액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptoglycomics는 고성능 생물정보학 데이터 분석과 결합된 고급 질량 분석법을 사용하여 펩티도글리칸 조성을 세밀하게 조사합니다. 생물정보학 알고리즘을 사용하면 데이터 파일 모음에서 질량 분석 데이터를 동시에 분석, 추출 및 비교할 수 있으므로 작업 부하를 줄이고 정확도를 높일 수 있습니다. 펩티도글리칸의 다양한 변형과 변형을 이해하는 것은 성장과 분열, 숙주 면역 회피, 항생제 내성을 포함한 세포 과정을 이해하는 데 의미가 있습니다.

먼저 샘플의 작은 하위 집합을 준비하고 분석하여 프로토콜에 익숙해지고 실험 매개변수를 평가하기 위한 파일럿 프로젝트 역할을 하는 것이 좋습니다. 질량 분석 데이터 분석 소프트웨어는 특징과 기능을 설명할 때 사용되는 정의가 다양해지는 경우가 많기 때문에 시각적 데모는 사용자가 플랫폼 전반에 걸쳐 이 프로토콜을 적용하는 데 도움이 됩니다. 펩티도글리칸 사큘리 추출의 경우, 20 밀리몰 인산나트륨에서 원래 배양 부피의 약 1-10에서 섭씨 4도에서 동결 세포 펠릿을 재현탁시킨 후 세포 현탁액을 20 밀리몰 인산나트륨에서 끓는 8% SDS에 적가하여 최종 1:1 부피에 추가합니다.

30분에서 3시간 동안 저어주면서 부드럽게 끓여서 막이 완전히 분리되도록 합니다. 생성된 혼합물은 남아 있는 세포 덩어리나 점도가 없이 완전히 투명해야 합니다. 용액이 실온으로 냉각되면 초원심분리로 sacculi를 수집한 다음 세척 버퍼가 비색 염료에 의해 결정된 약 0.001%의 SDS 농도를 가질 때까지 세척당 약 50ml의 실온 20밀리몰 인산나트륨에서 5-7회 세척합니다.

마지막 세척 후, 실온 20 밀리몰 인산나트륨 5-10 밀리리터에 주머니를 재현탁시키고 10 밀리몰 황산마그네슘에 50 밀리리터 당 아밀라아제, DNase 및 RNase를 샘플에 보충하여 섭씨 37도에서 교반 또는 넛테이션으로 1 시간 배양합니다. 배양이 끝나면 섭씨 37도에서 프로나제 밀리리터당 100마이크로그램으로 밤새 반응을 소화합니다. 울트라 원심분리 후 다음날 아침, 25ml의 2% SDS와 20밀리몰의 인산나트륨을 넣고 찜기에 샘플을 1시간 동안 끓입니다.

배양이 끝나면 시연된 대로 50ml의 실온 이중 증류수로 샘플을 5-7회 세척합니다. SDS 농도가 약 0.001%에 도달하면 펠릿을 충분한 양의 이중 증류수에 재현탁하여 sacculi 현탁액을 얻고 용기를 세척합니다. 영하 80도에서 하룻밤 동안 보관한 후, 냉동 시료를 동결 건조한 후 sacculi를 이중 증류수 농도 1밀리리터당 10mg의 펩티도글리칸으로 희석합니다.

LC-MS 분석의 경우 기기 소프트웨어에서 새 프로젝트를 시작하고 적절한 LC-MS QTOF 데이터 파일을 관심 있는 실험 조건에 할당합니다. 데이터 처리 마법사 배치 재귀 특징 추출을 실행하고 LC-MS 조건 및 기기의 매개변수와 일치하도록 데이터 처리 필터를 설정하여 개별 뮤로펩티드를 나타내는 질량 대 전하 피크를 정확하게 식별, 그룹화 및 검증합니다. 특징 추출이 끝날 때 결과를 검토합니다.

많은 수의 피처가 그룹에서 정렬되지 않은 경우 재귀 필터링 매개변수를 조정하여 필요에 따라 탐지 창을 확장하거나 제한합니다. 그런 다음 데이터를 복합 교환 파일로 내보냅니다. 미분 스펙트럼 특징 분석의 경우, 시스템 소프트웨어에서 새 프로젝트를 시작하고 데이터 가져오기에 대한 지침을 따릅니다.

