Name: 대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 배우세요 Caco2 대장암 세포로 균일한 3차원 스페로이드를 배양하는 방법을. 이 기술은 암 줄기세포 생물학 연구와 항암제 반응 분석에 활용됩니다.

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우리는 이미징 및 애니패스가 조직학 플랫폼(CRCL, CLB)을 재구성한다는 것을 인정합니다. 우리는 FOLFOX와 FOLFIRI의 친절한 선물을 위해 센터 레옹 베라드 (CLB) 병원의 약국에 빚지고 있습니다. 우리는 또한 원고의 비판적 독서에 대한 브리기테 맨십감사합니다. 이 작품은 FRM(Equipes FRM 2018, DEQ20181039598)과 Inca(PLBIO19-289)에 의해 지원되었습니다. MVG와 LC는 FRM의 지원을 받았고 CF는 ARC 재단과 센터 레옹 베라드의 지원을 받았습니다.

참고: 모든 시약 및 재료의 세부 정보는 재료 표에나열됩니다.
1. 스페로이드 형성
<ol><li>스페로이드 문화 미디어<ol>
<li>덜벡코의 수정독수리 매체(DMEM)로 구성된 기저형 매체를 4m L-alanyl-L-글루타민 디펩티드로 보충한다.</li>
		<li>1.1.1단계에서 기저 배지에서 10% 태아 소 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)을 함유한 DMEM 완전 배지를 준비한다.</li>
		<li>지하 멤브레인 매트릭스 2.5%, FBS 10%, 기초 매체 1%를 포함하는 DMEM/지하 막 매트릭스 배지를 1.1.1단계에서 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드 형성을 위한 플레이트 준비<ol>
<li>실온(RT)에서 약 20분 동안 따뜻한 기저및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지.</li>
		<li>각 우물에 500μL의 안티 준수 헹구는 용액을 추가하여 스페로이드 형성에 전념하는 24웰 플레이트의 우물을 후퇴시킵니다. 참고: 이 플레이트에서는 각 음웰이 1,200마이크로웰로 구성됩니다.</li>
		<li>플레이트용 어댑터가 있는 스윙 버킷 로터에서 1,200× g의 플레이트원심분리기. 참고: 한 접시만 사용하는 경우 무게의 균형을 맞추기 위해 물로 채워진 표준 플레이트를 추가로 준비합니다.</li>
		<li>따뜻한 기저 질의 2mL로 각각 잘 헹구고 우물에서 배지를 흡인시합니다.</li>
		<li>현미경의 밑에 접시를 관찰하여 기포가 마이크로웰에서 완전히 제거되었는지 확인합니다. 거품이 갇혀 있는 경우, 원심분리기는 거품을 제거하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 다시 원심분리기를 제거합니다.</li>
		<li>헹도 단계를 반복합니다 1.2.4-1.2.5.</li>
		<li>각 웰에 따뜻한 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL를 추가합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드 생성<ol>
<li>5% CO2를 포함하는 가습된 분위기에서 10% FBS 및 1% 펜/스트렙으로 보충된 DMEM 배지내의 2D 단층에서 Caco2 세포를 성장시다(이하 37°C/5%CO2라고 함). 참고: 사용할 최대 셀 구절 수는 80개입니다.</li>
		<li>인플루언서의 80%에 도달하면 인산완충식살린(PBS) 1x(10cm 접시에 5mL)로 세포를 씻고, 트립신 에틸렌디아민 테트라아세산(EDTA)(10cm 접시2mL)을 추가하고, 37°C에서 2~5분 동안인큐베이트에 2-5%를 더한다.</li>
		<li>현미경으로 세포 분리를 확인하고, 10cm 접시 당 DMEM 의 4 mL을 추가하여 트립신을 중화시다.</li>
		<li>혈종계를 사용하여 세포를 계산하여 총 세포 수를 결정합니다.</li>
		<li>세포 현탁액을 1,200 × g에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 버리고, DMEM/지하 막 매트릭스 배지의 적절한 부피로 펠릿을 재놓는다.</li>
		<li>마이크로웰 당 원하는 수의 세포수를 달성하기 위해 웰당 필요한 세포 수를 결정하기 위해 표 1을 참조하십시오. 또는, 24웰 플레이트에 대해 다음 수식을 사용하여 세포 수를 계산하고, 각 우물에는 1,200마이크로웰이 포함되어 있습니다. 웰 당 필요한 세포 수 = 마이크로웰 당 원하는 세포 수 × 1,200</li>
		<li>1 mL의 최종 부피에서 원하는 세포 수를 달성하기 위해 각 웰에 셀 서스펜션의 필요한 부피를 추가합니다.</li>
		<li>DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지 1mL을 각 웰에 추가하여 웰당 2mL의 최종 부피에 도달합니다(1.2.7단계 참조). 참고 : 마이크로 웰에 거품을 소개하지 않도록주의하십시오.</li>
		<li>소웰에서 세포를 포획하기 위해 5 분 동안 1,200 × g에서 즉시 플레이트를 원심 분리합니다. 필요한 경우 원심분리기를 물로 채워진 표준 플레이트와 균형을 맞설 수 있습니다.</li>
		<li>현미경의 밑에 플레이트를 관찰하여 세포가 마이크로웰 사이에서 균등하게 분포되어 있는지 확인합니다.</li>
