Name: 중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 중합-비합화 주기를 이용한 투불린 정화 방법으로, 배양 세포나 마우스 뇌에서 순수하고 조립 가능한 투불린을 얻어 미세소관 역학 및 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 Janke 연구소의 모든 구성원, 특히 J. 수프론뿐만 아니라 G. 라키치 (Institut MICALIS, AgroParisTech) 및 A. Gautreau (에콜 폴리 테크닉대학)의 프로토콜 설립 기간 동안 도움을 주셔서 감사합니다. 우리는 마우스 사육과 관리에 도움을 준 Institut Curie의 동물 시설에 감사드립니다.
J. 프랑켈과 M. 넬슨에 의해 개발 된 항체 12G10은 NICHD의 후원하에 개발된 개발 연구 하이브리드 종 은행에서 얻어졌고 아이오와 대학에 의해 유지되었습니다.

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<li>Uchimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flipped+ion+pair+at+the+dynein-microtubule+interface+is+critical+for+dynein+motility+and+ATPase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A flipped ion pair at the dynein-microtubule interface is critical for dynein motility and ATPase activation.</a> Journal of Cell Biology. 208 (2), 211-222 (2015).</li>
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<li>Ti, S. C., Alushin, G. M., Kapoor, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+beta-tubulin+isotypes+can+regulate+microtubule+protofilament+number+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Human beta-tubulin isotypes can regulate microtubule protofilament number and stability.</a> Developmental Cell. 47 (2), 175-190 (2018).</li>
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<li>Guedes-Dias, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-3+responds+to+local+microtubule+dynamics+to+target+synaptic+cargo+delivery+to+the+presynapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Kinesin-3 responds to local microtubule dynamics to target synaptic cargo delivery to the presynapse.</a> Current Biology. 29 (2), 268-282 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+dynamic+protein+interactions+involving+human+microtubules+using+solid-state+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Direct observation of dynamic protein interactions involving human microtubules using solid-state NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 18(2020).</li>
<li>Even, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAT1-enriched+vesicles+promote+microtubule+acetylation+via+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">ATAT1-enriched vesicles promote microtubule acetylation via axonal transport.</a> Science Advances. 5 (12), 2705(2019).</li>
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여기에 설명된 방법은 세포주 및 단일 마우스 뇌에서 중량으로 고품질의 조립 능력이 있는 튜룰린을 신속하게 생성하는 플랫폼을 제공한다. 그것은 오랜 년 동안 분야에서 사용되는 소 뇌에서 튜룰린 정제의 금 표준 프로토콜을 기반으로16,17. 접근법의 한 가지 특별한 장점은 HeLa S3 세포의 현탁액 배양을 사용하는 것입니다. 이는 프로토콜이 임의의 세포생물학 실험실에서 비교적 쉽게 수행될 수 있게 하는 반면, 다른 튜룰린 정제방법(18,19,32,37)은 특정 장비와 전문 지식이 필요하며, 따라서 단백질 정제에 대한 강한 배경을 가진 실험실에서 주로 사용된다. 부착 된 세포주에서 소량의 튜룰린을 생산...

