Name: 장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 배우세요 쥐 장내 융모 상피에서 3D 오르가노이드를 배양하는 긁기 분리법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 재분화 세포의 줄기세포 마커 획득과 장 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 간행물은 NIH 국립 암 연구소에서 상 번호 K22 CA218462-03에 의해 지원되었다. R-Spondin1을 표현하는 HEK293-T 세포는 마이클 P. 베르지 박사의 관대한 선물이었습니다.

자궁 경부 탈구에 의한 타목시펜과 안락사의 사용을 포함하여 수행 된 모든 마우스 실험은 스티븐스 에첸학 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 마우스
참고 : Smad4f / f의세대; 캐스롭록스 (ex3)/+; 빌린-CreERT2 마우스는 이전에3로기술되었다. 성인 여성 마우스 사이 8 받는 다열 한 주 사용 했다.
<ol><li>Smad4KO유도 :β 카테닌GOF 돌연변이를 Smad4f/f에서유도; 캐스롭록스 (ex3)/+; 빌린-CreERT2 와 천막 주입 옥수수 기름에 4 일 연속.</li>
	<li>첫 번째 타목시펜 주입 후 10 일 동안 마우스비 자궁 경부 탈구를 희생하십시오.</li>
	<li>마우스 털이 복막 구멍으로 들어가는 것을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 복부를 스프레이하십시오.</li>
	<li>해부 가위로 복강을 열어 내장을 노출시다. 가위와 집게의 도움으로 내장을 분리한다. 참고 : 장 상피에서 β 카테닌 (Smad4KO;β-카테닌GOF)의 기능 돌연변이의 이득과 함께 Smad4의 수반적 손실은Smad4f / f를주입하여 달성되었다; 캐스롭록스 (ex3)/+; 빌린-CreERT2 마우스는 옥수수 기름에 있는 0.05 g 타목시펜/kg 체중으로 4일 연속 매일 마우스. 이 마우스는 제1 타목시펜 주입 후 10일 후에 수확되어 비차별화 된 빌리에서 줄기 세포 관련 마커를 표현하는 세포의 존재를 보장합니다.</li>
</ol>2. 십이지덴 고립과 준비
<ol><li>십이지장의 근위 절반을 해부한다.</li>
	<li>10mL 주사기로 5mL의 얼음-차가운 PBS로 십이지장들을 플러시하여 발광 함량을 제거합니다.</li>
	<li>각진 가위로 십이지장 위를 세로로 열고 15cm 페트리 플레이트에 듀오덴을 평평하게 놓고, 듀오덴의 루멘이 연산자(duodenum)의 루멘을 향합니다.</li>
</ol>3. 긁어내어 빌리 격리
<ol><li>스크레이핑을 시작하기 전에 70 μm 메쉬 스트레이너를 6웰 조직 배양 플레이트의 우물 중 하나에 놓습니다. 모든 우물을 1x PBS4mL로 채우고 6웰 조직 배양판을 얼음 위에 놓습니다(그림1).</li>
	<li>두 개의 현미경 유리 슬라이드를 사용하여 다음과 같이 담악을 긁어 : 하나는 십이지장 아래로 개최하고 다른 긁어(그림 1B1).<ol>
<li>점액을 제거하기 위해 피상적으로 두 번 십이지장의 발광 면을 긁어 두 번. 이 단계는 점액 층을 제거하지만 villi가 아닌 압력을 가하십시오.</li>
		<li>십이지장 두 번 긁어 내고, 3.1에서와 동일한 압력을 두 번 적용하여 슬라이드에서 수집하는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B2). 이것은 스테더없이 비방을 산출하기 위해 (작업자에 의해 경험적으로 결정되어야)최적 압력입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS가 포함된 1mL 이송 파이프를 사용하여 6웰 접시에 배치된 70μm 메쉬 스트레이너로 비방(3.2.2.2.단계에서 슬라이드에서 수집)을 전송합니다. 모든 긁힘(그림1B2)이지나면, 따라서 빌리가 수집된다.</li>
	<li>70 μm 여조기(3.3단계에서)에서 수집된 빌리를 차가운 PBS(~4mL/웰)가 함유된 6웰 접시에 일련의 우물을 통해 스트레이너(빌리 포함)를 이송하여 세척합니다. 이것은 느슨한 토굴을 제거하는 것입니다.</li>
	<li>p1000 pipet를 사용하여 PBS(~3mL)의 빌리 서스펜션을 70 μm 스트레이너에서 얼음 위에 새로운 15mL 튜브로 옮기습니다.</li>
	<li>0.1% BSA 코팅 된 무딘 끝 p200 파이프 팁을 사용하여 유리 슬라이드에 빌리 서스펜션의 50 μL 볼륨을 흡인하십시오. PBS 서스펜션에서 빌리의 농도를 결정하기 위해 4배 배율 아래 50 μL 액적에서 빌리수를 계산합니다. 예를 들어, 검사된 50 μL 서스펜션에 10개의 빌리가 있는 경우, 빌리 농도는 0.2 빌리/μL입니다. 또한 테더드 토굴의 부재를 확인할 시간입니다.</li>