		<li>플레이트를 방해하지 않고 48h에 대해 37°C/5%CO2에서 플레이트를 배양합니다. 참고 : 원래 프로토콜(21)에따르면 많은 세포주가 24 시간 이내에 스페로이드를 형성 할 수 있지만 일부는 더 긴 잠복기가 필요합니다. 이 프로토콜에서 48h는 스페로이드 형성에 충분합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로웰에서 스페로이드 수확<ol>
<li>RT에서 기저 및 DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 약 20분 동안 데워보시킵니다.</li>
		<li>세로지학적 파이펫을 사용하여 각 우물에서 배양 배지(1mL)의 절반을 제거합니다.</li>
		<li>마이크로웰에서 스페로이드를 제거하기 위해 배지를 우물 표면에 다시 넣습니다. 참고: 스페로이드를 만지거나 삼중시키지 마십시오.</li>
		<li>15mL 원피스 튜브 상단에 37 μm 가역 스트레이너(또는 40μm 표준 스트레이너)를 배치하여 스페로이드를 수집합니다. 참고: 40 μm 표준 여과기를 사용하는 경우 거꾸로 놓습니다.</li>
		<li>제거된 스페로이드(1.4.3단계에서)를 부드럽게 흡인시키고 스페로이드 서스펜션을 여과기를 통과합니다. 참고: 스페로이드는 필터에 유지됩니다. 단일 셀은 배지로 흐르게 됩니다.</li>
		<li>세로지학적 파이펫을 사용하여 웰의 전체 표면에 따뜻한 기저 배지 1mL을 분배하여 남은 스페로이드를 빼내고 여조기에 회수합니다.</li>
		<li>이 세탁 단계를 두 번 반복하십시오.</li>
		<li>현미경 의 밑에 접시를 관찰하여 모든 스페로이드가 마이크로웰에서 제거되었는지 확인합니다. 필요한 경우 세척을 반복하십시오(1.4.6-1.4.7 단계).</li>
		<li>여과기를 반전시키고 새로운 15mL 원추형 튜브에 놓습니다. DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지로 스트레이너를 세척하여 스페로이드를 수집합니다. 참고: 수집된 스페로이드는 다운스트림 응용 프로그램 및 분석을 위해 준비되었습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>스페로이드의 장기 문화<ol>
<li>기저 배지에 1.5% 아가로즈 용액을 준비하고, 오토클레이브(표준 사이클)를 통해 멸균한다.</li>
		<li>아가로즈 용액은 따뜻하고 여전히 액체이지만 표 2에설명된 바와 같이 표준 배양 접시 또는 접시의 우물을 코팅합니다. 참고 : 오븐에서 접시 / 접시를 따뜻하게하면 코팅 단계를 용이하게합니다. 코팅 된 접시 / 접시는 멸균 환경에서 최대 10 일 동안 RT에 남아 빛으로부터 보호 할 수 있습니다.</li>
		<li>아가로즈 코팅 플레이트에서 수확된 스페로이드(1.4.9단계에서)를 시드하고, DMEM/지하 멤브레인 매트릭스 배지를 추가하여 플레이트의 크기에 따라 최종 부피를 달성한다. 참고: 스페로이드 응집체를 피하려면 22스페로이드/cm2의최적 밀도로 시드하십시오. 코팅이 완벽하게 평평하지 않고 가장자리쪽으로 상승하여 플레이트 중앙에 가벼운 굴착을 일으킵니다. 스페로이드의 수가 너무 높으면 서로 고칠 가능성이 높습니다.</li>
		<li>특정 분석을 위해 스페로이드를 회수할 때까지 플레이트를 37°C/5%CO2로 배양한다.
</li>
	</ol></li>
	<li>화학 요법 약물로 스페로이드 치료<ol>
<li>플레이트 스페로이드는 1.5.4 단계에서 2 일 동안 성장합니다. 3일째 (D3)부터 시작하여 FOLFIRI(5-플루오로라실, 50 μg/mL)로 치료하십시오. 이리노테칸, 100 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 또는 FOLFOX(5-플루오루라실, 50 μg/mL; 옥산스립라틴, 10 μg/mL; 류코보린, 25 μg/mL) 화학요법 요법 조합은 CRC 환자를 치료하기 위해 일상적으로 사용된다22,23,24,25,또는 (대조) 치료되지 않은 (NT) 조건에서 유지.</li>
		<li>팁 이 끊기(1,000 μL 팁)가 있는 파이펫을 사용하여 처리 3일 후에 스페로이드를 수집하여 각 조건이 적어도 3개의 복제로 표현되도록 합니다. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다.</li>
		<li>조직학적 분석을 위해 2% 파라포름알데히드(PFA)로 펠릿을 고정하거나 RNA 추출을 위해 펠릿을 사용한다(섹션 4 참조).</li>
		<li>세포사멸을 분석하기 위해, DMEM/지하막 매트릭스 배지에서 흑배양웰 플레이트에서 1.6.1단계로부터 스페로이드를 30분 동안 배양하여 살아있는 세포에 침투하지 않는 핵산 얼룩(1:5000 희석)을 가지고, 그러나 죽은 세포의 손상된막(26)을관통한다. 마이크로 플레이트 판독기와 형광의 축적을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 스페로이드 성장 모니터링
<ol><li>반전 된 현미경을 사용하여, 문화에서 일 내내 다른 조건하에서 유지 되는 스페로이드의 대표적인 이미지를 취득.</li>
	<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 각 스페로이드의 3가지 대표 직경을 측정하여 이미지를 분석합니다.</li>
	<li>다음 수식을 사용하여 예상 구 체적을 가져옵니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61783/61783eq1.jpg"> 참고: 용어, d1, d2 및 d3는 스페로이드의 세 가지 직경입니다.</li>
