Name: 마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: 배우세요 마우스 원발성 간세포 분리를 위한 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜을 C57BL/6J 암컷 마우스를 이용하여. 이 방법은 상용 시약을 사용하여 수율을 높이고 비실질세포 간섭을 최소화하여 간 기능 및 대사 연구에 필수적인 세포를 제공합니다.

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이 연구는 국립 보건원 (Grant 5R01HD095512-02 to S.W.)의 지원을 받았다.

모든 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스(8주령)를 본 연구에 사용하였다.
1. 준비:
<ol><li>윌리엄의 E 배지 (GlutaMAX 보충제)를 10 % FBS 및 1 % 항생제 - 항균제 용액과 혼합하여 배양 배지를 만듭니다.</li>
	<li>25 mL의 콜라게나제-디스파제 배지 (예를 들어, 간 소화 배지)를 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 입자 파편을 제거하였다.</li>
	<li>50 mL의 이중 증류 H2O (ddH2O), 35 mL의 관류 배지 (예를 들어, 간 관류 배지) (또는 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 50 mL), 및 25 mL의 여과된 콜라게나제-디스파제 배지를 45°C 수조에서 30분 동안 가온하였다.</li>
	<li>멸균 조직 배양 후드 내에서 50mL 튜브에 10x HBSS 2mL와 Percoll 18mL를 섞어 20mL의 1x Percoll-HBSS를 만들고 얼음 또는 4°C에 보관합니다. 참고: 1x Percoll-HBSS는 최소 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>멸균 조직 배양 후드 내에, 30 mL의 세척 배지 (예를 들어, 간세포 세척 배지)를 깨끗한 페트리 접시에 붓고, 얼음 위에 보관한다.</li>
	<li>펌핑 튜브를 45°C 수조의 물에 잠급니다. 결과는 실온이 25°C인 경우 가장 신뢰할 수 있습니다.</li>
	<li>225 μL의 케타민 HCL, 93.75 μL의 자일라진, 및 1681 μL의 1x PBS를 혼합하여 2 mL의 1x 마취제를 제조하였다.</li>
	<li>승인 된 방법을 사용하여 한 마리의 마우스를 마취하십시오. 여기에 마우스를 150 μL의 1x 마취제를 복강내 주사하였다. 완전한 마취를 보장하기 위해 발가락 꼬집음에 대한 반응과 같은 반사 신경의 손실에 대한 테스트를 수행하십시오.</li>
	<li>마우스를 네 팔다리로 해부 패드에 고정하거나 방수 테이프 또는 기관의 동물 관리 및 사용 위원회 (또는 이에 상응하는 것)가 승인 한 기타 방법을 사용하여 고정하십시오.</li>
	<li>해부를 위해 멸균 된 포셉과 가위를 준비하십시오. 가능한 오염을 피하려면 멸균 후드 내의 모든 단계를 수행하십시오.</li>
</ol>2. 절차:
<ol><li>연동 펌프를 사용하여 예열 된ddH2O를 5 분 동안 4 mL / min의 속도로 펌핑하십시오. 펌핑 튜브를 물에서 예열 된 관류 매체로 바꿉니다.</li>
	<li>마취 된 마우스의 복부를 70 % EtOH로 소독하고 가위로 잘라 간, 문맥 정맥 및 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.</li>
	<li>연동 펌프를 정지하십시오. 24 G 카테터 (예를 들어, 폐쇄 IV 카테터, 24 G, 0.75 IN)를 IVC에 삽입하십시오. 펌핑을 시작하고 포털 정맥을 열어보십시오.</li>
	<li>플러시 된 액체가 맑을 때까지 펌핑을 계속하십시오 (약 3-5 분). 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 기포가 IVC에 들어 가지 않도록주의하십시오. 참고 :이 단계는 간에서 가능한 한 많은 혈액을 씻어내는 것입니다.</li>
	<li>펌핑 튜브를 관류 배지에서 콜라게나제-디스파제 배지로 변경한다. 단계 2.6을 수행하는 동안 콜라게나제-디스파아제 배지의 모든 25 mL가 고갈될 때까지 펌핑을 계속한다.</li>
	<li>매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 참고 :이 단계에서 혈액의 완전한 손실은 마우스에 치명적입니다. 마우스의 죽음은 실험 후 심장 박동의 부족으로 확인할 수 있습니다. 시설 정책에 따라 시체를 처분하십시오.</li>
	<li>담낭 없이 간 전체를 얼음 위의 페트리 접시에 담낭 없이 30 mL 세척 배지로 분리한다.</li>
	<li>포셉으로 조각으로 찢어 원발성 간세포를 용액으로 방출하십시오. 이 단계는 세척 배지를 방출 된 원발성 간세포와 작은 간 조각으로 가득 찬 흐린 용액으로 바꿀 것입니다.</li>
	<li>단계 2.8에서 흐린 용액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 얼음 위에 50 mL 튜브에 20 mL 1x Percoll-HBSS를 넣는다. 튜브를 20 번 뒤집어 혼합하십시오.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>조직 배양 후드 내에서, 상청액을 흡인한다. 펠렛을 차가운 세척 배지 30 mL로 세척하십시오.</li>
	<li>4°C에서 5분 동안 50 x g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 제거하고 펠렛을 조직 배양 후드 내의 25 mL의 배양 배지 (또는 적절한 다른 부피)에 재현탁시켰다.</li>
	<li>세포 번호를 계수하고 실험 설계에 따라 원하는 배양 플레이트 상에 세포를 플레이트한다. 참고: 8주령 마우스 한 마리에서 적절하게 분리한 원발성 간세포는 보통 4개의 6웰 플레이트 또는 4개의 12웰 플레이트에 플레이팅하기에 충분합니다.</li>
</ol>