	<li>BME-R1 매트릭스의 0.5 빌리/μL 농도로 플레이트에 필요한 빌리 서스펜션의 부피를 계산합니다. 100 μL을 추가하여 배관 오류와 villi의 순도를 보장하는 데 필요한 미세한 검사에 필요한 부피를 고려합니다. 주의: 점액을 제거하지만 빌리가 아닌 처음 두 긁힌 자국에 사용되는 압력은 후속 긁힘에서 사용되어야 하며, 그 동안 빌리가 방출됩니다. 빌리 릴리스가 처음 관찰된 후 두 개로 긁는 횟수를 제한합니다. 이 측정값은 테더드된 토굴로 비방이 방출되는 것을 방지합니다. 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 악의적 인 것을 현미경으로 평가하는 것이 필수적입니다.</li>
</ol>4. BME-R1 매트릭스에 빌리도금
<ol><li>0.1% BSA 코팅 p200 무딘 말단 파이펫 팁을 사용하여, BME-R1 매트릭스의 12.5 μL에서 잘 - 6 빌리의 밀도로 플레이트에 필요한 빌리의 부피 (단계 3.6에서) 마이크로 센심 심분리기 튜브로 전송. 이 시점에서 BSA 코팅 무딘 끝의 사용은 뾰족한 팁에 너무 큰 빌리가 팁의 측면에 붙어있는 것을 막거나 잃지 않고 흡인되도록합니다.</li>
	<li>냉장 원심분리기(4°C)에서 200 x g에서 2분 동안 빌리를 회전시키고 상퍼를 제거합니다.</li>
	<li>단계 4.2를 반복하여 잔류 PBS를 제거하고 라미나르 유동 후드 아래다음 단계로 진행합니다.</li>
	<li>얼음 위에 해동된 차가운 BME-R1의 필요에 따라 빌리 펠릿을 부드럽게 재차 놓습니다.</li>
	<li>p20 파이펫을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 빌리 12.5 μL/웰을 3D로 예온된 96웰 U-바닥 플레이트에 사용한다.</li>
	<li>BME-R1 매트릭스의 응고를 허용하기 위해 37°C에서 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 15분 동안 배양한다.</li>
	<li>사전 따뜻하게 된 ENR (표피 성장 인자 / Noggin / R-spondin1) 미디어의 125 μL / 웰추가: 고급 DMEM F-12 미디어, 1x 페니실린으로 보충: 스트렙토마이신, 10 mM HEPES, 글루타맥스, 50 ng/mL EGF, 100 ng/mL 노긴, 5% HEK293-T 세포에서 컨디셔닝 된 미디어 R-Spondin1, 1x N2, 1x B27, 1 mM N-acete 05.</li>
	<li>조직 배양인 인큐베이터에서 도금 된 빌리를 5% CO2로37°C로 유지하여 격일로 배지를 변경한다.</li>
	<li>빌리 유래 오르가노이드가 예상되는 초기 시점이 2일 후에 예상되기 때문에 오르가노이드가 도금 2일 전에 나타나는 우물을 버리십시오. 참고: 빌리 길이의 절반 이상인 모든 빌리는 하나의 빌루로 계산됩니다. 토굴 유래 오르가노이드와 달리, 빌리 유래 오르가노이드는 도금 후 24시간 이내에 예상되지 않습니다. 오르가노이드를 개시하는 빌리는 오르가노이드 형성 전에 어두워지고 축소되는 것처럼 보입니다. 따라서, 도금의 하루 이내에 개발 오르가노이드와 모든 우물은 그럴듯한 지하실 오염에서 파생 된 데의 타당성을 피하기 위해 폐기되어야한다. 조건부 미디어를 생성하는 데 사용되는 방법론은 요청 시 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Schwitalla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+tumorigenesis+initiated+by+dedifferentiation+and+acquisition+of+stem-cell-like+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties.</a> Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).</li>
<li>Perekatt, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD4+Suppresses+WNT-Driven+Dedifferentiation+and+Oncogenesis+in+the+Differentiated+Gut+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium.</a> Cancer Research. 78 (17), 4878-4890 (2018).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 비차별화 된 악성 상피의 자체 갱신 능력을 확인할 수 있습니다. 일반적인 장 상피는 토굴1에서줄기 세포의 존재때문에 3D로 배양 할 때 지하실에서 오르가노이드를 발생시키지만 빌리 컴파트먼트는 발생할 수 있습니다. 따라서, 3D 배양에서 배양된 탈분화된 빌리 상피로부터의 오르간구형 형성은 세포 운명 반전으로부터 줄기 세포 형성을 확인한다. 돌연변이 및/또는 부상으로 인한 장 상피에서 세포 운명 반전에 대한보고는2,3,9,10,11,12로증가하고 있다. 따라서, 이 방법은 비...