</ol>3. 면역 형광 (IF) 및 조직학적 염색
<ol><li>고정 및 파라핀 포함<ol>
<li>1.6.2 단계에서 설명한 바와 같이 팁이 잘린 파이펫을 사용하여 선택한 시간 지점에서 스페로이드를 수집하고 2% PFA에서 RT에서 30분 동안 수정합니다. 참고: 또는 추가 사용이 될 때까지 이 단계에서 샘플을 4°C로 저장합니다.</li>
		<li>파라핀 포함의 경우 PBS 1x로 스페로이드 3배를 세척하고 70% 에탄올로 재보선다. 파라핀 포함 및 단면 후 조직학적 분석을 위해 헤마톡시린 및 에오신(H&amp;E) 염색을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 섹션의 면역 라벨링 참고: 간접 면역 염색을 위해 5μm 두께의 섹션을 사용합니다.<ol>
<li>왁스를 녹이고 분리화를 개선하기 위해 2 시간 동안 60 °C에서 슬라이드를 인큐베이션합니다.</li>
		<li>메틸시클로헥산에서 슬라이드를 3분 동안 두 번 씻으십시오.</li>
		<li>슬라이드를 1:1 메틸시클로헥산:100% 에탄올로 3분 간 세척합니다.</li>
		<li>슬라이드를 100% 에탄올로 3분 동안 두 번 씻으십시오. 참고: 3.2.2 단계의 모든 조작을 수행하여 화학 후드에서 3.2.4 단계를 수행합니다.</li>
		<li>슬라이드를 90% 에탄올로 3분 동안 씻으십시오.</li>
		<li>75%의 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 세척합니다.</li>
		<li>50% 에탄올로 슬라이드를 3분 동안 씻으십시오.</li>
		<li>수돗물 아래에서 슬라이드를 씻으십시오.</li>
		<li>5 분 동안 증류수에 슬라이드를 다시 수분.</li>
		<li>0.01 M 구연산 버퍼, pH 6.0의 700 mL을 준비하고 적합한 용기에 추가하십시오 (너비 : 11.5 cm, 길이 : 17cm, 높이 : 7cm); 슬라이드를 잠급합니다. 전자레인지에 있는 용기를 700W에서 9-10분 동안 가열하고 끓이기 시작하면 400-450W. 인큐베이터의 전력을 추가로 10분 간 감소시다.</li>
		<li>약 30-40분 동안 버퍼에서 슬라이드를 RT로 식힙니다.</li>
		<li>5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 두 번 씻으십시오.</li>
		<li>마커 펜으로 섹션 주위에 원을 그리면 섹션에 적용된 액체에 대한 장벽을 만듭니다.</li>
		<li>각 섹션에 50 μL의 블로킹 버퍼(일반 염소 세럼 10%, 소 세럼 알부민 1%, PBS의 0.02% Triton X-100)를 RT에서 최소 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>차단 버퍼를 제거하고 인큐베이션 버퍼에서 희석된 1차 항체의 50 μL을 추가합니다(일반 염소 혈청 1%, BSA 0.1%, PBS에서 0.02% 트리톤 X-100). RT에서 2 시간 동안 또는 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
		<li>1 차적인 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드3x를 5 분 동안 세척하십시오.</li>
		<li>RT에서 1h에 대한 인큐베이션 버퍼에서 희석된 형광 이차 항체의 50 μL로 슬라이드를 배양한다.</li>
		<li>이차 항체를 제거하고 PBS에서 슬라이드를 3x로 5 분 동안 세척하십시오.</li>
		<li>각 섹션에 4′,6-diamidino-2-phenylindole와 장착 매체의 50 μL을 추가하고, 섹션 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. RNA 추출, 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR), 및 정량성 RT-PCR(qRT-PCR)
<ol><li>다른 시간 지점에서 스페로이드를 수집, 각 점은 적어도 세 복제로 표현. 원심 분리는 3 분 동안 1,000 × g로 한 다음 상체를 제거합니다. 참고: 펠릿은 RNA 추출에 직접 사용하거나 추가 사용이 있을 때까지 -20°C에 저장될 수 있습니다.</li>
	<li>제조 업체의 지침에 따라 상용 RNA 격리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 각 RNA 샘플의 500 ng를 보완 DNA (cDNA)로 역 전사합니다.</li>
	<li>역전사 후, 다른 엑슨에 있는 프라이머로 가사 유전자를 증폭시키기 위해 cDNA의 1 μL에 PCR 분석을 수행합니다. 참고: 이 단계는 RNA 제제에 있는 어떤 유전체 DNA 오염의 부재의 확인을 가능하게 합니다. 이 프로토콜을 위해 펩디딜프로릴 이솜라제B(PPIB) 프라이머가 사용되었다.</li>
	<li>관심 유전자에 특정 프라이머를 사용하여 이전에 희석 된 cDNA (RNAse 프리 이중 증류수에서 1:10)의 4 μL에 qPCR 증폭을 수행합니다. 각 샘플에서, ΔΔCt 방법을 사용하여 특정 mRNA 발현을 정량화하고 가사 유전자 수준에 대해 정규화된 값을 한다. 참고: 이 프로토콜의 경우 β액틴(ACTB)이 선택되었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 프라이머는 표 3에나열됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