마이크로튜브는 많은 세포 프로세스에서 중요한 역할을 합니다. 그(것)들은 세포에게 그들의 모양을 주고, 염색체 분리를 위한 메이오제 및 미토Tic 스핀들을 만들고, 세포내 수송을 위한 트랙역할을 합니다. 이러한 다양한 기능을 수행하기 위해 마이크로 튜버는 다른 방식으로 자신을 구성합니다. 이 분야의 흥미로운 질문 중 하나는 구조적으로 진화적으로 보존된 마이크로투블러가 조직과 기능의 이 과다에 적응할 수 있도록 하는 분자 메커니즘을 이해하는 것입니다. 한 가지 잠재적 메커니즘은'튜룰린코드'1,2,3로알려진 개념에 의해 정의되는 마이크로투부의 다양화이다. tubulin 코드는 두 가지 주요 구성 요소를 포함: α-및 β-tubulin 유전자 제품의 차동 통합 (tubulin 등색형) 마이크로 튜부 및 튜룰린 번역 후 수정 (PTM).
1970년대 부터 진화하는 빛 현미경 기술과 결합된 체외 재헌법 실험은 미세투부의 특성에 대한 중요한 발견의 길을 열어주었습니다: 동적 불안정4 및 러닝머신5,그리고 그들의 다른메커니즘및 기능6,7,7,9,11,12,13, 14,14,15. 지금까지 수행된 거의 모든 체외 실험은 중합및 중합제의 반복주기를 사용하여 뇌 조직에서 정제된튜룰린(tubulin)에기초해 왔다16,17. 뇌 조직에서 정제하는 것은 대량(보통 그램 양)으로 고품질 튜룰린을 얻는 이점을 부여하지만, 뇌 조직에서 정제된 튜룰린이 다른 튜룰린 동종형의 혼합물이며 많은 튜룰린 PTM이 풍부하기 때문에 한 가지 중요한 단점은 이질성입니다. 이러한 이질성은 마이크로튜블러 특성 및 기능의 제어에서 특정 튜룰린 PTM 또는 동소형의 역할을 묘사하는 것을 불가능하게 합니다. 따라서, 조절된 튜룰린 PTM 및 균질동형 조성물을 가진 조립 유능한 튜룰린을 생산하는 것은 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 해결하는 데 필수적이다.
최근에는 효모 Stu2p의 마이크로투블러 결합 TOG(종양 과잉 발현 유전자) 도메인을 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 튜블러린을 정화하는 접근법이개발되었다. 이 방법에서, 세포 또는 조직의 조잡한 용해의 튜룰린은 주어진, 심지어 아주 작은, 샘플의 전체 tubulin 풀의 분석을 허용하는 매트릭스 고정 TOG 도메인에 결합하는 컬럼을 통해 전달된다. 재조합 튜룰린을 정화하기 위한 대망의 접근법도 최근 몇 년 동안 설명되어 있습니다. 그것은 α 및 β-tubulin 유전자를 포함하는 bi-cistronic 벡터가 곤충세포(19)에서발현되는 바쿨로바이러스 시스템을 기반으로 한다. 그러나, 이 방법은 매우 번거롭고 시간이 많이 소요되며, 따라서 주로 체외에서 튜룰린 돌연변이20 및 튜룰린 동소형21,22,23의 충격을 연구하기 위해 사용됩니다.
현재 프로토콜에서, 우리는 잘 확립되고 널리 사용되는 중합체-중합화 접근법을 세포주 또는 마우스 뇌조직(24)으로부터다른 수준의 변형으로 튜룰린을 생성하는 청사진으로 사용하는 방법을 설명한다. 이 절차에서, 튜룰린은 수용성(4°C의 튜룰린 이머)과 중합형(구아노신 5'-triphosphate[GTP]의 존재시 30°C의 마이크로튜블러)를 순환한다. 각 형태는 원심분리의 연속단계를 통해 분리된다: 튜룰린 조광기는 감기(4°C) 스핀 후 상부체에 남아 있는 반면, 마이크로튜부는 30°C에서 펠릿화된다. 더욱이, 하나의 중합 단계는 높은 piperazine-N,N-fis(2-에탄설포닉산) (PIPES) 농도에서 수행되며, 이는 마이크로투부에서 마이크로튜버 관련 단백질을 제거할 수 있게 해주며, 따라서, 최종 적으로 정제된 튜룰린으로부터 수행된다. 정지 또는 부착 배양으로 성장 한 HeLa S3 세포로부터 정제 된 Tubulin은 임의의 튜룰린 PTM이 거의 없으며 최근 시험관 내 재분학 실험25,26,27,28에서사용되어 왔다. 우리는 더 하나의 마우스 뇌에서 튜룰린을 정화하는 방법을 적응했다, 이는 튜룰린 등색형 및 PTM의 변화와 마우스 모델의 큰 숫자에 사용할 수 있습니다.
프로토콜에서, 우리는 먼저 원료의 생성을 설명 (세포 질량 또는 뇌 조직), 그것의 lysis(도 1A),튜룰린 중합 및 비합화의 연속 단계 다음 튜룰린정화(도 1B). 우리는 정제된 튜룰린의순도(도 2A, B)및 수량(도3A, B)을평가하는 과정을 더 설명한다. 상기 방법은 튜룰린정제(도 4B)에앞서 세포내 변형 효소를 과발현함으로써 선택된 PTM으로 농축된 튜룰린을 생성하도록 조정할 수 있다. 대안적으로, 튜룰린 변형 효소는 정화 과정에서 튜룰린에 첨가될 수 있다. 마지막으로, 해당 튜룰린 변형효소(도 4B)29에서부족한 쥐의 뇌로부터 특정 동소형 또는 PTM이 부족한 튜룰린을 정화할 수 있다.
