포 형태로 재구성하거나 특정 리간드로로드 할 수있는 프로토콜을 개발했습니다.
알레르겐은 친화성 크로마토그래피 및/또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 자연 또는 재조합 소스에서 가장 일반적으로 정제됩니다. 여기서, 알러지 유발 물질이 지방산 결합단백질(14)에대해 개발된 프로토콜과 유사한 유기 용매로 용출되는 역상 C18 컬럼을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)의 형태로 추가 정화 단계를 소개한다. 결과 단백질은 지방산 및/또는 인지질의 부재 또는 존재에 있는 열 어닐링 단계를 복종합니다. 네이티브 Bla g 1 접기를 복구하는 것 외에도, 높은 온도는 지질 화물의 용해도및 접근성을 증가시키고, 아포 형태로 블라 g 1을 산출하거나 원하는 소수성 리간드로 균일하게 로드됩니다. 31 이러한 방식으로 정제된 블라g 1의 P-NMR 스펙트럼은 원하는 화합물과 내인성 바운드 리간드와 균일한 교체의 완전한 제거를 확인했으며, 원형 이색증은 블라 g 1 폴드의 성공적인 회복을 확인하였다. 이 방법의 유용성은 A9 g 1 열안정성 및 보철 저항을 향상시키는 화물 결합이 발견된 최근 작업에서 강조되어 T 세포 에피토프 생성의 운동학을 민감화 및 알레르기성9에대한 잠재적 인 의미로 변경합니다.

<table><tbody><tr><td>Bla g 1 유전자&nbsp;</td><td>Genescript</td><td>N/a</td><td>맞춤형 유전자 합성 서비스. GenBank Accession AF072219 잔류물 없음 34-216</td></tr><tr><td>Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1)</td><td>실내 생명공학</td><td>N/a</td><td>맞춤 주문</td></tr><tr><td>Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템</td><td>Agilent</td><td>G1315B, G1311A, G1322A</td><td>UV 검출기, 펌프 및 탈기 장치</td></tr><tr><td>Agilent DD2 600MHz 분광계</td><td>Agilent</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛</td><td>Amicon</td><td>UFC-1008</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>광대역 5mm Z-gradient probe</td><td>Varian</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation for LC (Software)</td><td>Agilent</td><td>N/a</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>디스스테아로일포스파티딜콜린(18:0 PC)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>E. Coli BL21 DE3 세포</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 동결 건조 시스템</td><td>Labconco</td><td>7750000</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온 수지</td><td>Genescript</td><td>L00206</td><td></td></tr><tr><td>글루타티온, 환원</td>된 <td>Fisher Scientific</td><td>BP25211</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>34060</td><td></td></tr><tr><td>Jasco&nbsp; CD 분광편광계</td><td>Jasco</td><td>J-815</td><td></td></tr><tr><td>Millex 주사기 필터 유닛</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td>NMRipe (Software)</td><td>Delaglio et al.&nbsp;</td><td>N/a</td><td>Delaglio, F. et al. Nmrpipe - 유닉스 파이프를 기반으로 하는 다차원 스펙트럼 처리 시스템. J. Biomol. NMR 6, 277&ndash; 293 (1995년).</td></tr><tr><td>NMRViewJ (Software)</td><td>Johnson et al.&nbsp;</td><td>N/A</td><td>존슨, B.A. & Blevins, R.A. NMR View: NMR 데이터의 시각화 및 분석을 위한 컴퓨터 프로그램. J. 바이오몰. NMR 4, 603&ndash; 614 (1994년).</td></tr><tr><td>올레산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCA1-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC 컬럼</td><td>애질런트</td><td>SKU: A2000250X100</td><td></td></tr><tr><td>SD-200 진공 펌프</td><td>Varian</td><td>VP-195</td><td></td></tr><tr><td>소듐 콜레이트 수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C6445</td><td></td></tr><tr><td>소듐팔미테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9767</td><td></td></tr><tr><td>소듐스테아레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3381</td><td></td></tr><tr><td>VnmrJ (소프트웨어)</td><td></td><td>Varian N/a</td><td></td></tr></tbody></table>