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체외 3D 모델은 2D 암 세포 배양의 주요 실험적 단점을 극복, 그들은 미세 환경 과 세포 이질성을 포함한 전형적인 종양 기능을 다시 항복에 더 신뢰할 것으로 보인다. 일반적으로 사용되는 3D 스푸로이드 모델은 스캐폴드가 없는(저부착 조건에서 배양됨) 또는 스캐폴드 기반(생체 물질을 배양 세포에 사용)이다. 이러한 방법은 사용되는 비계의 특성에 의존하거나 구조와 크기가 가변적인 스페로이드를 발생시키기 때문에 서로 다른 단점을 제시합니다.
본 프로토콜은 스캐폴드 프리 방법을 이용하여 대장 아데노카르시노종 세포주, Caco2로부터 균질성 스페로이드를 생산하기 위한 조건을 최적화한 것으로 보고한다. 스페로이드는 쉽게 수확되고 이전에 보고된연구(41)와반대로, 성공적으로 성장하고 문화권 에 있는 시간 동안 그들의 성장 특성도 분석될 수 있다. 더욱이, 이러한 새로운 방법을 통해, 스페로이드(a)가 활발히 증식되고, (b) 세포사멸의 매우 낮은...

대장암(CRC)은 세계1에서암 관련 사망의 두 번째 주요 원인으로 남아 있다. CRC의 발달은 종양 억제 유전자3,4의온코진 활성화 및 불활성화를 포함하는 유전 돌연변이 및/또는 후성유전학 적 변경2,3의점진적 습득 및 축적의 결과입니다. 더욱이, 비유전적 요인(예를 들어, 마이크로환경)은 종양성 변혁에 기여하고 촉진하여 CRC5의진화에 참여할 수 있다. 중요한 것은, CRC는 정상 결장 토굴6,7에서상피의 조직을 연상시키는 계층 구조를 구성하는 일부 분화 된 CSC 및 벌크 종양 세포를 포함한 상이한 세포 집단으로 구성된다.
CSC는 종양 출현8,유지 보수 및 성장, 전이성 용량 및 종래의 치료법에 대한 내성을 담당하는 것으로 간주됩니다6,7. 종양 내에서, CSC를 포함한 암세포는 그들의 명백한 돌연변이 및 후성 유전학 단면도, 형태학 및 표현성 다름, 유전자 발현, 물질 대사, 증식 비율 및 전이성 전위9의관점에서 이질성과 복잡성의 높은 수준을 표시합니다. 따라서, 암 생물학, 종양 진행, 효과적인 치료법으로의 내성 획득, 이 암 이질성 및 계층 구조를 포착하는 인간 전임상 모델은10,11에중요하다.
체외 2D 암 세포주에서 는 오랫동안 사용되어 왔으며 종양 발달과 치료 분자의 효능의 근간이 되는 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그러나, 본래 종양에서 발견되는 현상및 유전적 이질성의 부족에 대하여 그들의 한계는 지금 널리 인식된다12. 더욱이, 영양분, 산소, pH 그라데이션 및 종양 미세환경은 재현되지 않으며, 마이크로환경은CSC(11,12)를포함한 상이한 세포 유형의 유지에 특히 중요하다. 이러한 주요 단점을 극복하기 위해 여러 3D 모델이 실험적으로 암의 복잡성과 이질성을 해결하고 재현하기 위해 개발되었습니다. 실제로, 이들 모델은 생체 내12,13,14에서관찰된 것과 유사한 종양 세포 이질성, 세포 세포 상호 작용 및 공간아키텍처를재구성한다. 신선한 종양뿐만 아니라 세포 주 유래 스페로이드에서 확립된 1차 종양 오르가노이드는 주로15,16으로채용된다.
스페로이드는 세포가 세포 응집체에서 형성되고 성장하도록 강제하기 위해 비계가 없거나 스캐폴드 기반 방식으로 배양될 수 있다. 스캐폴드 프리 방법은 비부착 조건(예를 들어, 매달려 드롭 방법 또는 초저부착 플레이트)의 세포 배양에 기초한 반면, 스캐폴드 기반 모델은 천연, 합성 또는 하이브리드 생체 재료에 의존하여배양세포(12,13,14)에의존한다. 스캐폴드 계 스페로이드는 최종 스페로이드 형성이 사용되는 (바이오) 물질의 성질과 조성에 따라 달라지기 때문에 상이한 단점을 제시한다. 지금까지 사용할 수있는 스캐폴드프리 스페로이드 방법은 기판의 특성에 의존하지 않지만 구조및 크기17,18에따라 달라지는 스페로이드를 생성한다.
이 연구는 CSC 생물학을 공부하기 위하여 Caco2 결장 선암 세포로 구성된 크기에서 균질한 spheroids의 견고하고 재현가능한 3D 배양 시스템을 설계하는 것을 목표로 했습니다. Caco2 세포는 시간이 지남에 따라 분화 하는 그들의 능력에 때문에 특히 관심19,20,강하게 줄기 같은 잠재력을 제안. 이에 따라, 스페로이드의 장기 문화는 화학요법에 다른 반응을 가진 다른 CSC 인구의 존재를 밝혔습니다.