여기서 설명하는 방법에는 두 가지 주요 장점이 있습니다: (i) 비교적 짧은 시간에 충분히 많은 양의 튜룰린을 생산할 수 있으며, (ii) 특정 튜룰린 동형 조성물 또는 PTM을 사용하여 고품질의 순수 튜룰린을 생성합니다. 이 원고의 관련 비디오에서는 이 절차와 관련된 몇 가지 중요한 단계를 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>1&nbsp; M 마그네슘Cl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M1028</td><td></td></tr><tr><td>1-L 세포 배양 용기</td><td>Techne F7610&nbsp;</td><td></td><td>스피너 배양에 사용됩니다. 빈 스피너 병을 저어주지 마십시오. 스피너 병이 세포 배양 인큐베이터에 있을 때는 항상 스피너 병의 측면 밸브를 약간 열어 두어 인큐베이터와 배지의 평형을 용이하게 합니다. 의 분위기. 사용 후에는 병 벽에 남아 있는 세포가 건조되지 않도록 즉시 스피너 병에 수돗물을 채우십시오. 탈이온수로 병을 씻고 약 200ml의 탈이온수와 오토클레이브를 추가합니다. 멸균 세포 배양 후드 아래에서 물을 제거하고 젖병을 후드 아래에서 몇 시간 동안 완전히 건조시킵니다. 미량의 세제는 세포에 해로울 수 있으므로 스피너 병을 청소할 때 세제를 사용하지 마십시오.</td></tr><tr><td>1.5-및 2-ml 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml 라운드-바닥 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-cm 직경의 멸균 배양 용기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15-ml 나사-캡 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>#M3148</td><td>2-메르캅토에탄올은 독성이 있으므로 후드 아래에서 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td>4-(2-아미노에틸)-벤젠설포닐 플루오라이드&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#A8456</tr><tr><td>40% 아크릴아미드&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td>#161-0140</td><td></td></tr><tr><td>5-, 10- 20-ml 주사기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-ml, 10-ml, 25-ml 멸균 피펫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50-ml 나사-캡 튜브</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>암모늄 퍼설페이트 (APS)</td><td>Sigma</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>항-알파-튜불린 항체, 12G10&nbsp;</td><td>J. Frankel과 M. Nelson에 의해 개발되었으며, Developmental Studies Hybridoma Bank에서 획득하였으며, NICHD의 후원 하에 개발되었으며, 아이오와 대학에 의해 유지되고 있습니다</td><td>. 희석: 1/500</td>Anti-glutamylated tubulin antibody, GT335&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td>아디포젠&nbsp;</td><td>#AG-20B-0020</td><td>희석: 1/20,000</td></tr><tr><td>아프로티닌&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#A1153</tr><tr><td>밸런스 (0.1 &ndash; 10 g)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman 1-l 폴리프로필렌 병&nbsp;</td><td></td><td></td><td>스피너 배양 수집용</td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-26 XP 원심분리기</td><td></td><td></td><td>스피너 배양 수집용</td></tr><tr><td>생물학적 교반기&nbsp;</td><td>테크네 MCS-104L&nbsp;</td><td></td><td>세포 배양 인큐베이터에 설치됨 (스피너 배양용), Hela S3 및 HEK 293 세포용 25 rpm</td></tr>, <tr><td>Bis N,N'-Methylene-Bis-Acrylamide&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td>#161-0201</td><td></td></tr><tr><td>블렌더 IKA Ultra-Turrax&reg; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>뇌 조직을 용해하려면 기계를 전력 6 또는 7로 설정하고 5mm 프로브를 사용하십시오. 얼음 위에서 15초 동안 뇌 조직을 2-3회 블렌딩합니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#A7906</tr><tr><td>브로모페놀 블루&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>#1.08122</td><td></td></tr><tr><td>카르복시펩티다아제 A (CPA)</td><td>시그마</td><td>#C9268</td><td>농도: 1.7&nbsp; U/&마이크로; l</td></tr><tr><td>세포 배양 후드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 배양 인큐베이터는 37 °C로 설정되었습니다. C, 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>&nbsp; 시그마&nbsp;</td><td>#D8418</td><td>DMSO는 다른 화합물의 세포 및 피부 투과성을 향상시킬 수 있습니다. 