장 내 지하실은 빌리가 아니라, Matrigel 또는 BME-R1 매트릭스에서 배양 할 때 오르가노이드를 형성합니다. 이러한 오르가노이드는 생체 내 장 상피에 존재하는 다양한 분화 계보, 선조 및 줄기 세포의 존재로 인해 종종 "미니 창자"라고도 하는 자가 조직 구조입니다. 토굴에서 오르가노이드를 형성 할 수있는 잠재력은 줄기 세포1의존재에 기인한다. 반면에 장 내 빌리는 분화 된 세포로만 구성되므로 오르가노이드를 형성 할 수 없습니다. 그러나, 돌연변이2 또는 빌루스 상피의 비차별화를 허용하는 조건은 빌리2,3에서줄기 세포로 이어질 수 있다. 이 운명의 변화는 3D 매트릭스에서 차별화된 빌루스 상피를 도금하여 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 골라서 알루루스 에피테륨의 탈노보 줄기의 지표로서 확인할 수 있다. 따라서 이 절차의 중요한 측면은 토굴 오염이 없는지 확인하는 것입니다.
Smad4KO:β-카테닌GOF 조건부 돌연변이는 빌리에서 증식 및 줄기 세포 마커의 발현에 의해 표시된 장 상피에서 차별성을 유발하며, 그리고 결국 자궁 외토로 지칭되는 빌리에서 토굴과 같은 구조물의 형성이 이러한 분리된 빌리의 존재는 자궁 내 의 줄기 세포 마커의 발현(byvivo)과가구형 을 형성하는 돌연변이 빌리의 능력에 의해 결정되었다. en 도금 된 마트리겔3. 앞서 언급한 절차는 Smad4 KO:β-카테닌GOF 돌연변이 마우스에서 차별화된 장 상피의줄기를 확인하는 데 사용되는 방법론을 정교하게 설명합니다. 비방을 격리하기 위한 이 방법론의 주요 특징은 EDTA 킬레이션 방법4와는 반대로 장 루멘의 긁어내는 사용이었습니다. EDTA 킬레이션 방법과 달리 긁어내면 비방 격리는 기본 메센치메의 대부분을 유지하고 테더링 된 토굴없이 비방을 생성하도록 긁는 압력을 조정할 수 있습니다. 스크래핑의 압력은 작업자에게 주관적이기 때문에 스테인드 없이 비방을 산출하는 최적의 압력은 작업자에 의해 경험적으로 결정되어야 합니다. 이 절차의 중요한 측면은 BME-R1 매트릭스에서 도금 전후에 모두 villi의 현미경 검사에 의해 토굴 오염의 부재를 보장하는 것입니다.
장 내 빌리는 유리 슬라이드로 장 루멘을 긁어 내고 70 μm 필터에 배치하고 PBS로 세척하여 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 또는 토굴을 제거합니다. 방법은 지하실 오염을 방지하기 위해 다음과 같은 기준에 강조 : a) 빌리가 가장 긴 십이지장의 근위 절반을 수확 하도록, b) 사악한 항복 긁힌 자국의 수를 최소화하고, c) 6웰 접시에서 일련의 PBS를 통해 빌리를 함유하는 필터를 세척하고, d) BME-R1 매트릭스에서 도금 전후현미경 검사에 의한 토굴 오염의 부재를 확인한다. EDTA 킬레이션이 아닌 긁어내어 빌리 격리는, 빌루스 상피로부터 의유기 개시를 위해, 필요한 경우 틈새 신호5,6,7,8을제공할 수 있는 근본적인 메센치움의 완전한 손실을 방지한다.