<table><tbody><tr><td>37 &마이크로; m 리버시블 스트레이너, 대형&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27250</td><td>50</td></tr><tr><td>Center Leon Berard (CLB) 약국의</td> <td>5-Fluorouracil</td> Gift와 함께 사용<td>-</td><td>스톡 용액, 5 mg/100 mL; 최종 농도, 50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell 400 24웰 플레이트</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34411</td><td>스페로이드 형성 및 성장을 위한 웰당 1,200 마이크로웰</td></tr><tr><td>Anti Caspase3 - Rabbit</td><td>Cell Signaling</td><td>9661</td><td>희석 1:200</td></tr><tr><td>Anti Musashi-1 (14H1) - Rat</td><td>eBioscience/Thermo Fisher</td><td>14-9896-82</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-Adherence 헹굼 용액 x 100 mL</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD133 (13A4) - Rat</td><td>Invitrogen</td><td>14-133-82</td><td>희석 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD44 -Rabbit</td><td>Abcam</td><td>ab157107</td><td>희석 1:2000</td></tr><tr><td>Anti-PCNA - Mouse</td><td>Dako</td><td>M0879</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-catenin - Mouse</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7963</td><td>희석 1:50</td></tr><tr><td>검정 멀티웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237108</td><td></td></tr><tr><td>Citric Acid Monohydrate</td><td>Sigma</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>CLARIOstar 장치&nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>Dako 펜</td><td></td><td></td><td>마커, 액체에 대한 장벽을 만들기 위해 슬라이드에 원을 표시하는 펜</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21202</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG (H + L) 2 차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10037</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>당나귀 항토끼 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10042</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide)</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>플루오로겔 장착 매체와 DAPI</td><td>Interchim</td><td>FP-DT094B</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-쥐 IgG (H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11077</td><td>희석 1:1000</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>스페로이드 이미지 분석</td></tr><tr><td>Irinotecan& 주의;</td><td>약학에서 선물 CLB</td><td></td> <td>재고 해결책, 20 mg/mL; 마지막 농도, 100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>iScript 역전사효소&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Leucovorin</td><td>Gift from Pharmacy CLB</td><td></td> <td>재고 용액, 50 mg/mL; 최종 농도, 25 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>Matrigel 기저 멤브레인 매트릭스</td><td>코닝</td><td>354234</td><td>기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>뉴클레오스핀 RNA XS 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740902 .250</td><td></td></tr><tr><td>Oxaliplatin</td><td>Gift from Pharmacy CLB</td> <td>재고</td> <td>용액, 100 mg/20 mL, 최종 농도, 10 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>SYBR qPCR 프리믹스 Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)</td><td>Takara</td><td>RR420B</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX- Green</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S7020</td><td>핵산 염색; 희석 1:5000</td></tr><tr><td>트립신-EDTA(0.05&nbsp;%)</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>25300062</tr><tr><td>Zeiss-Axiovert 현미경</td><td></td><td></td><td>스페로이드 이미지 획득을 위한 도립 현미경</td></tr></tbody></table>