접촉을 피하고 피부와 눈 보호구를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>DMEM 매체&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>#41965062</td><td></td></tr><tr><td>DTT, DL-디티오트레이톨&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#D9779</tr><tr><td>EDTA</td><td>Euromedex</td><td>#EU0007-C</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#E3889</tr><tr><td>에탄올 절대&nbsp;</td><td>피셔 케미컬&nbsp;</td><td>#E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 세럼 (FBS)</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#F7524</tr><tr><td>프렌치 압력 셀 프레스&nbsp;</td><td>Thermo electron Corporation</td><td>&nbsp;#FA#FA-032 셀을 갖춘 -078A</td><td>; 많은 양의 셀을 용해합니다. 중간 비율로 설정하고 게이지 압력은 1,000psi(디스커디션 챔버 내부의 3,000psi에 해당)로 설정합니다.</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>&nbsp; VWR 화학&nbsp;</td><td>#24388.295</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마</td><td>#G8898</td><td></td></tr><tr><td>GTP&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#G8877</tr><tr><td>가열 블록&nbsp;</td><td>스튜어트&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#SBH130D 헬라 세포&nbsp;</td><td></td><td>ATCC&reg; CCL-2&무역;</td><td></td></tr><tr><td>헬라 S3 세포&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC&reg; CCL-2.2&거래;</td><td></td></tr><tr><td>염산 (HCl)</td> <td>VWR</td> <td># 20252.290</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경&nbsp;</td><td></td><td></td><td>형광으로 세포 형질주입이 검증되어야 하는 경우</td></tr><tr><td>이소프로판올&nbsp;</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>#20842.298</td><td></td></tr><tr><td>jetPEI</td><td>폴리플러스&nbsp;</td><td>#101</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 로터&nbsp;</td><td></td><td></td><td>스피너 배양 수집을 위해</td></tr><tr><td>KOH&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>#P1767</td><td>KOH는 부식성이 있으며 화상을 유발할 수 있으므로 눈과 피부를 보호하십시오.</td></tr><tr><td>L-글루타민&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>#25030123</td><td></td></tr><tr><td>50-ml 튜브용 실험실용 원심분리기</td><td>Sigma</td><td>4-16 K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>루펩틴&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#L2884</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로-피펫 p2.5, p10, p20, p100, p200 및 p1000 및 해당 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로페슬</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120.973</td><td></td></tr><tr><td>마우스 뇌 조직&nbsp;</td><td></td><td></td><td>이 연구를 위한 동물 관리 및 사용은 유럽 공동체(2010/63/UE)의 권고에 따라 수행되었습니다. 실험 절차는 국제 지침에 따라 Institut Curie CEEA-IC #118(국가 기관에서 부여한 인증 번호 04395.03)의 윤리 위원회에서 특별히 승인했습니다.