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

많은 주요 알레르겐은 Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 및 Fel d 1을 포함하여 소수성 지질과 같은 분자에 결합합니다. 이러한 리간드는 강하게 유지되며 면역 체계를 직접 자극하거나 알레르기 성 단백질의 생물 학적 특성을 변경하여 감쇠 과정에 영향을 미칠 가능성이 있습니다. 이러한 변수를 제어하기 위해서는 내인성 바운드 리간드를 제거하고 필요한 경우 알려진 조성물의 지질을 대체하는 데 기술이 필요합니다. 바퀴벌레 알레르겐 블라 g 1은 전통적인 기술을 사용하여 정제 할 때 내생 지질의 이질적 혼합물을 결합하는 큰 소수성 구멍을 둘러싸고 있습니다. 여기서는 역상 HPLC를 사용하여 이러한 지질을 제거한 다음 열 어닐링으로 아포 형태로 Bla g 1을 산출하거나 지방산 또는 인지질화물의 사용자 정의 혼합물로 재장전되는 방법을 설명합니다. 생화학적 분석과 이 프로토콜을 결합하면 지방산 화물이 Bla g 1의 열안정성 및 보철 저항을 크게 변화시키고 T 세포 에피토프 생성 및 알레르기성 속도에 대한 하류에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 재조합 및 천연 소스 모두에서 알레르겐을 연구할 때 본원에 설명된 것과 같은 지질 제거/재장전 프로토콜의 중요성을 강조한다. 이 프로토콜은 리포칼린(Mus m 1), PR-10(Bet v 1), MD-2(Der p 2) 및 우트로글로빈(Fel d 1)을 포함한 다른 알레르겐 가족에게 일반화되어 알레르기 반응에서 지질의 역할을 연구하는 귀중한 도구를 제공한다.

친화도 크로마토그래피를 사용하여, 재조합 GST-Bla g 1은 세포 배양의 ~2-4 mg/L의 수율을 생성하여 높은 수준의 순도(도1A)로쉽게 분리되었다. 4°C에서 TEV 프로테아제를 사용하여 하룻밤 배양하면 GST 태그를 제거하기에 충분하여 ~24 kDa에서 최종 생성물을 산출합니다. 이 경우 유량 통과 및 세척 분획에 상당한 양의 GST-Bla g 1이 있어 글루타티온 수지 결합 용량을 초과한 것을 시사합니다. 샘플 로딩 및 용출의 수지 또는 여러 주기를 사용하면 이 문제에 대한 해결 이 문제가 해결될 수 있습니다.
블라g 1을 역상 C18 컬럼에 적용하면 독특한 용출프로파일(도 1B)을생성하고, 두 개의 큰 피크를 ~50% 버퍼 B에서, 그리고 결과 분획의 두 번째 큰 피크는 전자가 cleaved GST 태그에 대응하는 반면, 후자는 Blag 1에 대응하는 반면, 그 결과 분수의 두 번째 큰 피크를 나타낸다. ...

이 프로토콜은 알레르겐에서 내인성 지질의 제거를 설명하고, 열 어닐링과 결합 된 역단계 HPLC를 통해 사용자 지정 리간드로 교체. 31 P-NMR 및 원형 이크로이즘은 리간드 제거/로딩의 신속한 확인과 토착 알레르겐 구조의 회복을 허용한다.

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...