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

A Three-dimensional Model of Spheroids to Study Colon Cancer Stem Cells

대장암은 종양 발달, 유지 보수 및 약물에 대한 내성을 담당하는 암 줄기세포(CSC)의 인구를 포함하는 이질성 및 계층적 조직을 특징으로 한다. 그들의 특정 표적을 위한 CSC 속성의 더 나은 이해는, 그러므로, 효과적인 치료를 위한 전제 조건입니다. 그러나 심층 조사에 적합한 전임상 모델이 부족합니다. 시험관 내 2차원 (2D) 암 세포주가 종양 생물학에 귀중한 통찰력을 제공하지만, 그들은 현상및 유전 종양 이질성을 복제하지 않습니다. 대조적으로, 3차원 (3D) 모형은 거의 생리적인 암 복잡성 및 세포 이질성을 해결하고 재현합니다. 이 작업의 목적은 CSC 생물학을 연구하기 위해 강력하고 재현 가능한 3D 문화 시스템을 설계하는 것이었습니다. 본 방법론은 장기 배양에 사용될 수 있는 모델인 Caco2 결장 아데노암종 세포로부터 동질적인 3D 스페로이드를 생성하는 조건의 개발 및 최적화를 설명합니다. 중요한 것은, 스페로이드 내에서, 루멘과 같은 구조물을 중심으로 조직된 세포는, 차동 세포 증식 패턴및 마커 패널을 표현하는 CSC의 존재에 의해 특징지어졌다. 이러한 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 세포 이질성 및 CSC 생물학을 연구하기 위한 이 3D 접근법의 적합성을 위한 첫 번째 개념 증명을 제공합니다.