</td></tr><tr><td>바늘 18G x 1 &frac12; &rdquo; (1.2 X 38 밀리미터</td><td>테루모</td><td>#18G</td><td></td></tr><tr><td>바늘 20G x 1 &frac12; &rdquo; (0.9 X 38 밀리미터</td><td>테루모</td><td>#20G</td><td></td></tr><tr><td>바늘 21G x 4 &frac34; &rdquo; (0.8 X 120 밀리미터</td><td>B.Braun</td><td>#466 5643</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>#14190169</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지&nbsp;</td><td>#15140130</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>시그마&nbsp;</td><td>#P7626</td><td>PMSF 분말은 위험합니다. PMSF 용액을 준비할 때 피부와 눈 보호구를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>파이프&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#P6757</tr><tr><td>피펫 보이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>로터</td><td>Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; 및 TLA 55</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE 전기영동 장비&nbsp;</td><td>바이오 라드&nbsp;</td><td></td><td></td>#1658001FC</tr><tr><td>SDS, 나트륨 도데 실 설페이트&nbsp;</td><td>폭스바겐&nbsp;</td><td>#442444H</td><td>Laemmeli 완충액 준비용&nbsp;</td></tr><tr><td>SDS, 나트륨 도데 실 설페이트&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td>#L5750</td><td>'TUB' SDS-PAGE 젤 제조용</td></tr><tr><td>Sonicator&nbsp;</td><td>Branson</td><td>#101-148-070</td><td>부착 배양으로 성장한 세포를 용해하는 데 사용됩니다. 직경 6.5mm 프로브를 사용하여 초음파 발생기를 " 출력 제어" 1, " 듀티 사이클" 10% 및 사용된 셀 유형에 따라 시간이 달라집니다.</td></tr><tr><td>1.5 ml 튜브용 탁상용 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>테메드, N, N, N&프라임;, N&프라임;-테트라메틸에틸렌디아민&nbsp;</td><td>시그마</td><td>#9281</td><td></td></tr><tr><td>트리코스타틴 A (TSA)</td><td>시그마</td><td>#T8552</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100&nbsp;</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#T9284</tr><tr><td>트리즈마 베이스 (트리스)</td><td>시그마&nbsp;</td><td></td><td></td>#T1503</tr><tr><td>트립신&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#15090046</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기 로터&nbsp;</td><td></td><td>TLA-55, TLA-100.3 및 70.1 Ti 로터는</td><td>4°C로 설정됩니다. C 또는 30°C; C 실험의 필요성에 따라&nbsp;</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>베크먼</td><td>#357448&nbsp;</td><td>TLA-55 로터와 함께 사용</td></tr><tr><td>초원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>TLA-100.3 로터</td>초원심분리기 튜브와 함께 사용하기 위한 <td>Beckman</td><td>#349622</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>베크먼</td><td>#355631&nbsp;</td><td>70.1 Ti 로터와 함께 사용</td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Optima L80-XP (또는 동급) 및 Optima MAX-XP (또는 동급)</td><td>는 4°C로 설정; C 또는 30°C; C 실험의 필요성에 따라&nbsp;</td></tr><tr><td>Vortex 믹서</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 욕조에는 플로터 또는 튜브 홀더</td><td></td><td></td>가 장착되어 <td>있으며 30°C로 설정됩니다. 씨&nbsp;</td></tr></tbody></table>

