살아있는 세포의 원형질막에서의 분자 확산 분석을위한 스팟 변이 형광 상관 분광법
2020년 11월 12일
이 기사는 살아있는 세포의 원형질막에서 분자 확산을 측정하기 위해 스팟 변이 형광 상관 분광법 (svFCS) 현미경을 구축하는 방법에 대한 프로토콜을 제시하는 것을 목표로합니다.
원형질막 측면 조직에 대한 현재 견해는 불완전합니다. 이러한 이유로 Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy와 같은 새롭고 혁신적인 기술을 구현하는 것이 중요합니다. 이것은 뛰어난 시간 및 공간 해상도를 특징으로 하는 매우 강력한 기술입니다.
또한, 비침습적이며 생리학적 조건에서 세포막을 연구할 수 있습니다. 실험을 실행하기 전에 매일 모든 홍채 다이어프램을 열고 파워 미터를 사용하여 첫 번째 홍채가 완전히 열린 상태에서 레이저 출력을 측정합니다. 중간 플레이트를 돌려 최대 전력을 찾습니다.
레이저 출력이 평소보다 낮으면 조리개를 사용하여 정렬을 확인하고 필요에 따라 L1과 M1을 번갈아 이동합니다. 그런 다음 실험 노트북에서 전력 값을 기록해 둡니다. 검출 경로를 확인하려면 물, 커버 슬립 및 2개의 나노몰 로다민 6G 용액 방울을 대물렌즈에 놓습니다.
그런 다음 상관기 소프트웨어를 시작하고 데이터를 기록합니다. 자동 상관 관계 기능은 낮은 양의 노이즈, 작은 폐기물 크기 및 초당 분자당 높은 계수율을 표시해야 합니다. 스폿 크기를 보정하려면 세포 배양 코드 커버 슬립을 수침 대물렌즈에 놓고 200마이크로리터의 2나노몰 로다민 6G 용액을 커버 슬립에 추가합니다.
488나노미터 레이저 빔 출력을 300마이크로와트로 조정하고 소프트웨어에서 svFCS 조명 감지 현미경 포트를 선택합니다. APD를 켜고 신호가 떨어질 때까지 홍채를 열어 최소한의 폐기물 크기를 얻거나 더 큰 폐기물 크기를 얻으려면 조리개를 닫습니다. 약 10, 20초 자동 상관 관계 함수를 기록하여 통계적 재현성을 높이고 APD를 끕니다.
적절한 데이터 분석 프로그램에서 분자 응집체로 인한 강한 변동이 있는 런을 확인하고 폐기한 다음 유지된 자동 상관 함수의 평균을 3D 확산 모델에 맞추고, 피팅 매개변수에서 평균 확산 시간을 추출하고, 데이터를 TXT 파일로 저장합니다. svFCS 분석의 경우 2-4마이크로와트 사이의 전력을 공급받는 488나노미터 빔을 조정하고 섭씨 37도에서 10분 동안 샘플을 평형화합니다. svFCS 조명 감지 현미경 포트와 APD를 선택합니다.
그런 다음 선택한 셀의 XY 스캔과 Z 스캔을 수행합니다. 세포 상단에 있는 원형질막을 선택하여 최대 형광 강도에서 공초점 지점을 찾고 데이터 수집을 시작합니다. 상관자 소프트웨어에서 20개의 시리즈 1개, 5초 실행을 기록합니다.
마지막 실행 후 APD를 끄고 설명된 대로 예기치 않은 실행을 삭제합니다. 평균 자동 상관 관계 함수를 2종 2D 확산 모델에 맞추고 피팅 매개변수를 이전에 저장한 TXT 파일에 저장합니다. 관심 세포가 모두 기록되면 200-400나노미터 사이의 폐기물 크기를 4개 이상 분석하여 단일 확산 법칙을 확립합니다.
그런 다음 MATLAB에서 최소 4개의 폐기물 크기 실험에 해당하는 모든 TXT 파일이 포함된 폴더를 선택하고 제곱 폐기물에 대한 확산 시간을 플로팅합니다. 이 그림에서는 Cos7 세포에서 발현되는 Thy1-GFP에 대한 확산 법칙을 관찰할 수 있습니다. 확산 법칙은 양의 시간 0 값을 가지며, 이는 Thy1-GFP가 원형질막의 나노 도메인 구조 내에 국한되어 있음을 나타냅니다.