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다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜이 개발되었다. 또한 다양한 요구에 따라 최적화되고 조정되었습니다 (표 1). 분리 프로토콜은 일반적으로 관류 (효소 소화 포함)와 정제의 두 부분으로 구성됩니다.
관류는 생체내 전체 간(2,20,21,22,23) 또는 해부된 간엽(24)과 함께 수행될 수 있다. 해부된 엽의 관류는 일반적으로 기술적 용이성을 위해 좌측 및 중간 엽으로 제한되었다. 이론적으로, 생체 내 관류는 모든 엽과 함께 전체 간을 사용하기 때문에 더 많은 원발성 간세포를 산출해야합니...

간은 음식 소화, 혈액 순환 및 해독과 같은 수많은 생명 유지 기능에서 중요한 역할을하기 때문에 척추 동물의 신체에서 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 시험관내 배양에서 마우스 원발성 간세포의 사용은 탄수화물 대사 및 간 암종에 대한 연구에서 점점 더 대중화되고 있다. 따라서, 마우스의 선천적 생리적 기능을 유지하면서 원발성 간세포를 분리하기 위한 편리한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 포도당 대사의 허브로서의 기능으로 인해 간은 포도당 생산 및 저장의 중심이기도합니다1. 시험관 내에서 원발성 간세포를 이용한 실험은 대부분의 포도당 대사 연구에 필수적이다. 따라서 수년 동안 다양한 연구 그룹이 마우스 원발성 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다.
마우스 간세포 분리의 일반적인 절차는 먼저 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)과 같은 이소형 액체로 간에서 혈액을 씻어 낸 다음 콜라게나제 함유 용액을 사용하여 간세포를 해리시키는 것입니다. 이러한 프로토콜은 일반적인 절차를 공유하지만 필요에 따라 시약과 단계가 다릅니다. 그러나 필요한 시약을 준비하고 분리 단계를 수행하는 데는 시간이 걸립니다. 본 프로토콜을 개발할 때, 효율성은 우선 순위로 설정되었으며, 모든 시약은 즉시 사용 가능하고 시장에서 구입할 수 있으며 가능한 한 적은 단계였습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 단리된 원발성 간세포의 순도 및 생존력을 위태롭게 하지 않으면서 마우스로부터 원발성 간세포를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>10x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>FALCON</td><td>353043</td><td>코팅 불필요</td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>FALCON</td><td>353046</td><td>코팅 불필요</td></tr><tr><td>항-AKT</td><td>세포 신호</td> 전달 <td>2920S</td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균 용액(100x), 안정화</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>anti-FOXO1</td><td>Cell Signaling</td><td>97635S</td><td></td></tr><tr><td>anti-GAPDH</td><td>Cell Signaling</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-AKT (S473)</td><td>Cell Signaling</td><td>9271L</td><td></td></tr><tr><td>anti-PEPCK</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-166778</td><td></td></tr><tr><td>anti-p-FOXO1 (S256)</td><td>Cell Signaling</td><td>84192S</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 70 &마이크로; m</td><td>CELLTREAT</td><td>229483</td><td></td></tr><tr><td>폐쇄형 IV 카테터, 24 게이지 0.75 IN</td><td>Becton Dickinson</td><td>383511</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 포도당 없음, 글루타민 없음, 페놀 레드 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1443001</td><td></td></tr><tr><td>EnzyChrom 포도당 분석 키트</td><td>BioAssay 시스템</td><td>EBGL-100</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>MilliporeSigma</td><td>F3917-10MG</td><td></td></tr><tr><td>글루카곤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2044</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG 2차 항체</td><td>LI-COR</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG 2차 항체</td><td>LI-COR</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>GraphPad 소프트웨어</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash Medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>IBMX</td><td>세포 신호</td><td>13630S</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>릴리</td><td>NDC 0002-8215-01</td><td></td></tr><tr><td>케타민 HCL (100 mg/mL)</td><td>호스피라 Inc</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>간 소화 매체</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td>조직 배양 후드 내에서 50 mL 튜브에서 각각 25 mL로 분취하고 -20 &deg로 유지합니다. C freezer</td></tr><tr><td>Liver Perfusion Medium</td><td>Gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Gilson</td><td>Minipuls 2</td><td>4 mL/min으로 펌핑 가능</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td>4°C에서 50mL 튜브를 원심분리 가능; C</td></tr><tr><td>나트륨 L-젖산</td><td>시그마-알드리치</td><td>L7022</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 피루브산</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터, PVDF 0.45 &마이크로; m 직경 30mm</td><td>CELLTREAT</td><td>229745</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 0.5mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 60mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>관, 15mL</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr>관<tr><td>, 50mL</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>물 목욕 탱크</td><td>Corning</td><td>CLS6783</td><td>또는 최대 45°C까지 가열할 수 있는 모든 수조 탱크; C</td></tr><tr><td>윌리엄 s E Medium (GlutaMAX Supplement)</td><td>Gibco</td><td>32551020</td><td></td></tr><tr><td>Xylozine (100 mg/mL)</td><td>Vetone Anased LA</td><td>NDC13985-704-10</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