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

미세 투외 세포 골격의 연구의 한 가지 중요한 측면은 체외 재구성 실험에서 미세 tubule 행동의 조사입니다. 그(것)들은 역학과 같은 microtubules의 본질적인 속성의 분석및 microtubule 관련 단백질 (MAPs)와의 상호 작용을 허용합니다. "tubulin 코드"는 마이크로 튜블러 특성 및 기능의 조절자로서 다양한 튜룰린 동종 형 및 다양한 번역 후 변형 (PTM)을 가리키는 새로운 개념입니다. 튜룰린 코드의 분자 메커니즘을 탐구하려면 특정 동종 및 PTM을 사용하여 정제 된 튜룰린을 사용하여 체외 재구성 실험을 수행하는 것이 중요합니다.
현재까지, 이것은 널리 체외 실험에서 사용되는 뇌 튜룰린으로 기술적으로 도전했다, 많은 PTM을 항구하고 정의 된 동종 조성을 가지고. 따라서, 우리는 중합 및 비합화 주기의 고전적인 접근 방식을 사용하여, 다른 소스와 다른 등류 조성 및 제어 된 PTM로 튜룰린을 정화하기 위해이 프로토콜을 개발했다. 선호도 정화에 기초한 기존 방법에 비해, 이러한 접근법은 중합또는 중합화에 내성이 있는 튜룰린이 연속정화 단계에서 버려짐에 따라 순수하고 중합화능력이 있는 튜룰린을 산출한다.
우리는 현탁액또는 부착 배양으로 성장한 세포주에서 튜룰린의 정제를 설명하고 단일 마우스 뇌에서 설명합니다. 이 방법은 먼저 서스펜션 및 부착 설정 모두에서 세포 질량의 생성을 설명하고, 용해 단계, 중합-폴리머화 주기에 의한 튜룰린 정화의 연속적인 단계를 설명한다. 우리의 방법은 관련 단백질과의 마이크로 튜부 및 마이크로 튜블러 상호 작용의 본질적인 특성에 대한 튜룰린 코드의 영향을 다루는 실험에 사용할 수있는 tubulin을 산출합니다.

이 방법의 주요 목표는 정제 된 구성 요소와 함께 반복 된 체외 실험을 수행하기에 충분한 수량으로 고품질의 조립 능력이있는 튜룰린을 생산하는 것입니다. 이 튜룰린에서 조립된 마이크로튜블러는 동적 또는 안정적인 마이크로튜부를 이용한 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경 기술, 미세투부역학, MAP 또는 분자 모터와의 상호 작용 및모터(25)에의한 힘 발생을 테스트하는 실험에서 재구성 된 해석에 사용될 수 있다. 그들은 또한 마이크로 튜블러-MAP 공동 펠릿 분석 및 고체 상태 NMR 분광법28에서사용할 수 있습니다.
정화 공정 전반에 걸쳐 튜룰린의 농축및 순도는 쿠마시 염색 된 SDS-폴리 아크라이알라미드 젤 전기 포근 (PAGE) 젤을 사용하여 모니터링 할 수 있으며, 바람직하게는 'TUB' SDS-PAGE 젤을 사용하여 단일 반밴드로 공동 이동하는 α 및 β 튜룰린의<sup class="xre...

이 프로토콜은 중합 및 중합 주기를 사용하여 배양 된 세포 또는 단일 마우스 뇌와 같은 중소 규모의 소스에서 튜룰린 정제를 설명합니다. 정제 된 튜룰린은 특정 동종형으로 풍부해지거나 특정 번역 후 변형을 가지며 체외 재관체 검사에서 미세 tubule 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