많은 알레르겐은 소수성 분자를 결합합니다. 이 프로토콜은 이러한 리간드의 완전한 제거 및 교체를 가능하게 하여 체계적인 방식으로 구조 및 면역원성에 미치는 영향을 연구할 수 있게 합니다. 역상 HPLC를 열 어닐링과 결합한 사용은 두 가지 장점이 있습니다.그것은 내인성 리간드를 제거하고, 그렇지 않으면 접근 할 수없는 바인딩 사이트를 열기 위해 리간드를 용해하는 데 도움이됩니다. 우리가 알레르기성에 기여하는 요인을 결정할 수 있는 경우에, 우리는 이 요인을 피하는 치료를 디자인할 수 있을지도 모릅니다. 많은 단백질은 강하게 유지되고 구조와 기능 둘 다에 영향을 미칠 수 있는 지질 리간드를 결합합니다.우리의 방법은 이러한 상호 작용의 체계적인 연구를 할 수 있습니다. 많은 지질화물의 제한된 용해도 및 접근성은 로딩 공정을 저해할 수 있다. 이러한 리간드를 준비할 때주의하고 시스템별 적응의 필요성을 고려해야 합니다.소수성 및 용해성 리간드와 함께 일하는 것은 일부 알레르기 학자 및 생화학자에 대한 조정이므로 샘플이 다른 단계에서 어떻게 생겼는지 보는 것이 유용 할 수 있습니다. 복제 식 및 정화 후, 총 부피가 2 밀리리터 미만으로 감소 될 때까지 스윙 버킷 로터에서 여러 원심 분리에 대한 10 킬로달톤 분자 량 차단이있는 원심 필터 장치에 12 밀리리터를 적용합니다. 결과 농축액을 250 x 10mm HPLC 시스템에 로드하여 C18 역상 크로마토그래피 컬럼을 장착하여 97%의 완충A와 3%버퍼 B.Elute Bla g 1을 분당 1.5 내지 4 밀리리터의 유량으로 평가하여, 표에 표시된 바와 같이, 280 나노미터에서 형광 흡수흡수를 이용하여 280 나노미터의 형광 흡수를 이용하여.약 34~40분에서 시작하여 74% 이상의 완충B 농도는 각 Bla g 1 분획의 4밀리리터를 더 이상 수집하지 않습니다. 유리 테스트 튜브에 풀라 g 1 분획을 알리 쿼트. 파라핀 필름으로 튜브를 덮고 두 개의 구멍으로 필름을 천공합니다.그런 다음 샘플을 영하 80도에서 1시간 동안 동결하고 리오필라이저를 사용하여 그 결과로 생성된 탈립 단백질 샘플을 건조시로 건조시합니다. 예상 블라 g 1 수율을 결정하려면, 재접이식 버퍼의 5 밀리리터에서 lyophilized 제거 된 테스트 알리쿼트다시 일시 중단. 혼합물을 500밀리리터 비커에 넣고 250밀리리터의 물을 넣고 교반하고 간헐적인 소용돌이가 있는 뜨거운 접시에 섭씨 95도까지 가열합니다.용액을 30~60분간 95도 유지한 후 수조가 실온과 서서히 평형화될 수 있도록 합니다. 용액이 냉각되면, 미립자를 제거하기 위해 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 아닐블라 g 1 지질 혼합물을 전달하고, 10킬로달톤 컷오프가 있는 새로운 원심 필터를 사용하여 여과된 단백질을 PBS로 3번 교환하여 잔류 지방산과 유기용매를 제거한다. 이어서, 표준 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도를 평가하여 남은 블라 g 1 알리쿼트에 대한 예상 수율을 결정한다.Apo-Bla g 1을 재구성하려면 알리쿼트당 5밀리리터의 다시 접이식 버퍼로 블라 g 1 알리쿼트를 다시 중단하고, 시연된 대로 샘플을 음결한다. 인지질을 사용하여 Bla g 1을 적재하려면 원하는 화물 10밀리그램을 유리 테스트 튜브에 추가하고 클로로폼에 용해하고 클로로폼을 증발하여 지질 필름을 생성합니다. 그런 다음 튜브에 PBS를 추가하여 20 밀리머의 최종 인지질 농도를 생성합니다.지질화물의 위상 전이 온도 위에 인지질을 가열하여 지질 필름을 재수화하고 용액이 흐리게 될 때까지 소용돌이를 가열합니다. 이어서, 예상 수율에 기초하여 블라g 1에 비해 20배 의 굴리 초과를 생성하기 위해 인지질화물을 첨가한다. 침전제가 형성될 수 있습니다.소용돌이는 입증 된 바와 같이 단백질을 어닐링하기 전에 혼합합니다. 인-31 NMR에 의한 화물 제거 또는 적재를 확인하려면 원심 필터를 사용하여 시료를 100 마이크로몰라 이상으로 농축한다. 표시된 바와 같이 PBS 버퍼에서 알려진 농도의 기준 인지질 샘플을 준비하고, 약 600 마이크로리터의 총 부피에 초레이트 버퍼를 가진 1:1 비율로 블라 g 1 엔드 참조를 희석한다.광대역 프로브를 사용하여 콜레이트 용해 블라 g 1 샘플 및 참조 인지질 표준의 1차원, 31-인 NMR 스펙트럼을 획득하고, 블라g 1 31인NMR 스펙트럼을 인지질 기준 시료에 대해 수득된 것과 비교하여 가시 피크의 화학적 변화에 기초하여 원하는 리간드의 내인성 바운드 리간드 및/또는 결합의 제거를 확인한 다음, 블라g 1 스펙트럼의 피크 강도를 포인지질 기준의 고유 강도를 완전한 확인을 허용한다. 친화성 크로마토그래피를 사용하여 재조합 GST Bla g 1은 높은 수준의 순도로 쉽게 분리되어 세포 배양 리터당 2 ~4 밀리그램의 수율을 생성할 수 있습니다. TEV 프로테아제와 함께 하룻밤 잠복은 GST 태그를 제거하기에 충분하여 약 24 킬로달톤의 최종 제품을 산출합니다.블라 g 1을 역상 C18 컬럼에 적용하면 독특한 용출 프로파일을 생성하며, 50% 버퍼 B에서 두 개의 큰 피크가 있고, 아포-블라 g 1의 75% 버퍼 B.Phosphorus-31 NMR 스펙트럼에서 두 번째로 큰 피크는 감지 가능한 인지질을 나타내지 않습니다. 표준 곡선은 알려진 DSPC 농도의 참조 샘플을 사용하여 NMR에서 생성될 수 있다. DSPC Bla g 1로부터 얻은 인 31 신호 강도를 이 표준 곡선과 비교하여 단백질당 지질의 결합 스토이치오메트리를 산출하는 데 사용할 수 있다.아포 및 지질로드 블라 g 1에 대한 원형 이색 스펙트럼은 주로 알파 -헬리칼 구조를 나타내는 220 및 210 나노미터의 미니마를 보여줍니다. 원형 이크로이즘 기반열 성소 해석은 또한 접힌 구형 도메인을 나타내는 알파-헬릭 이차 구조의 협동 손실을 나타낸다. 또한, 그 결과 용융 온도의 분석은 천연 알레르겐 소스에서 얻은 Bla g 1과 일치하는 nMix 리간드 결합시 상당한 증가를 나타낸다.이 프로토콜의 성공은 소수성 리간드의 제한된 용해도와 Bla g 1 결합 공동의 접근 불가능한 특성을 모두 극복하는 능력에 의존합니다. 이 절차는 T 세포 증식 분석과 같은 면역 학적 연구를위한 기초를 놓고, 이 발생을 통해 감수화및 분자 메커니즘에 지질 리간드의 효과를 평가하기 위해. 추가 생물 물리학 적 assays와이 절차를 결합, 우리는 소수성 리간드의 결합은 에피토프 생성 및 알레르기성에 대한 잠재적 다운스트림 의미와 함께, 블라 g 1 안정성을 향상 것으로 나타났습니다.