스페로이드의 크기에서 균질성의 부재가 현재 사용 가능한 3D 스페로이드 배양시스템(13)의주요 단점 중 하나이기 때문에, 이 작업의 목적은 균일한 스페로이드를 얻기 위해 신뢰할 수 있고 재현 가능한 프로토콜을 설정하는 것이었습니다. 첫째, 이상적인 작업 조건을 확립하기 위해, 전용 플레이트(표 1)를 사용하여 마이크로웰/스페로이드당 50~2,000세포에 이르는 Caco2 세포의 상이한수(표 1)를시험하였다. 실제로, 이들 플레이트의 각 우물에는 1,200마이크로웰이 들어있어, 웰당 동일한 수의 스페로이드를 형성할 수 있으며, 더 중요한 것은마이크로웰(21)당하나의 스페로이드의 형성이다. 배양 이틀 후, 스페로이드 당 2,000세포를 함유하는 우물은 단층으로 성장했으며, 스페로이드당 50개의 세포가 작고 비균일한 스페로이드(도<strong class="xfi...

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

Colorectal cancers are characterized by heterogeneity and a hierarchical organization comprising a population of cancer stem cells (CSCs) responsible for ...

이러한 새로운 스페로이드 배양 방법은 암 줄기세포의 상이한 집단의 존재를 분석하기 위해 종양유발성을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 또한 신약에 대한 높은 퍼팅 스크린을 통해 잘 적용될 수 있다. 이것은 균일하게 크기의 스페로이드의 많은 수를 생성하기위한 강력하고 반복배양 시스템입니다. 더욱이, 이 스페로이드는 암 줄기 세포를 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.이 방법은 만성 암 생물학을 연구하기 위하여 설치됩니다 그러나 3D 배양 조건을 변경하여 그밖 암을 공부하기 위하여 쉽게 설치될 수 있습니다. 스페로이드 형성 중에 접시를 너무 많이 움직이지 말고 스페로이드를 스트레이너로 수확할 때주의하십시오. 잘 당 안티 준수 헹구는 용액의 500 마이크로 리터와 24 웰 플레이트의 우물을 미리 처리하여 시작합니다.몇 초 원심 분리 후 스윙 버킷 로터에서 플레이트를 헹구고 따뜻한 바질 매체 2 밀리리터로 각각 잘 헹구습니다. 현미경 아래의 플레이트를 관찰하여 마이크로 우물에서 거품이 완전히 제거되었는지 확인합니다. 거품이 관찰되지 않으면 각 우물에 따뜻한 DMEM 지하 막 매트릭스 배지의 1 밀리리터를 추가하기 전에 우물을 다시 헹구십시오.스페로이드 형성을 유도하기 위해, 10%FBS 및 1%항생제로 보충된 DMEM의 10센티미터 접시에서 2D 모노 층에서 Caco-2 세포의 원하는 농도를 참조하십시오. 가습 된 대기에서 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %의 문화. 80%의 합류에 도달하면 PBS5 밀리리터로 세포를 세척한 후 트립신-EDTA 2밀리리터로 배양을 섭씨 37도에서 2~5분 동안 치료합니다.세포가 분리되면 트립신을 완전한 DMEM의 4 밀리리터로 중화시다. 계산 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 잘 당 중간 의 1 밀리리터에서 세포의 원하는 농도를 달성하기 위해 DMEM 지하 막 매트릭스 매체의 적절한 부피에서 팔레트를 다시 중단. 선불 24 웰 플레이트의 각 웰에 세포의 1 밀리리터를 추가한 다음, DMEM 지하 막 매트릭스 배지의 1밀리리터를 각 웰에 첨가한다.파종 후 즉시 플레이트를 원심분리하고 가벼운 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 우물을 통해 균등하게 분포되었는지 확인합니다. 그런 다음 세포를 방해하지 않고 48 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다. 구문 류를 수확하려면, 잠복기의 끝에, 부드럽게 마이크로 우물에서 스페로이드를 제거하기 위해 각 우물에 세로지 피펫과 슈퍼 나탄의 절반을 사용합니다.모든 스페로이드가 분리되면 파이펫을 사용하여 3D 배양을 각 웰에서 15 밀리리터 원내 튜브 위에 37 미크로너 가역 스트레이너로 조심스럽게 전송합니다. 세척당 예온 된 기초 매체 1 밀리리터로 각각 세 번 씻고 나머지 스페로이드를 수집하고 스트레이너에 이러한 추가 스페로이드를 추가하십시오. 마지막 세척 후 현미경의 밑에 접시를 확인하여 모든 스페로이드가 마이크로 우물에서 제거되었는지 확인합니다.그런 다음 새로운 15 밀리리터 튜브를 통해 여과기를 반전하고 튜브에 스페로이드를 수집하기 위해 신선한 DMEM 지하 막 매트릭스 매체로 여과자의 바닥을 세척합니다. 스페로이드는 500 세포에서 상승하고 시간이 지남에 따라 크기가 가장 균일한 증가를 보여줍니다. 스페로이드 당 500 및 600 세포와 좋은 성장과 낮은 가변성을 달성 할 수있는 세포의 최적 수로 결정.지하 멤브레인 매트릭스의 첨가는 스페로이드 성장과 균질성을 향상시킵니다. 장기 배양에서 세포는 3일째에 조밀한 다층으로 나타납니다. 모노 층으로 배열된 평평한 셀은 10일째에 선명하게 보입니다.흥미롭게도, 루멘은 5 일째부터 스페로이드 안에 나타납니다. 또한, 세포 핵항균 양성세포의 명확한 증가는 10일째에 감소하는 5일과 7일에 관찰된다. 놀랍게도, 활성화된 Caspace 3는 3일과 5일에만 극소수의 세포에서 관찰된다.베타 카세닌 발현의 높은 수준은 매 지점에서 관찰됩니다. 안테로 사이트로 분화하는 스페로이드의 잠재력은 알칼리성 포스파타제와 솔루트 캐리어 가족 2A5 mRNA 발현에 의해 입증된다. 또한, 이러한 스페로이드는 전형적인 암 줄기세포 마커를 발현하고 대장암 환자에게 일상적으로 투여되는 조합 화학요법 치료에 반응한다.그래서 스페로이드는 다른 세포 집단으로 구성됩니다. 그(것)들은 그 때 굴절제와 같은 자극에 세포 특이적 반응을 분석하고 결국 약 반응을 위해 잘 이용될 수 있습니다.