원발성 간세포는 시험관내 간 연구, 특히 포도당 대사 연구에서 광범위하게 사용된다. 기본 기술은 시간, 노동, 비용 및 원발성 간세포 사용과 같은 다양한 요구에 따라 적용되어 다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜을 초래합니다. 그러나, 원발성 간세포 단리에서의 수많은 단계 및 시간 소모적인 시약 제제는 효율성을 위한 주요한 단점이다. 장단점에 대해 서로 다른 프로토콜을 비교 한 후 각각의 장점을 결합하고 신속하고 효율적인 원발성 간세포 분리 프로토콜을 공식화했습니다. 불과 ~ 35 분 이내에이 프로토콜은 다른 프로토콜만큼 건강한 원발성 간세포를 산출 할 수 있습니다. 또한, 분리된 원발성 간세포를 사용하여 수행된 글루코스 대사 실험은 시험관내 간 대사 연구에서 이러한 프로토콜의 유용성을 검증하였다. 우리는 또한이 연구의 각 단계의 중요성과 목적을 광범위하게 검토하고 분석하여 미래의 연구자가 필요에 따라이 프로토콜을 더욱 최적화 할 수 있도록했습니다.

효율을 시험하기 위하여, 본원의 일차 간세포 분리 프로토콜이 8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행되었다. 분리된 원발성 간세포의 부착 및 순도를 시험하였다. 원발성 간세포 분리는 간 약물 효과 및 글루코스 대사, 제약 바이오마커 활성2, 인슐린 감수성 및 글루코스 생산과 같은 간 생리학에 대한 매우 다양한 실험에 사용된다. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 원발성 간세포의 활성을 다음의 실험에서 시험하였다.
코팅은 본 프로토콜에서 원발성 간세포 부착을 위해 요구되지 않았다. 단리된 일차 간세포를 6-웰 플레이트 상에 5 x 105 세포/웰로 플레이팅하였다. 1시간 후, 확고한 부착이 관찰되었고, 1차 간세포는 도금 후 12시간 후에 완전히 팽창되었다(도 3). 이것은 도금 후 12 시간, 세포가 실험에 활용 될 준비가되었음을...