<table><tbody><tr><td>고급 DMEM F-12 미디어</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzidine</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 U-바닥 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012932</td><td></td></tr><tr><td>ABC 키트</td><td>Vector Labs</td><td>&nbsp; PK4001</td><td></td></tr><tr><td>앵글 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-999</td><td></td></tr><tr><td>무동물 재조합 인간 EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(50X), 비타민 A 뺀</td><td>12587010</td><td></td><td>Gibco</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 프로테아제 무함유 분말</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 항체</td><td>BioLegend</td><td></td><td></td>1030001</tr><tr><td>Cdx2 항체</td><td>세포 신호</td><td>12306</td><td></td></tr><tr><td>옥수수 기름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70미크론 세포 여과기</td><td>생명 과학</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex 감소 성장 인자 기저막 추출물, 유형 R1</td><td>R& D</td><td>3433-005-R1</td><td></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-747</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-456-209</td><td></td></tr><tr><td>글루타맥스 (100X)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293-T 세포 RSPO-1 발현</td><td>선물 Michael Verzi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES 박사의 선물 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermoscientific</td><td>HG-4000-012</td><td></td></tr><tr><td>메시 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-201-431</td><td></td></tr><tr><td>Micrscope 유리 슬라이드</td><td>VWR</td><td>89218-844</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>p200 블런트 팁</td><td>VWR</td><td>46620-642</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>프리모신(50mg/mL)</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>Quality Biological Inc PBS(10X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>신호 희석제</td><td>세포 신호</td><td>8112L</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>시그마-알드리치</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 플레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-146-770</td><td></td></tr></tbody></table>

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3d 배양

3D Culturing of Organoids from the Intestinal Villi Epithelium Undergoing Dedifferentiation

장 상피에서 유기체의 clonogenicity는 그 안에 줄기 세포의 존재에 기인한다. 마우스 작은 장 상피는 지하실과 사악으로 구획된다 : 줄기와 증식 세포는 지하실에 국한된 반면, 사악한 상피는 분화 된 세포만 포함합니다. 따라서, 정상적인 장 지하실, 하지만 villi, 3D 문화권에서 오르가노이드를 초래할 수 있습니다. 여기에 설명된 절차는 줄기로 이끌어 내는 무관심을 겪고 있는 상피상에만 적용됩니다. 설명된 방법은 Smad4-loss-of-function:β-카테닌 게인-기능(Smad4KO:β-카테닌GOF)조건부 돌연변이 마우스를 사용한다. 돌연변이는 사순에서 줄기 세포를 분화하고 생성하는 장 빌리를 일으키는 원인이 됩니다. 비차별화를 겪고 있는 장 내 의 빌리는 유리 슬라이드를 사용하여 장에서 긁어 내고, 70 μm 스트레이너에 배치하고 BME-R1 매트릭스에서 도금하기 전에 느슨한 세포 나 토굴을 걸러 내어 오르노이드 형성 잠재력을 결정합니다. 두 가지 주요 기준은 생성된 오르가노이드가 암호가 아닌 분산 된 빌루스 구획에서 개발되었는지 확인하는 데 사용되었습니다 : 1) 3D 매트릭스에서 도금 전후의 테더드 토굴의 부재를 보장하기 위해 고립 된 비방을 현미경으로 평가하고, 2) 빌리에서 오르가노이드 개발 과정을 모니터링. 빌리에서 유기성 개시는 도금 후 2 ~ 5 일 만 발생하고 불규칙한 모양으로 나타납니다, 같은 장 상피에서 crypt 유래 오르가노이드는 도금의 16 시간 이내에 명백하고 구형 나타납니다. 그러나 이 방법의 한계는 형성된 오르가노이드의 수와 비리로부터의 오르가노이드 개시에 필요한 시간은 비차별화 정도에 따라 달라지므로 이다. 따라서, 돌연변이의 특이성 또는 비차별화를 일으키는 모욕에 따라, 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 분석하기 위하여 빌리를 수확할 수 있는 최적 단계는 경험적으로 결정되어야 합니다.