이 분석에서 Thy1-GFP를 발현하는 세포의 콜레스테롤 산화효소 처리는 확산 법칙 시간 0 값을 7.36 플러스 또는 마이너스 1.34 밀리 초로 이동시켰다. Thy1-GFP 감금의 특성은 콜레스테롤 함량에 따라 달라지며 지질 뗏목 나노 도메인과 관련이 있음을 확인합니다. 총 콜레스테롤 함량의 작지만 유의한 감소는 콜레스테롤 산화효소 처리에서도 관찰되었습니다.
이 효소는 원형질막의 바깥쪽 소엽에서 접근할 수 있는 콜레스테롤 풀에만 작용하기 때문에 이러한 데이터는 관찰된 콜레스테롤 감소가 원형질막과만 관련이 있으며 지질 뗏목 나노 도메인의 불안정화를 유발한다는 것을 시사합니다. 이 절차를 시도할 때 가장 중요한 것은 svFCS 시스템의 적절한 보정과 분석을 위한 세포 준비입니다. svFCS는 세포막 조직을 연구하는 훌륭한 도구입니다.
그러나 세포 내 분자의 확산을 분석하는 데에도 사용할 수 있습니다. 이 기술은 암세포와 같은 살아있는 세포에 대한 잠재적 약물의 영향을 결정하기 위해 생물 의학에서 성공적으로 구현될 수 있습니다.
개요
본 논문은 살아있는 세포의 세포막에서 분자 확산을 측정하기 위한 스폿 변이 형광 상관 분광법(svFCS) 현미경 구축 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 비침습적이면서도 우수한 시간 및 공간 분해능을 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 형광 현미경 검사
배경
- 형질막의 측방 조직화는 아직 완전히 이해되지 않았습니다.
- 더 나은 통찰력을 얻기 위해 svFCS와 같은 혁신적인 기술이 필요합니다.
- svFCS를 통해 생리적 조건 하에서 세포막을 연구할 수 있습니다.
- 정확한 결과 도출을 위해서는 적절한 보정과 세포 준비가 필수적입니다.
연구 목적
- svFCS 현미경 검사를 위한 프로토콜을 개발합니다.
- 형질막에서의 분자 확산을 측정합니다.
- 막 조직에 콜레스테롤이 미치는 영향을 분석합니다.
사용된 방법
- rhodamine 6G 용액을 이용한 svFCS 시스템의 보정.
- 선택된 세포의 XY 및 Z 스캔을 통한 데이터 수집.
- MATLAB을 이용한 확산 법칙 분석.
- 콜레스테롤 산화효소 처리 전후의 확산 매개변수 비교.
주요 결과
- Thy1-GFP 확산은 나노 도메인 구조 내로 제한됩니다.
- 콜레스테롤 산화효소 처리는 확산 법칙의 시간 제로 값을 변화시킵니다.
- 총 콜레스테롤 함량의 감소가 관찰되었습니다.
- 본 연구는 콜레스테롤이 지질 뗏목의 안정성에 영향을 미친다는 점을 시사합니다.
결론
- svFCS는 세포막 구조를 연구하는 데 효과적입니다.
- 이 기술은 세포 내 분자의 확산 또한 분석할 수 있습니다.
- 이러한 연구 결과는 살아있는 세포에 대한 약물 효과를 이해하는 데 중요한 시사점을 제공합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
스팟 변동 형광 상관 분광법(svFCS)은 생리적 조건 하의 세포막에서 분자 확산에 대한 고해상도 분석을 가능하게 하여, 막 구조 및 지질 래프트(lipid raft) 역학에 대한 중요한 통찰을 제공합니다. 이러한 기능은 막 결합 단백질의 생물물리학적 맥락을 규명함으로써 타겟 검증을 지원하며, 초기 발견 단계에서 기전적 리스크 감소(mechanistic de-risking)에 기여합니다. 이 방법의 비침습적 특성과 살아있는 세포와의 호환성은 전임상 스크리닝 및 중개 바이오마커 연구에서의 유용성을 높여줍니다.
