급성 골수성 백혈병의 대량 하위 집단으로부터 줄기 세포를 구별하기 위해 NKG2D 리간드 표면 검출의 두 개의 흐름 세포 측정 접근법
2021년 2월 21일
우리는 인간 1 차급성 골수성 백혈병 (AML) 견본에 있는 NKG2D 리간드 (NKG2DL) 검출을 위한 2개의 다른 염색 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째 접근법은 융합 단백질을 기반으로 하며, 알려진 모든 잠재적으로 알려지지 않은 리간드를 인식할 수 있으며, 두 번째 프로토콜은 다중 항 NKG2DL 항체의 첨가에 의존한다.
이 프로토콜은 AML 셀 표면에서 NKG2DL을 검출하는 두 가지 뚜렷한 방법을 보여줍니다. 이 기술은 알려진 NKG2DL을 모두 감지하는 빠르고 사용자 친화적인 염색 방법을 제공합니다. 이 방법은 대량 AML 세포에서 백혈병 줄기 세포의 분리를 허용, 이는 더 이러한 세포를 특성화 할 수 있도록.
비오틴과 NKG2D 융합 단백질 튜브를 실온에서 해동하는 것으로 시작합니다. NKG2D FC 파우더를 빠르게 스핀다운한 다음 500마이크로리터의 PBS를 추가하여 분말을 재구성하고 P-1000 마이크로파이프를 사용하여 철저히 혼합합니다. NKG2DL 융합 단백질 100마이크로리터를 비오틴 튜브에 추가하여 밀리리터당 10마이크로그램의 최종 농도를 얻고, P-100 마이크로파이프와 용액을 완전히 혼합합니다.
AML 세포를 해동하려면 액체 질소 저장에서 1 차 AML을 함유하는 극저온을 제거하고 즉시 섭씨 37도의 수조에 놓습니다. 튜브를 물 속앞뒤로 부드럽게 움직여 작은 얼음 결정만 남을 때까지 유리병의 내용물이 해동할 수 있도록 합니다. 해동된 세포를 튜브를 함유하는 배지로 즉시 옮기고 1밀리리터의 배지를 사용하여 바이알을 헹구십시오.
세포를 300배 G에서 10분 동안 원심분리하고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다. 10%FCS를 함유한 RPMI 배지 5밀리리터로 세포를 세척하고 원심분리를 반복합니다. 염색 버퍼로 세포 펠릿을 밀리리터당 7번째 세포에 0.5배 10배의 최종 농도로 재차판으로 재차판한다.
그런 다음 셀 현탁액의 100 마이크로리터를 세포 배양(96)에 잘 U-바닥 플레이트로 옮기고 10분 동안 300회 G로 플레이트를 원심분리한다. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오. 생체화 NKG2D 융합 단백질의 마스터 믹스를 준비하여 세포가 웰당 밀리리터 당 10 마이크로그램의 최종 NKG2D 농도로 잘 혼합된 50 마이크로리터의 최종 부피로 재장매됩니다.
준비된 마스터 믹스를 추가하고 200 마이크로리터 파이펫으로 셀 펠릿을 다시 처리합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 플레이트를 배양하고 원심분리합니다. 세포가 50 마이크로리터의 최종 부피에서 다시 중단되도록 스트렙타비딘 PE를 사용하여 마스터 믹스를 준비합니다.
마스터 믹스를 세포에 추가하고 300 마이크로리터 멀티채널 파이펫으로 펠릿을 다시 처리합니다. 플레이트를 원심분리하고 상체를 폐기한 후, 300 마이크로리터 멀티 채널 마이크로파이프를 사용하여 염색 버퍼 200 마이크로리터와 7-AAD의 세포 펠릿을 재보페한다. 그런 다음 유동 세포측정 장치를 사용하여 세포를 분석합니다.