이 방법을 사용하면 전체 시험관 실험 세트를 수행하기에 충분한 양으로 정의된 번역 후 변형을 가진 순수한 조립 가능한 튜불린을 생성할 수 있습니다. 튜불린 중합 및 탈중합 주기를 기반으로 하는 이 프로토콜은 모든 세포 생물학 실험실에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 그것은 매우 적은 수작업 시간으로 충분한 양의 튜불린을 생성할 수 있습니다.현탁액 배양액에서 튜불린을 정제하기 위해 튜불린 전처리 9일 전에 원하는 세포 유형을 되살리고 증폭하여 6개의 15cm 접시가 합류합니다. 튜불린 준비 8일 전에 세포 배양 캐비닛 아래의 접시당 모든 스피너 병에 1리터의 예열 배지를 추가하고 세포 배양 인큐베이터 내부의 교반 테이블에 스피너를 놓습니다. 매체가 인큐베이터의 대기와 평형을 이룰 수 있도록 측면 스피너 캡을 약간 열어 두십시오.다음날, Confluent Dish의 세포를 사용하여 스피너 병에 접종합니다. 스피너 병을 측면 밸브를 약간 연 상태에서 일주일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포를 수확하려면 스피너 병의 배양물을 1리터 원심분리기 병으로 옮기고 원심분리로 세포를 수집합니다.각 펠릿을 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하고 재현탁 세포를 50ml 튜브에 모아 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 10 밀리리터 세포 펠릿의 경우, 10 밀리리터의 용해 완충액을 펠릿에 첨가하고, 튜브를 여러 번 반전시켜 세포를 다시 현탁시킵니다. 부착 세포 배양에서 튜불린을 정제하려면 원하는 세포 유형을 되살리고 증폭하여 튜불린 준비 당일에 10개의 15cm 접시가 합류하도록 합니다.부착 세포를 채취하려면 한 번에 3개의 접시를 처리하여 배양 접시를 기울여 배지를 제거하는 동안 두 번째 사람이 7ml의 PBS-EDTA로 세포를 부드럽게 세척합니다. 세척 후, 두 번째 사람은 접시당 5ml의 PBS-EDTA로 세포를 처리한 후 세 번째 사람이 세포 리프터를 사용하여 세포를 접시의 한쪽 가장자리로 부드럽게 밀어 넣도록 해야 합니다. 세포가 분리되면 세 접시 모두의 세포를 얼음 위의 50ml 튜브에 모으고 각 플레이트에 2ml의 PBS-EDTA를 추가로 헹구어 남은 세포를 수집합니다.원심분리로 세포를 채취한 후 상등액을 버리고 세포 펠릿의 부피를 측정합니다. 용해 완충액을 추가하고 세포를 다시 현탁시킨 다음 14ml 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 약 45 펄스로 세포를 초음파 처리합니다.쥐의 뇌 용해를 위해 성체 쥐에서 채취한 단일 뇌에 500마이크로리터의 허가된 완충액을 추가하고 조직 블렌더를 사용하여 조직을 용해합니다. 부피의 1/100에서 2X Laemmli 완충액과 동일한 부피로 용해물을 얻은 후 용액을 5 분 동안 끓입니다. 정량화될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.튜불린 준비의 각 단계에서 이러한 방식으로 샘플을 수집합니다. 용해물을 정화하려면 샘플을 원심분리하고 긴 바늘을 사용하여 투명한 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 상부 부유층을 피하도록 주의하십시오. 용해물 정화 후에, 상등액에 있는 뜨 물자를 제거하는 것은 근본적입니다, 그렇지 않으면 tubulin 정화의 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.정화된 용해물에서 튜불린을 중합하려면 적절한 크기의 튜브에 상층액 1의 전체 부피와 0.2몰 GTP의 1/200 부피 및 따뜻한 글리세롤 절반 부피를 혼합합니다. 혼합물을 부드럽게 피펫으로 만들고 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 섭씨 30도의 수조에 20분 동안 넣습니다.원심분리 후 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿 2에 존재하는 미세소관을 탈중합하려면 펠릿을 얼음 위에서 5분 동안 얼음처럼 차가운 BRB 80에 재현탁합니다. 먼저 P1000 피펫으로 샘플을 피펫팅한 다음 P200 파이펫으로 얼음 위에서 20분 동안 5분마다 피펫팅합니다.샘플이 균질해지면 원심분리하고 얻어진 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 튜불린에서 미세소관 관련 단백질을 제거하려면 전체 부피의 상등액 3을 동일한 부피의 예열된 1대몰 파이프 S, 동일한 부피의 예열된 글리세롤 및 1/100 부피의 0.2몰 GTP와 혼합합니다. 원심분리하기 전에 섭씨 30도에서 20분 동안 혼합물을 배양합니다.미세소관 관련 단백질 함유 상등액 4를 새 튜브로 옮기고, 펠릿에는 중합된 미세소관이 포함되어 있습니다. 세 번째 중합 및 탈중합을 수행한 후, 수확된 튜불린의 양은 SDS 페이지 분석을 통해 정량화할 수 있습니다. 정제 공정의 성공 여부는 Coomassie 염색 SDS 페이지에서 확인할 수 있습니다.정제된 튜불린의 수율이 예상보다 낮은 것은 두 번째, 네 번째 및 여섯 번째 펠릿 분획에서 더 적은 양의 튜불린과 두 번째, 네 번째 및 여섯 번째 상등액 분획에서 더 많은 양에 의해 입증된 바와 같이 비효율적인 튜불린 중합 때문일 수 있습니다. 정제된 튜불린을 정량화하기 위해 샘플을 알려진 수량의 소 혈청 알부민 옆에서 실행할 수 있습니다. 그런 다음 단백질 밴드의 정량적 밀도 측정을 통해 정제된 튜불린의 양을 계산할 수 있습니다.튜불린의 변형 상태는 샘플의 면역 블롯 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 제어된 번역 후 변형(post-translational modification)으로 튜불린을 분리할 수 있습니다. 이 튜불린을 사용하면 튜불린 변형이 미세관 특성과 미세소관 관련 단백질과의 상호 작용에 미치는 영향을 결정할 수 있는 체외 재구성 실험을 설정할 수 있습니다.