removal-replacement-endogenous-ligands-from-lipid-bound-proteins

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

제브라피시 배아에 존재하는 저농도 내인성 수용체를 검출하기 위한 새로운 기술이 설명됩니다. 우리는 이를 AFLIP이라고 명명했는데, 이는 면역침전과 연결된 리간드에 의한 수용체의 친화성 표지로 구성되어 있기 때문입니다.

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기에 설명 된 메서드는 exogenous 항 바인딩과 그물 관련 저하 크로스-프레 젠 테이 션에 의해 처리 됩니다 세포질 구획의 정화에 대 한 수 있는 새로운 소포 격리 프로토콜입니다.

외 인 항 원 십자가-프레 젠 테이 션에의 바인딩과 그물 관련 성능 저하 막 구획의 정화

프로시저 refolding dCACHE periplasmic ligand 바인딩 도메인 포함 시체와 단백질의 밀리 그램 수량을 정화에서 Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3의의 대 한 제공 됩니다.

효율적인 Refolding 및 Chemoreceptor Ligand 바인딩 도메인의 정화 방법

설명 된 항 원 자주 나노 입자와 자극 B 세포 활성화에서 생체 외에서 그리고 vivo에서에서 그들의 사용의 준비가 이다. 일관 되 고 강력한 항 체 응답 새로운 땅콩 알레르기 모델의 개발을 주도. 항 원 리를 생성 하기 위한 프로토콜은 다른 항 원 및 예방 모델을 확장할 수 있습니다.

질병-특정 항 체의 생성에 대 한 항 원 리

이 프로토콜은 밀 무세포 시스템 및 리포좀을 사용하는 이중층 투석 방법에 의한 고품질 프로테올리포좀의 생산을 위한 효율적인 무세포 방법을 설명합니다. 이 방법은 막 단백질의 기능 분석, 약물 표적 스크리닝 및 항체 개발에 적합한 수단을 제공합니다.

막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

여기서 우리는 인간 IgE 수용체에 감염된 쥐 배혈세포세포를 사용하여, 제1형 알레르기 반응에서 전형적으로 관찰되는 이펙터 세포의 분해를 시뮬레이션하기 위해 중재자 방출 분석체를 제시한다. 이 방법은 매우 민감하고 재현 가능하며 맞춤성 방식으로 알레르겐의 생물학적 활성을 조사합니다.

인간화된 중재자 릴리스 분석으로 알레르겐 효능에 대 한 읽기-아웃

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

인간 승모판의 단백질 조성은 여전히 ​​부분적으로 알려지지 않았는데, 그 이유는 세포질이 낮아 단백질 생합성이 낮기 때문에 분석이 복잡하기 때문입니다. 이 연구는 승모판 프로테옴의 분석을 위해 단백질을 효율적으로 추출하기위한 프로토콜을 제공합니다.

인간 승모판에서 단백질 추출을위한 최적화 된 프로토콜

배우세요 역상 HPLC와 열적 어닐링을 이용하여 알레르겐에서 내인성 지질 리간드를 제거하고 교체하는 방법. 이 기술은 알레르겐 구조와 면역원성 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

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