절차의 성공을 위한 결정적인 요소는 토굴 오염을 방지하는 것입니다. 비리에서 유기성 개발 (그리고 어떤 오염 토굴에서) 네 가지 주요 기준을 확인하 여 보장: 1) BME-R1에서 빌리를 도금 전후 현미경 검사에 의해 수확 된 담블리의 순도 보장, 2) 모든 도금 된 villi개별적으로, 3) 모든 도금 된 빌리의 시각화를 허용 하기 위해 잘 당 한정된 수의 빌리를 도금; 시간 과정의 이미지는 빌리(그림 3)및 4)에서 유기체의 발달을 보여 빌리에서 시동하는 오르가노이드의 운동 및 형태학적 외관을 이론화; 빌리에서 개시하는 오르가노이드는 처음에는 불규칙하게 형성되어 2~5일 후에 4배 배율로 볼 수 있으며, 이는 암호화 유래 오르가노이드(EDTA/PBS 첼레이션 방법1,4)를사용하여 토굴을 분리하여 배양하여 잘 정의된 테두리가 있는 구형 구조로 밤새 나타난다(그림<stro...

절차는 그들의 오르가노이드 형성 잠재력을 결정하기 위하여 변태를 겪고 있는 마우스 상피에서 융모의 격리를 기술합니다.

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

Clonogenicity of organoids from the intestinal epithelium is attributed to the presence of stem cells therein. The mouse small intestinal epithelium is ...