purification-tubulin-with-controlled-posttranslational-modifications

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

이 프로토콜의 목표는 DNA 종이 접기 나노 구조에 분자 모터의 앙상블을 형성하고 총 내부 반사 형광 현미경을 사용하여 앙상블 운동성을 관찰하는 것입니다.

단일 분자 관찰을 위한 DNA 종이 접기 나노 구조에 다인 및 키네신 모터 앙상블 생산

이 프로토콜의 목표는 온도를 사용하여 3차원 활성 유체의 유속을 제어하는 것입니다. 이 방법의 장점은 현장에서 유속을 조절할 수 있을 뿐만 아니라 주기적으로 유속을 위아래로 조정하는 것과 같은 동적 제어를 가능하게 합니다.

온도를 이용한 미세소관 기반 3D 활성 유체의 유속 제어

튜불린 중합체인 미세소관은 진핵 세포에서 세포골격 구성 요소로서 중요한 역할을 하며 동적 불안정성으로 알려져 있습니다. 본 연구는 다양한 마우스 조직에서 미세소관의 안정성을 평가하기 위해 미세소관을 분류하여 안정 미세소관, 불안정한 미세소관, 유리 튜불린으로 분리하는 방법을 개발하였다.

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

이 기사에서는 간단하고 혁신적인 2차 고조파 생성 현미경 접근 방식을 통해 세뇨관병증 모델에서 미세소관 로딩 희소돌기아교세포를 검출하는 프로토콜을 제시합니다.

중심 미엘린의 튜불린 의존성 결함 연구를 위한 무표지 비선형 광학

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

여기에는 단백질 준비 및 구성과 활성 네마틱 감금을위한 우물 사용을 포함하여 미세 소관 및 키네신 모터에서 활성 네마틱스를 준비하는 방법이 제시됩니다.

미세소관 기반 활성 네마틱스의 형성, 제한 및 관찰

이 프로토콜은 소규모 기기에 최적화된 돼지 뇌에서 튜불린을 고수율로 분리하는 기술을 설명합니다. 분리 절차는 동시 침강 분석 및 투과 전자 현미경을 사용하여 시험관에서 튜불 린 중합 활성을 측정하는 절차로 보완됩니다.

돼지 뇌 조직에서 Tubulin 수율 최적화

여기에서 우리는 특정 미세소관 변형 효소가 부족하거나 포함할 수 있는 포유류 세포에서 내인성 튜불린을 추출하여 특정 변형을 위해 풍부한 미세소관을 얻는 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 추출된 미세소관을 정제된 미세소관 결합 단백질로 장식하여 초저온 전자 현미경을 위한 그리드를 준비하는 방법을 설명합니다.

초저온 전자 현미경으로 미세소관-단백질 복합체를 연구하기 위해 포유류 세포에서 변형된 미세소관 추출

학습하세요 중합-비합화 주기를 이용한 투불린 정화 방법으로, 배양 세포나 마우스 뇌에서 순수하고 조립 가능한 투불린을 얻어 미세소관 역학 및 상호작용 연구에 활용할 수 있습니다.

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

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