바이오 제어 제품의 휘발성 및 비휘발성 항진균 활성 측정

이 프로토콜은 다양한 진균 성장 단계에서 휘발성 및 비휘발성 항진균 화합물의 상대적 효능을 정확하게 나란히 비교할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 다양한 분자를 포함하는 건조 또는 액체 형태로 사용되는 식물 유래 제품의 항진균 활성을 평가하는 데 매우 적합합니다. 이 방법은 식물 유래 제품의 적용 방식에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있으며 특히 생물 제어 분야에 적합합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 Sup'Biotech 실험실의 엔지니어 조교인 Valentina Gligorijevic입니다. 분생포자 채취의 경우, 트리코피마 균사체 배양액에 0.05%Tween 20 3밀리리터를 겹쳐 놓고, 균사체가 찢어지는 것을 방지하기 위해 균사체를 누르지 않도록 주의하면서 갈퀴를 사용하여 분생포자체에서 분생포자를 방출합니다. 분생포자가 모두 제거되면 마이크로피펫을 사용하여 빠르게 회복하고 분생포자 용액을 15ml 튜브에 추가하여 계수합니다.

곰팡이 플레이트를 준비하려면 PDA 배지가 들어있는 9cm 페트리 접시에 100 밀리리터 당 6 개의 포자 농도의 3 배 100 마이크로 리터의 포자를 증착하고 멸균 주걱을 사용하여 2 밀리미터 직경의 유리 구슬 10g을 플레이트에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들고 완전히 회전하여 한천 표면에 포자를 고르게 분포시킬 때까지 플레이트를 90도 세그먼트로 회전하고 회전합니다. 그런 다음 성장 억제 분석이 이루어질 때까지 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.

마늘 분말로 접촉 억제 분석을 수행하려면 멸균 주걱을 사용하여 원하는 마늘 분말의 양을 개별 50ml 튜브에 계량합니다. 일반적으로 밀리리터당 0.25에서 16밀리그램 범위의 농도를 얻습니다. 각 튜브에 약 섭씨 10도의 PDA 45ml를 넣고 각 튜브를 조심스럽게 여러 번 뒤집어 한천 전체에 분말을 고르게 분포시킵니다.

신속하게 균질화된 현탁액을 5cm 직경의 페트리 접시에 붓고 한천이 실온에서 응고되도록 합니다. 접촉 억제 분석을 수행하려면 5mm 직경의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하여 대조군 및 항진균 화합물 처리 접시의 한천 중앙에 원을 그리고 멸균 이쑤시개를 사용하여 한천 실린더를 폐기합니다. 다음으로, 새로운 5mm 직경의 스테인리스 스틸 튜브를 사용하여 곰팡이 플레이트에 15-20개의 원을 무작위로 플로팅하고 멸균 이쑤시개를 사용하여 포자, 균사 또는 균사체로 덮인 실린더를 PDA 플레이트의 빈 영역으로 조심스럽게 옮깁니다.

그런 다음 플레이트를 섭씨 30도의 인큐베이터에 다시 넣습니다. 증기상 항진균 억제 분석을 위한 플레이트를 준비하려면 항진균 화합물 또는 PDA 배지만 포함된 10밀리리터의 PDA 배지가 들어 있는 5cm 직경의 페트리 접시 뚜껑에 10밀리리터의 PDA 배지를 붓고 한천이 실온에서 응고되도록 합니다. 50ml 원심 튜브를 보정 도구로 사용하여 한천 중앙에 PDA 원을 만들고 멸균 주걱을 사용하여 원 주위의 한천을 제거합니다.

직경 5mm의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하여 뚜껑의 매체 중앙에 원을 그리고 멸균 이쑤시개를 사용하여 오거 실린더를 폐기합니다. 그런 다음 5mm 직경의 멸균 스테인리스 스틸 튜브를 사용하여 준비된 곰팡이 플레이트에 무작위로 플러그를 만들고 멸균 이쑤시개를 사용하여 포자, 균사 또는 균사체 코팅 플러그를 분석 플레이트의 뚜껑으로 조심스럽게 옮깁니다. 이 분석에서는 3가지 항진균 화합물에 의해 유발되는 트리코피마 종 SBT 10-2018 성장 억제를 각 진균 단계에 대해 입증된 접촉 및 증기상 억제 분석을 사용하여 평가했습니다.

카벤다짐에 대한 더 높은 포자 민감도는 트리코피마와 항진균성 화합물이 접촉할 때 초기 균사 및 균사체 네트워크에 비해 관찰되었습니다. 대조적으로, 카벤도짐은 이 물질의 낮은 휘발성에 따라 곰팡이를 살균제에서 멀리 떨어진 곳에 두었을 때 트리코피마에 대한 항진균 효과가 없었습니다. thymus vulgaris 에센셜 오일을 항진균 화합물로 사용했을 때 0.025% 에센셜 오일에서 균사체 성장 억제에 비해 포자와 초기 균사에 대해 더 높은 민감도가 관찰되었습니다.

예상대로, thymus vulgaris 에센셜 오일은 곰팡이와 오일 사이의 거리에 관계없이 동일한 항진균 활성을 나타냈습니다. 마늘 분말을 사용했을 때, 균세포 성장보다 포자 발아와 조기 균사 신장에 대해 더 높은 효능이 관찰되었습니다. 비슷한 결과를 보장하기 위해 포자가 한천 플레이트 표면에 고르게 분포되어 있는지 확인하기 위해 곰팡이 플레이트를 준비하는 동안 특별한 주의를 기울여야 합니다.