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

마우스 원발성 간세포는 간 연구에서 중요하다. 특히 포도당 대사 및 간 약물 검사. 격리 과정은 시간이 많이 걸리고 에너지 비용이 많이 들 수 있습니다.이러한 프로토콜은 마우스 원발성 간세포를 분리하는 효율적인 방법을 제공할 수 있다. 시간과 노동 친화적입니다. 모든 지역에서 상업적으로 이용 가능한 몇 가지 단계가 필요합니다.연동 펌프를 사용하여 분당 4 mL의 속도로 이중 증류수를 5 분 동안 예열하여 펌핑을 시작하십시오. 그런 다음 펌핑 튜브를 물에서 예열 된 관류 매체로 바꿉니다. 물과 관류 매체 사이의 기포를 모니터링한다.시스템을 통한 관류 매체의 흐름을 추적하는 데 도움이 될 것이다. 다음으로 마취된 8주령의 C57 검정 6J 암컷 마우스의 복부를 70%에탄올로 소독한다. 그리고 가위를 사용하여 복부를 열어 간, 문맥 정맥 및 열등한 정맥 카바를 노출시킵니다.그런 다음 연동 펌프를 중지하십시오. 펌핑 튜브에 물이 아닌 관류 매체가 포함되어 있는지 확인한 후. 24 게이지 카테터를 열등한 정맥 카바에 삽입하십시오.펌프를 다시 켜고 포털 정맥을 열어줍니다. 관류 매체가 펌핑되는 동안 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석구석에 도달하도록하십시오. 약 삼 ~ 다섯 분 동안 또는 플러시 된 액체가 맑을 때까지 펌핑을 계속하십시오.다음으로 펌핑 튜브를 관류 배지에서 콜라게나제 디스파제 배지로 변경한다. 그리고 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 콜라게나제 디스파제 배지의 모든 25 mL가 고갈될 때까지 펌핑을 계속한다.다음으로 담낭없이 간 전체를 분리하십시오. 이를 얼음 위의 페트리 접시에 30 mL의 세척 배지에 넣었다. 포셉을 사용하여 간을 조각으로 찢어 원발성 간세포를 용액으로 방출합니다.이 단계에서, 세척 배지는 방출된 원발성 간세포와 작은 간 조각을 포함하는 흐린 용액으로 변한다. 이 흐린 용액을 70미크론 셀 스트레이너를 통해 여과하고, 얼음 위의 50 mL 튜브에 호당 HBSS 20 mL의 1X에 넣는다. 용액을 튜브를 20회 반전시켜 혼합한다.다음으로 용액을 원심분리한다. 그런 다음 조직 배양 후드에서 상청액을 흡인하십시오. 펠렛을 30 mL의 차가운 세척 매질로 세척한다.세포를 원심분리로 다시 한번 펠릿화한다. 상청액을 제거하고, 펠렛을 25 mL의 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 원하는 배양 플레이트에 플레이트하십시오.실험 설계에 따르면. 도금 후, 분리된 일차 간세포를 1시간씩 단단히 부착하고 12시간 후에 완전히 팽창시켰다. 분리된 간세포에서, 간세포 마커, 예컨대 트랜스티레틴, CD95, ASGR1 및 ASGR2의 mRNA 수준은 간 전체에 비해 유의하게 증가하였다.대조적으로 면역 세포, 성상 세포 및 내피 세포의 존재는 더 낮았다. CD45, 콜라겐 타입 1 알파 1, 및 내피 세포 2 키나제 2 mRNA 수준의 급격한 감소에 의해 입증된 바와 같이. 이 프로토콜이 다른 간 세포로부터의 간섭을 크게 줄일 수 있음을 시사한다.도금 후 ASGR1 및 ASGR2 수준은 시간이 지남에 따라 감소했지만 12 시간 시점까지 전체 간과 비교할 수 있습니다. 특히 ASGR1의 경우. 막 결합된 CD81의 발현 수준은 최대 48시간 동안 일관되었다.비교하여, 톨-유사 수용체 4 발현은 일반적으로 증가하였고, 48시간 후에 생체내 수준보다 더 높아졌다. 인슐린 감수성 검정은 인슐린이 세린 473에서 두 AKT의 인산화를 유의하게 촉진한다는 것을 입증하였다. 및 포크헤드 박스(01)를 세린(256)에서, 간세포에서.인슐린에 대한 원발성 간세포의 민감성을 나타낸다. 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 단백질 수준은 글루카곤 처리 후 유의하게 증가하였다. 글루코스 생산 경로가 활성화되었음을 시사한다.이러한 활성화는 증가된 글루코스 생산에 의해 추가로 확인되었다. 그리고 Forskolin + IBMX와 같은 다른 포도당 생산 자극기와 함께. 이 프로토콜은 마우스 원발성 간세포를 이용한 연구에 시간과 에너지를 모두 절약할 수 있습니다.이 프로토콜에 따라, 가상의 글루코스 대사 및 제약 바이오마커 분석과 같은 관련 실험이 수행될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기서는 성인 마우스로부터 일차 간세포를 분리하는 효소 방법을 보여, 우리는 ELISA 및 실시간 PCR을 이용하여 염증 반응을 정량 설명한다.