바이오 제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 나노도메인 구조 내에서 Thy1-GFP와 같은 막 단백질의 확산 거동을 정량화함으로써 치료 가설을 검증합니다.
- 운용적 가치: 콜레스테롤 의존적 구속을 밝혀 지질 뗏목(lipid raft) 결합의 기능적 검증을 가능하게 합니다.
- 예측적 가치: 지질 환경 섭동에 민감하게 반응하는 막 국소화 표적을 식별하여 포트폴리오 분류 및 선별을 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 분석 준비도: 생리학적 조건에서 기초 확산 법칙을 설정함으로써 화합물 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템을 준비합니다.
- 정량적 출력: 다양한 빔 허리(beam waist) 크기에 걸쳐 재현 가능한 확산 시간 측정값을 생성하여 분석 표준화를 지원합니다.
- 스크리닝 관련성: 화합물로 인한 확산 파라미터의 변화를 감지하여 막 구조의 변경 또는 표적 결합 여부를 나타냅니다.
중개 및 전임상 연구
- 질환 관련성: 지질 조절 장애와 관련된 병리 현상과 연관된 세포막 래프트 나노도메인(plasma membrane raft nanodomain)의 붕괴 모델을 제시합니다.
- 중개 연구의 연속성: 환경적 섭동(예: 콜레스테롤 조절)이 표적 행동을 어떻게 변화시키는지 입증함으로써 초기 발견 단계의 관찰 사항을 전임상 검증으로 연결합니다.
- 위험 조정 결정: 막 섭동에 대한 표적의 회복력을 기반으로 go/no-go 기준을 결정하는 데 필요한 기전적 판독값을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
svFCS는 타겟 가설 검증부터 리드 물질 발굴, 전임상 검증에 이르는 발견 연속체(discovery continuum)에 적합하며, 생화학적 및 표현형 분석을 보완하는 생물물리학적 특성 분석 계층을 제공합니다.
- 발견 생물학: 확산 계수를 측정하고 구속된 분자 집단과 이동성 분자 집단을 식별함으로써 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: rhodamine 6G를 이용한 표준화된 보정 및 검출 경로의 무결성 검증을 통해 분석 준비 상태를 확보합니다.
- 분석: 자기 상관 함수의 MATLAB 분석을 통해 정량적 확산 법칙을 제공하며, 이를 통해 서로 다른 조건 간의 분자 거동을 비교할 수 있게 합니다.
- 중개 연구: 막 조직의 변화를 기능적 결과와 연결하며, 확산의 변화가 표현형 반응과 상관관계가 있을 때 바이오마커 정렬을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 여러 표적 및 세포주에 걸쳐 막 단백질 역학을 연구할 수 있는 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 세포막에서의 나노스케일 구속 및 확산 불균질성을 해결함으로써 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 레이저 출력 보정, 검출 경로 점검 및 반복 자동 상관 함수 평균화를 통해 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 생체 유사 막 환경에서 표적 안정성을 정량화하여, 예측하지 못한 생물물리학적 결함으로 인한 후기 단계의 탈락을 줄임으로써 go/no-go 결정 능력을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 적절한 국소화 및 기능 수행을 위한 지질 래프트 무결성에 대한 의존성을 바탕으로, 리스크가 조정된 표적 우선순위 설정이 가능해집니다.
실행 시 고려 사항
- 형광 현미경, 레이저 안전 및 상관 분광법 데이터 분석에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- APD, 상관기 소프트웨어 및 정밀한 레이저 출력 제어 장치(svFCS 측정을 위해 2–4 µW)가 갖춰진 맞춤형 형광 현미경이 필요합니다.
- 교정 프로토콜(예: rhodamine 6G 스폿 크기 검증) 및 데이터 분석 파이프라인(예: 2D 확산 모델의 MATLAB 피팅)에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 콜레스테롤 산화효소 외에 서로 다른 막 단백질, 세포 유형 및 섭동제에 따른 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 분자 응집을 방지하고 37°C 평형화 동안 생리학적 관련성을 보장하기 위해 세심한 시료 준비가 필요하다는 제약이 있습니다.