분석된 AML 샘플은 CD34 및 NKG2DL에 대해 양수이지만 부정적인 하위 집단도 존재하며 총 4개의 서로 다른 집단이 있습니다. 일반적인 게이팅 전략은 FSC 및 SSC를 통해 세포의 주요 인구의 선택으로 시작합니다. 이중 및 죽은 세포는 다운스트림 분석에서 제외됩니다.
게이트는 FMO 컨트롤을 사용하여 조정되어 양수 셀을 적절하게 식별할 수 있습니다. NKG2DL 대 CD34에 대해 양성 세포의 형광 강도가 여기에 강조된다. CD34에 대해 양성인 AML 세포는 NKG2DL의 낮은 표면 발현을 나타내며, 이는 NKG2DL 발현이 줄기 부족과 연관되어 있음을 나타낸다.
3개의 1차 AML 샘플은 풀링된 항NKG2DL 항체 염색에 대해 융합 단백질 염색에 대한 19.8, 49.8 및 89.4%의 양성 발생을 입증하였다. 한편, 단일 리간드 염색은 리간드에 따라 백분율이 달라진 92%까지 다양한 긍정적인 이벤트를 보였다. 이 방법을 시도할 때, 1차 AML 세포를 해동할 때, 깨지기 쉽고 이 단계에서 쉽게 죽을 수 있기 때문에 빠를 것이 매우 중요합니다.
이 프로토콜을 수행한 후 NKG2DL 신호를 기반으로 하는 셀 정렬을 수행하여 인구를 더 자세히 조사할 수 있다.
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개요
본 프로토콜은 인간 일차 급성 골수성 백혈병(AML) 샘플에서 NKG2D 리간드(NKG2DLs)를 검출하기 위한 두 가지 서로 다른 염색 방법을 제시합니다. 이 기술들을 통해 전체 AML 세포로부터 백혈병 줄기세포를 분리하여 추가적인 특성 분석을 수행할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포생물학
- 종양학
배경
- NKG2D 리간드는 암의 면역 인식에 있어 중요합니다.
- 급성 골수성 백혈병(AML)은 세포 특성 분석에 어려움이 있습니다.
- 현재의 방법으로는 백혈병 줄기세포를 효과적으로 구별하지 못할 수 있습니다.
- 새로운 염색 프로토콜을 통해 검출 능력을 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- NKG2DL 검출을 위한 효율적인 염색 프로토콜을 개발하기 위함입니다.
- 전체 AML 세포로부터 백혈병 줄기세포의 분리를 용이하게 하기 위함입니다.
- AML 샘플의 특성 분석을 개선하기 위함입니다.
사용된 방법
- NKG2DLs를 인식하기 위한 융합 단백질의 활용.
- 다양한 anti-NKG2DL 항체의 적용.
- 비오틴 및 NKG2D 융합 단백질의 해동 및 재구성.
- 염색에 필요한 목표 농도를 맞추기 위한 용액 혼합.
주요 결과
- 두 프로토콜 모두 알려진 및 알려지지 않은 NKG2DL을 효과적으로 검출합니다.
- 벌크 AML 세포로부터 백혈병 줄기세포의 분리가 가능합니다.
- 해당 방법들은 사용자 친화적이며 신속합니다.
- AML 세포에 대한 더욱 정밀한 특성 분석이 가능합니다.
결론
- 새로운 염색 프로토콜을 통해 NKG2DL의 검출 능력을 향상시켰습니다.
- 이 방법들은 AML 생물학에 대한 이해를 돕는 데 기여할 수 있습니다.
- 추가 연구를 통해 이러한 기술을 기반으로 치료적 통찰력을 얻을 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
백혈병 줄기세포를 전체 AML 집단과 구별하는 것은 표적 검증 및 전임상 모델 개발에 있어 여전히 중요한 과제입니다. 줄기세포 특성을 가진 NKG2DL-음성 하위 집단을 분리하는 능력은 치료 가설의 기전적 위험을 완화하고 초기 발견 워크플로의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 이러한 접근 방식은 종양 형성 능력이 더 높은 질병 관련 시스템을 식별함으로써 포트폴리오 분류 결정에 직접적인 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: NKG2DL 표면 발현을 기반으로 백혈병 줄기세포를 분리함으로써 치료 가설에 대한 조사를 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 분화된 AML 세포와 줄기세포 유사 아집단을 구분하는 신속하고 사용자 친화적인 방법을 제공합니다.