a-three-dimensional-model-spheroids-to-study-colon-cancer-stem

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

이 방법은 스페로이드에서 주변 3D 매트릭스로의 암세포 침입을 평가합니다.  스페로이드는 행잉 드롭 배양 방법을 통해 생성된 다음 기저막 재료와 I형 콜라겐으로 구성된 매트릭스에 내장됩니다.  이후에 스페로이드 외부로의 침입이 모니터링됩니다.

암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해

광학 일관성 단층 촬영 (10 월), 3 차원 영상 기술, 모니터링 하 고 다세포 종양 spheroids의 성장 활동 특성 사용 되었다. 접근, 및 내장 광 감쇠 대비에 따라 spheroids에서 레이블 없는 죽은 조직 검출 복을 사용 하 여 종양 spheroids의 정확한 체적 정량화 시연 했다.

경도 형태 및 생리 적인 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하 여 3 차원 종양 Spheroids의 모니터링

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 프로토콜의 목표는 면역 형광, 전사와 같은 다른 분석 시스템에서 해결 될 수있는 종양 벌크와 같은 환경에서 암 관련 섬유 아세포 (CAFs)의 분화를 연구하는 3D 체외 모델을 확립하는 것입니다. 분석 및 생명 세포 화상 진찰.

3D 스페로이드 모델은 시험관 내 암 관련 섬유아세포 분화 및 침입을 위한 보다 생리적 시스템으로

종양 세포와 기질 섬유아세포의 이질적 상호작용에 기초한 새로운 3차원 스페로이드 모델이 확립된다. 여기에서, 우리는 spheroids의 대형을 구상하기 위하여 종양 세포 및 기질 섬유아세포, 시간 경과 화상 진찰 및 공초점 현미경 검사법의 공동 배양제시합니다. 이 3차원 모델은 종양-기질 상호 작용을 연구하고 암 치료제를 테스트하는 적절한 플랫폼을 제공합니다.

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.

3D 스페로이드 모델에서 암세포 침입의 시간 해결 형광 화상 진찰 및 분석

관련 인간 질병을 충실하게 재구성하는 포괄적인 체외 모델은 부족합니다. 현재 연구는 인간 간세포 암에서 종양 기질 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수있는 체외 도구인 3차원 (3D) 종양 스페로이드 생성 및 문화를 제시합니다.

간세포 암에서 종양-기질 상호 작용을 조사하는 3차원 스페로이드 모델

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

배우세요 Caco2 대장암 세포로 균일한 3차원 스페로이드를 배양하는 방법을. 이 기술은 암 줄기세포 생물학 연구와 항암제 반응 분석에 활용됩니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

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