데이터 분석 중에 차등 분석을 위한 유의성 및 폴드 변화를 선택하고 기준선 데이터를 모든 데이터 파일의 중앙값 강도로 설정합니다. 분석이 완료되면 결과 그래픽 및 통계 분석을 검사하여 테스트된 실험 조건 간에 상당한 존재량 변화를 보여주는 뮤로펩티드를 식별합니다. 프로젝트 탐색기에서 다양한 분석을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 내보내기 옵션을 선택하여 피처 세부 정보를 tsv 파일로 저장합니다.

모든 관련 데이터를 얻기 위해 여러 분석을 저장해야 합니다. 차등 분석 소프트웨어 내의 결과 해석에서 ID 브라우저를 선택하고, 예상되는 뮤로펩타이드 구조 라이브러리를 추가하고, 특징 추출에 대해 입증된 것과 유사한 매개변수를 선택하여 식별된 각 특징에 대해 예측된 뮤로펩타이드 주석을 생성합니다. 예측된 뮤로펩타이드 주석을 수동으로 확인하려면 탠덤 질량 분석 크로마토그램의 질량 대 전하 비율 피크를 알려진 뮤로펩타이드 구조의 가능한 모든 단편화의 예측된 질량 대 전하 비율과 비교합니다.

분자 편집기를 사용하여 질량 단편화 도구를 사용하여 예측된 뮤로펩타이드 구조를 그려서 각 결합이 개별적으로 또는 조합으로 끊어질 때 질량 분광법 단편의 질량 대 전하 비율을 표시한 다음 뮤로펩타이드 구조의 가능한 모든 단편화를 탠덤 질량 분석 크로마토그램과 비교합니다. 뮤로펩타이드 주석을 확인하려면 여러 단편의 질량 대 전하 비율 피크를 매우 최소한의 질량 대 전하 비율 정렬 창으로 탠덤 질량 분석 크로마토그램에서 찾아야 합니다. 뮤로펩타이드 변형의 전반적 변화를 평가하려면 통계적으로 유의한 고폴드 변화 뮤로펩티드의 tsv 파일을 편집하여 각 뮤로펩타이드 변형에 대해 단일 열을 포함시킵니다.

주석이 추가된 각 뮤로펩타이드에 대한 지정으로 이 열을 채우고 수정된 tsv 파일을 Perseus에 업로드합니다. 행 주석 달기(annotate rows)에서 행에 categorically annotate rows(행에 범주 주석 달기)를 클릭하고 각 실험 매개변수에 데이터 파일을 추가합니다. 그런 다음 테스트에서 두 개의 샘플 테스트를 클릭하여 학생의 T 테스트를 수행하고 1D를 클릭하여 1D 주석을 수행합니다.

고출력 피크 인식 소프트웨어와 결합된 질량 분석 기계의 검출 감도가 향상되어 복잡한 샘플의 물질 조성을 매우 세밀하게 분리, 모니터링 및 분석하는 기능이 향상되었습니다. 질량 분석 데이터에서 추출된 각 질량 대 전하 피크를 특정 뮤로펩타이드와 연관시키는 것은 알려지고 예측된 뮤로펩타이드 구조의 데이터베이스와의 상호 참조를 통해 촉진됩니다. 추출된 각 특징에 대한 단편화 탠덤 질량 분석 크로마토그램은 데이터베이스를 사용하여 제안된 뮤로펩타이드의 단편화 프로파일과 비교할 수 있습니다.

화산 플롯은 테스트된 조건 사이에서 통계적으로 유의미한 높은 규모의 존재도 변화를 보여주는 뮤로펩티드를 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 함께 검사할 때, 동일한 변형을 갖는 여러 뮤로펩티드를 하나의 실험 조건에 대한 경향에 대해 검사할 수 있으며 전체 그룹의 유의성을 평가할 수 있습니다. 이러한 방식으로 뮤로펩티드 변형을 추적하면 실험 파라미터의 영향을 받는 특정 효소 활성을 식별할 수 있습니다.

또한, 이러한 경향의 이상치는 특정 특이성 또는 생물학적 기능을 가진 효소 활성을 나타낼 수 있습니다. 이 절차는 폴리머의 생화학적 변화와 생물학적 변이를 검사하여 생체 내 PG에 작용하는 효소 활성에 대한 통찰력을 제공합니다. 세부 사항을 검증하기 위해 PG 구성을 검사하는 것은 많은 중요한 생리학적 과정에 영향을 미치는 복잡한 세포 구조를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.