이 방법은 생체 내에서 줄기 세포 마커를 획득하는 탈분화 빌리 상피의 오르가노이드 형성 능력을 확인할 수 있다. villi의 컬렉션은 오르가노이드 개시에 필요한 경우 틈새 신호를 제공할 수 있는 근본적인 메센키움의 완전한 손실을 방지하는 EDTA 킬레이션 방법보다는 스크레이핑을 통해 수행됩니다. 이 방법은 증식 및 분화 된 구획이 물리적으로 묘사되고 분화 세포가 생체 내에서 줄기 세포 마커를 발현하는 상피 조직에 적용됩니다.이 프로토콜의 일부 요인은 악의적 인 수확을위한 최적의 단계와 시간과 연습이 소요되는 villi를 긁어내는 최적의 압력을 포함하여 경험적으로 결정되어야합니다. 4일 연속 타목시펜과 옥수수 오일의 복막 내 주사를 통해 돌연변이 마우스에서 함수 돌연변이의 Smad4 녹아웃 및 베타 카테닌 이득을 유도한다. 마우스를 안락사한 후 마우스 털이 복막 구멍으로 들어가는 것을 방지하기 위해 70%에탄올로 복부를 스프레이합니다.해부 가위로 복강을 열어 내장을 노출시키고 가위와 집게를 사용하여 내장을 분리합니다. 십이지장의 근위 절반을 해부한 다음, 10 밀리리터 주사기로 5밀리리터의 얼음 차가운 PBS로 십이지장 들을 플러시하여 발광 함량을 제거합니다. 각진 가위로 십이지장(duodenum)을 세로로 열고 15센티미터 페트리 접시에 듀오덴을 평평하게 놓고, 듀오덴의 루멘이 연산자와 마주하게 됩니다.스크레이핑을 시작하기 전에 70 마이크로미터 메쉬 스트레이너를 6웰 조직 배양 플레이트의 우물 중 하나에 놓습니다. 1X PBS의 4 밀리리터로 모든 우물을 채우고 얼음 위에 접시를 놓습니다. 두 개의 미세한 유리 슬라이드를 사용하여 비방을 긁어, 하나는 십이지장 아래로 개최하고 다른 긁어.십이지장의 발광면을 두 번 긁어 내어 악랄을 제거하지 않고 점액을 제거한 다음 십이지장을 두 번 더 긁어 내어 지하실을 묶지 않고 슬라이드의 비방을 수집합니다. PBS가 포함된 1밀리리터 이송 파이펫을 사용하여 6웰 접시에 70마이크로미터 메쉬 스트레이너로 빌리를 전달합니다. 긁힌 후 빌리를 수집합니다.느슨한 토굴을 제거하려면 70 마이크로미터 여과기로 수집된 빌리를 잘 얼음 차가운 PBS 4밀리리터가 들어있는 6웰 접시에 일련의 우물을 통해 전달하여 세척합니다. P1000 파이펫을 사용하여 70 마이크로미터 스트레이너에서 얼음 위에 있는 새로운 15밀리리터 튜브로 PBS의 약 3밀리리터로 빌리 서스펜션을 전송합니다. 0.1%BSA 코팅 된 무딘 끝 P200 파이펫 팁을 사용하여 유리 슬라이드에 빌리 서스펜션의 50 마이크로 리터 볼륨을 전송합니다.PBS 서스펜션에서 빌리의 농도를 결정하고 테더드 토굴의 부재를 확인하기 위해 4배 배율 아래 50 마이크로리터 액적에서 빌리수를 계산한다. villi를 플레이트하려면 0.1%BSA 코팅 P200 무딘 말단 파이펫 팁을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 12.5 마이크로리터에서 웰당 6개의 담블리의 도금 밀도를 위해 악을 마이크로센트심심분리기 튜브로 이송합니다. 4도에서 200배 G에서 2분간 빌리를 내려갑니다.상체를 제거하고 원심분리를 반복하여 잔류 PBS를 제거합니다. 라미나르 플로우 후드에서 얼음 위에 해동된 차가운 BME-R1의 요구량으로 빌리 펠릿을 부드럽게 재차 놓습니다. P20 파이펫을 사용하여 BME-R1 매트릭스의 12.5 마이크로리터를 96웰의 U-바닥 플레이트의 우물당 37°C까지 예열하였다.BME-R1 매트릭스의 응고를 허용하기 위해 15 분 동안 37섭씨37도에서 조직 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 각 우물에 텍스트 원고에 설명된 대로 보충된 미리 따뜻해지는 ENR 미디어의 125마이크로리터를 추가합니다. 도금 된 빌리를 37°C의 조직 배양에서 5%의 이산화탄소로 배양하고 격일로 미디어를 변경합니다.오가노이드가 2일 전에 나타나는 우물을 버리십시오. 같은 마우스 장에서 차별화된 villi 상피대 와 지하실에서 나오는 오르가노이드의 외관에는 차이가 있습니다. 토굴 유래 오르가노이드는 테두리가 잘 정의된 구형 구조로 하룻밤 사이에 나타납니다.사악한에서 시작된 오르가노이드의 운동및 형태학적 외관은 처음에는 불규칙하게 모양으로 나타나현미경으로 볼 수 있기까지 2~5일이 걸리는 것으로 조사되었다. 두 개의 서로 다른 빌리로부터의 오르가노이드 개시가 표시됩니다. 오르가노이드 형성 잠재력을 가진 빌리는 근본적인 관공서의 보유 때문일 가능성이 높습니다.빌라에서 오르가노이드 개시는 빌리 중 하나에서 둘째 날에 명백하다. 다른 빌라에 있는 동안, 오르가노이드는 4 일째에 나타납니다. 사악한 것을 수확하고 그로 인한 오르가노이드를 재배할 때 토굴 오염을 피하기 위해 적절한 조치를 취하는 것이 중요합니다.동일한 돌연변이의 토굴과 사악에서 나오는 오르가노이드 사이의 표현성 차이는 이 절차에 따라 관찰되었기 때문에 둘 사이의 분자 차이를 찾기 위해 추가 실험을 수행할 수 있었습니다. 이 프로토콜은 내인성 토굴에서 발생하는 오르가노이드와 분화 제거로 인해 발생하는 ectopic 토굴사이의 차이점을 연구하는 데 사용될 수 있으므로 탈분화의 의미를 해결할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 수술 조직과 생검에서 수집한 결장 소굴에서 인간 장류를 확립하고 결장 소굴에서 콜로노이드를 확립하는 방법을 설명합니다. 이 방법론적 기사에서는 인간 장 및 콜로노이드의 성공적인 성장과 유지에 필수적인 배양 방식을 제시합니다.