- 과학적 가치: NKG2DL 음성 분획에서 줄기세포 특성의 기능적 검증을 통해 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 리간드 특이적 및 범리간드 염색 접근 방식에 따른 NKG2DL 발현을 비교하기 위한 정량적 유세포 분석 판독값을 생성합니다.
- 운영적 가치: 고처리량 스크리닝 준비에 적합한 재현 가능하고 표준화된 염색 프로토콜을 제공합니다.
- 과학적 가치: 후속 화합물 스크리닝 및 표적 결합 연구를 위해 검증된 생물학적 시스템의 준비를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: LSC의 면역 회피 기전과 NKG2DL 억제의 연관성을 밝힘으로써 중개 바이오마커 정렬을 용이하게 합니다.
- 운영적 가치: 질환 개시 세포의 분리가 가능하게 하여, 발견 단계부터 전임상 검증 단계까지의 연속성을 지원합니다.
- 과학적 가치: NKG2DL 상태를 이용하여 종양 형성 잠재력이 서로 다른 AML 하위 집단을 층화함으로써 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 기전적으로 정의된 하위 집단의 분리를 가능하게 함으로써, 타겟 검증부터 리드 화합물 발굴 및 전임상 평가에 이르는 발견 연속체에 통합됩니다.
- 발견 생물학: NKG2DL 음성 LSC를 NKG2DL 양성 벌크 AML 세포와 분리함으로써 가설 검증 및 경로 명확화를 지원합니다.
- 스크리닝: 유세포 분석 기반 스크리닝 플랫폼과 호환되는 표준화된 정량적 표면 검출을 통해 분석 준비 상태를 제공합니다.
- 분석학: 정량적 종속 변수 측정(양성 이벤트 백분율, 형광 강도)을 제공하여 염색 방법 및 하위 집단 빈도의 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 질병 관련 모델에서 기능적 검증을 위한 LSC 분리를 가능하게 함으로써 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업적 재사용: AML 샘플 전반에 적용 가능하며 유사한 면역 회피 기전을 가진 다른 암 유형으로 확장 가능한 줄기세포 농축 재사용 역량을 구축합니다.
운영 및 기업적 영향
- 과학적 가치: 줄기세포 농축에 대한 예측 신뢰도 향상, LSC 식별의 기전적 모호성 감소.
- 운영적 가치: 다수의 AML 샘플에서 NKG2DL 검출의 표준화, 재현성 및 확장성 확보.
- 전략적 가치: 타겟 검증 시 go/no-go 결정 개선, 조기 위험 제거를 통한 자본 효율성 증대, 후기 단계의 생물학적 리스크 감소.
- 포트폴리오 영향: LSC 농축 잠재력 및 면역 회피 표현형에 기반한 타겟의 위험 조정 우선순위 지정.
실행 시 고려 사항
- 유세포 분석, 세포 염색 및 1차 AML 샘플 처리 전문 지식이 필요합니다.
- 유세포 분석기, 원심분리 장비 및 biotin, NKG2D 융합 단백질, streptavidin PE, 7-AAD를 포함한 시약에 대한 접근 권한이 필요합니다.
- 일관된 결과를 위해 게이팅 전략, FMO 대조군 및 보정 설정의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- NKG2DL 발현 패턴의 가변성으로 인해 서로 다른 모델 시스템에 적용할 때 적응 고려 사항이 필요합니다.
- 실제적인 제약 사항으로는 해동 과정 중 1차 AML 세포의 취약성이 있으며, 생존율 유지를 위해 신속한 처리가 필요합니다.