마우스에서 차 간세포 문화에 염증 반응의 유도

이 프로토콜의 목표는 간에서 높은 생존 능력 및 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포의 높은 수익률을 얻을 것입니다. 이 유형 IV 콜라 솔루션 hepatocytes 및 정현파 내 피 세포 차등 원심 분리 뒤 문맥을 통해 간 perfusing에 의해 수행 됩니다.

Hepatocytes에서 마우스 간 사인 내 피 세포의 정화 관류

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

여기서 제시된 것은 변형된 콜라게나아제 관류 기술을 사용하여 성인 마우스 간으로부터 마우스 간세포의 분리를 위한 프로토콜이다. 또한 3D 콜라겐 샌드위치 설정에서 간세포의 장기 배양뿐만 아니라 담즙 카나리아 형성 및 치료에 대한 반응을 연구하기 위한 세포골격 성분의 면역 라벨링이 기술된다.

체외에서 담즙 관내 형성에서 세포골격의 역할을 연구하기 위해 1 차 마우스 간세포의 격리 및 3D 콜라겐 샌드위치 문화

이 프로토콜은 특수 정맥 내 카테터, 표준화 된 멸균 일회용 튜브, 실시간 모니터링으로 보완 된 온도 제어 및 분리 된 일차 쥐 간세포의 생존력, 수율 및 기능의 일관성을 향상시키기 위해 두 단계 콜라게나제 관류 절차를위한 경보 시스템의 사용을 자세히 설명합니다.

다중 파라미터 관류 조절을 통한 원발성 쥐 간세포의 분리

지방산 β산화는 간세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 에너지를 생성하는 데 필수적인 대사 경로입니다. 여기에서, 우리는 14C표지된 팔미트산을 사용하여 갓 분리된 원발성 간세포에서 지방산 β산화를 측정하는 방법을 설명한다.

갓 분리된 마우스 간세포의 현탁액에서의 지방산 β산화의 측정

여기서 우리는 원발성 마우스 간 정현파 내피 세포 (LSEC) 분리를위한 프로토콜을 개략적으로 설명하고 시연합니다. 이 프로토콜은 간 콜라게나제 관류, 저속 원심분리에 의한 비실질 세포 정제 및 CD146 마그네틱 비드 선택을 기반으로 합니다. 우리는 또한 표현형과 유세포 분석기 및 주사 전자 현미경을 사용하여 이러한 분리 된 LSEC를 특성화합니다.

마우스 일차 간 정현파 내피 세포의 분리 및 특성화

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

지질이 함유된 간세포는 간 재생에 내재되어 있지만 일반적으로 밀도 구배 원심분리 시 손실됩니다. 여기에서 우리는 지방성 간세포를 유지하는 최적화된 세포 분리 프로토콜을 제시하여 마우스에서 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 대표적인 집단을 생성합니다.

생쥐의 부분 간 절제술 후 재생 간세포의 분리

이 프로토콜은 쥐 모델에서 최적화된 2단계 콜라겐분해효소 간 관류 기술을 제시하고 3D 오가노이드의 시험관 장기 배양을 위해 분리된 간세포의 사용을 보여줍니다.

쥐의 간 관류 및 일차 간세포 분리: 최첨단 3D 오가노이드 배양에 중요한 오래된 절차

배우세요 마우스 원발성 간세포 분리를 위한 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜을 C57BL/6J 암컷 마우스를 이용하여. 이 방법은 상용 시약을 사용하여 수율을 높이고 비실질세포 간섭을 최소화하여 간 기능 및 대사 연구에 필수적인 세포를 제공합니다.

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

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