전체 조직과 조직 검사에서 인간 상피 Enteroids과 Colonoids 설립

여기, 우리 문화 인간 enteroid 또는 셀룰러 및 생 화 확 적인 수준에서 호스트 상피 microbiota 상호 작용 연구를 그대로 배리어 기능이 있는 colonoid monolayers 프로토콜을 제시.

병원 균, 공생, 그리고 호스트 창 자 상피 사이 상호 작용을 공부 하는 인간 Colonoid Monolayers

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기에서, 우리는 장 장벽 기능, 투과성 및 수송을 연구하기 위한 인간 오가노이드 유래 장 상피 단층의 제조를 기술한다. 오가노이드가 외부 자극에 대한 원래의 상피 조직 반응을 나타내기 때문에, 이들 모델은 세포주의 확장성과 일차 조직의 관련성 및 복잡성의 이점을 결합한다.

오가노이드 유래 상피 단층: 장 장벽 기능을 위한 임상적으로 관련된 시험관내 모델

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

본 프로토콜은 claudin-7 녹아웃 모델에서 결장 줄기 세포의 활성 및 기능을 연구하기 위해 쥐 결장 오가노이드 시스템을 확립하는 것을 설명합니다.

생체 외 장내 줄기세포 기능을 연구하기 위한 쥐 결장 음와의 3차원 배양

여기에서는 냉동보존된 상피 선와에서 돼지 장 3D 오가노이드를 배양하는 프로토콜을 설명합니다. 우리는 또한 3D 오가노이드에서 파생된 세포 단층을 확립하여 상피 세포의 정점 측면에 접근할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다.

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

우리는 쥐의 소장 선와와 배양 장 3D 오가노이드를 선와에서 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 또한, 우리는 상피하 세포 틈새가 없는 단일 장 줄기 세포에서 오가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다.

쥐 장 선와에서 오가노이드와 오가노이드 연구를 위한 단일 줄기 세포의 3D 배양

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 프로토콜은 인간 장 오가노이드 기술과 단일 세포 전사체 분석을 결합하여 이전에 탐구되지 않은 장 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

인간 장 오가노이드를 사용하여 단세포 전사 수준에서 소장 상피를 이해합니다.

이 연구는 소장과 대장에서 유래한 돼지 오가노이드의 2D 단층을 생성하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 단층의 성장은 TEER 값의 증가로 표시되며, 이는 견고한 상피 무결성을 나타냅니다. 게다가, 이 단층은 forskolin의 신청에 따르는 Ussing 약실 실험에 있는 생리적인 분비 반응을 전시합니다.

토종 장의 생리학적 특성을 반영하는 2차원 돼지 장 오가노이드(Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids)

배우세요 쥐 장내 융모 상피에서 3D 오르가노이드를 배양하는 긁기 분리법을 이용한 방법입니다. 이 기술은 재분화 세포의 줄기세포 마커 획득과 장 재생 메커니즘 연구에 활용됩니다.

장내 빌리 상피에서 오르가노이드의 3D 배양

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