다운스트림 면역 염색 분석을 위한 마우스 반전상피 주기의 특정 단계의 경유-보조 해부

이 방법은 단계별 정액관 분절의 식별 및 해부를 용이하게 하여 정자 형성의 매우 구체적인 단계를 연구할 수 있습니다. 정액 상피 주기의 단계는 고정되지 않은 새로운 세뇨관에서 인식할 수 있으므로 다운스트림 분석을 위해 관심 단계만 선택할 수 있습니다. 투과 조명 패턴을 기반으로 스테이지를 인식하는 방법을 배우려면 약간의 연습이 필요하지만 이 프로토콜은 성공을 보장해야 합니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Opeyemi Olotu입니다. 최소 8주 된 성인 수컷 쥐를 누운 자세로 놓고 70% 에탄올로 복부 복부를 소독하는 것으로 시작합니다. 멸균 가위를 사용하여 복부 골반 부위를 V자 모양으로 절개하고 멸균 집게를 사용하여 부고환 지방 패드를 당겨 고환을 찾습니다.

가위를 사용하여 고환을 해부하고 조직을 PBS가 있는 멸균 100mm 페트리 접시에 넣어 채취합니다. 끝이 가는 가위를 사용하여 고환을 감싸고 있는 두꺼운 섬유질 시트인 튜니카 알부기니아의 슬릿을 자르고 집게를 사용하여 튜니카를 찢고 세뇨관을 강제로 빼냅니다. 캡슐화된 세세관을 새 페트리 접시에 넣고 접시 바닥을 덮을 만큼 충분한 멸균 PBS를 추가합니다.

그런 다음 집게를 사용하여 조직을 손상시키지 않고 세뇨관을 부드럽게 잡아당깁니다. 세뇨관을 해부하려면 접시를 해부 현미경 스테이지에 테이프로 붙이고 투과조명을 켭니다. 가는 집게를 사용하여 세뇨관 다발을 조심스럽게 움직여 여러 단계의 빛 흡수 및 산란 패턴에 익숙해집니다.

그런 다음 끝이 구부러진 집게를 사용하여 관심 세뇨관을 들어 올리고 현저부 가위를 사용하여 적절한 길이의 세그먼트를 자릅니다. 스테이지 특이적 세뇨관 세그먼트를 절단한 후 피펫을 사용하여 10마이크로리터 부피의 PBS에서 관심 세그먼트를 수집하고 세그먼트를 현미경 슬라이드에 놓습니다. 세포를 너무 많이 찌그러뜨리지 않고 20 x 20mm 커버 유리를 세뇨관에 조심스럽게 누르고 슬라이드를 위상차 현미경의 스테이지에 놓습니다.

커버 유리의 가장자리에 여과지를 놓아 세포가 단층으로 쉽게 퍼질 수 있도록 하고 40배 대물렌즈를 사용하여 세포 단계를 확인합니다. 세포가 세뇨관의 양쪽 끝에서 둥근 단층을 형성하면 슬라이드를 액체 질소 용기에 10초 동안 담급니다. 메스를 사용하여 셀에서 커버 유리를 뒤집고 즉시 슬라이드를 90% 에탄올에 2-5분 동안 놓습니다.

그런 다음 슬라이드를 자연 건조하고 최대 며칠 동안 실온에서 보관하십시오. 정액세뇨관의 전체 마운트 면역 염색을 위해 피펫을 사용하여 관심 세그먼트를 얼음 위의 얼음처럼 차가운 PBS의 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 세그먼트가 침전되도록 한 후 PBS를 조심스럽게 제거합니다.

얼음처럼 차가운 신선한 PBS 10ml를 넣고 반전으로 섞습니다. 시연된 바와 같이 상층액을 다시 제거하기 전에 세뇨관이 몇 분 동안 안정되도록 합니다. 상등액이 모두 제거되면 섭씨 4도에서 분당 20-30회 회전하면서 5시간 동안 파라포름알데히드 5ml에 세뇨관을 고정합니다.

배양이 끝나면 세뇨관이 몇 분 동안 가라앉을 때까지 기다렸다가 섭씨 4도의 신선한 PBS에서 10분 동안 회전하면서 세척할 때마다 샘플을 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 1ml 피펫을 사용하여 10-20개의 고정 세뇨관 세그먼트를 2ml 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 세그먼트가 침전되면 상층액을 PBSX에서 1ml의 2%BSA 및 10%FBS로 교체하여 실온에서 1시간 배양 및 분당 20-30회 회전합니다.

차단 배양이 끝나면 1ml의 PBSX로 샘플을 세척합니다. 250마이크로리터의 1차 항체로 세뇨관을 라벨링하기 전에 PBSX의 1%BSA로 2시간 동안 실온에서 분당 20-30회전으로 희석합니다. 배양이 끝나면 시연된 대로 PBSX에서 세뇨관을 세 번 세척한 후 실온에서 분당 20-30회전으로 빛으로부터 보호된 250마이크로리터의 적절한 2차 항체로 샘플을 1시간 동안 라벨링합니다.

배양이 끝나면 세뇨관을 세 번 세척한 후 세뇨관을 소량의 상층액에 담긴 현미경 슬라이드에 디캔팅합니다. 그런 다음 겔 로딩 팁을 사용하여 세뇨관을 선형 스트립으로 배열하고 초과 버퍼를 배출합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 슬라이드를 장착하기 전에 장착 매체 1-2방울을 추가합니다.

투과 조명에서 7단계부터 8단계는 상피의 정점 표면에 정렬된 완전히 응축된 신장 정자를 많이 포함하고 있기 때문에 균일하게 어둡게 보입니다. 성숙한 정자가 정자 형성 중에 내강으로 방출된 후, 세뇨관은 상피 내에 응축된 신장 정자가 없기 때문에 9단계에서 10단계에서 매우 창백하게 보입니다. 이 창백한 영역 다음에는 약한 반점 영역이 있으며, 그 얼룩덜룩한 모양은 다발에 응축된 염색질을 가진 길쭉한 정자류의 조직에서 비롯됩니다.

이러한 다발은 후속 강점 스폿 영역에서 매우 두드러집니다. 정자 다발은 기저 층판에 가까운 Sertoli 세포핵으로 이동하며, 이는 투과 조명될 때 2-5단계 세뇨관의 줄무늬 모양으로 반영됩니다. 다발은 6단계에서 최종적으로 분산되고, 응축된 신장형 정자는 내강에 가깝게 이동하여 8단계에서 상피에서 방출됩니다.

세뇨관 분절의 정확한 단계는 스쿼시 제제의 위상차 현미경으로 정확하게 확인할 수 있습니다. 단계적 스쿼시 제제의 면역염색은 정액 상피에서 관심 단백질의 발현 및 국소화를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 세미페리우스 세뇨관 전체 마운트 염색은 일반적으로 세뇨관 또는 간질 측에서 정질 상피의 기저막과 접촉하는 세포 유형을 연구하는 데 사용됩니다.

이 방법은 또한 혈액 고환 장벽 또는 감수 분열 후 생식 세포와 같이 상피 내 더 깊은 곳에 위치한 세포 또는 구조를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 면역염색 외에도 생화학적 RNA 및 단백질 분석, 유세포 분석 및 체외 난관 배양을 포함한 다른 많은 다운스트림 분석에 병기 난관 세그먼트를 사용할 수 있습니다. 이 방법은 정자 형성에 대한 매우 상세한 분석을 가능하게 하기 때문에 정자 생산과 남성 생식력에 필요한 모든 중요한 과정을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.