중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

이 방법을 사용하면 전체 시험관 실험 세트를 수행하기에 충분한 양으로 정의된 번역 후 변형을 가진 순수한 조립 가능한 튜불린을 생성할 수 있습니다. 튜불린 중합 및 탈중합 주기를 기반으로 하는 이 프로토콜은 모든 세포 생물학 실험실에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 그것은 매우 적은 수작업 시간으로 충분한 양의 튜불린을 생성할 수 있습니다.

현탁액 배양액에서 튜불린을 정제하기 위해 튜불린 전처리 9일 전에 원하는 세포 유형을 되살리고 증폭하여 6개의 15cm 접시가 합류합니다. 튜불린 준비 8일 전에 세포 배양 캐비닛 아래의 접시당 모든 스피너 병에 1리터의 예열 배지를 추가하고 세포 배양 인큐베이터 내부의 교반 테이블에 스피너를 놓습니다. 매체가 인큐베이터의 대기와 평형을 이룰 수 있도록 측면 스피너 캡을 약간 열어 두십시오.

다음날, Confluent Dish의 세포를 사용하여 스피너 병에 접종합니다. 스피너 병을 측면 밸브를 약간 연 상태에서 일주일 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 세포를 수확하려면 스피너 병의 배양물을 1리터 원심분리기 병으로 옮기고 원심분리로 세포를 수집합니다.

각 펠릿을 10ml의 얼음처럼 차가운 PBS에 재현탁하고 재현탁 세포를 50ml 튜브에 모아 섭씨 4도에서 원심분리합니다. 10 밀리리터 세포 펠릿의 경우, 10 밀리리터의 용해 완충액을 펠릿에 첨가하고, 튜브를 여러 번 반전시켜 세포를 다시 현탁시킵니다. 부착 세포 배양에서 튜불린을 정제하려면 원하는 세포 유형을 되살리고 증폭하여 튜불린 준비 당일에 10개의 15cm 접시가 합류

부착 세포를 채취하려면 한 번에 3개의 접시를 처리하여 배양 접시를 기울여 배지를 제거하는 동안 두 번째 사람이 7ml의 PBS-EDTA로 세포를 부드럽게 세척합니다. 세척 후, 두 번째 사람은 접시당 5ml의 PBS-EDTA로 세포를 처리한 후 세 번째 사람이 세포 리프터를 사용하여 세포를 접시의 한쪽 가장자리로 부드럽게 밀어 넣도록 해야 합니다. 세포가 분리되면 세 접시 모두의 세포를 얼음 위의 50ml 튜브에 모으고 각 플레이트에 2ml의 PBS-EDTA를 추가로 헹구어 남은 세포를 수집합니다.

원심분리로 세포를 채취한 후 상등액을 버리고 세포 펠릿의 부피를 측정합니다. 용해 완충액을 추가하고 세포를 다시 현탁시킨 다음 14ml 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 약 45 펄스로 세포를 초음파 처리합니다.

쥐의 뇌 용해를 위해 성체 쥐에서 채취한 단일 뇌에 500마이크로리터의 허가된 완충액을 추가하고 조직 블렌더를 사용하여 조직을 용해합니다. 부피의 1/100에서 2X Laemmli 완충액과 동일한 부피로 용해물을 얻은 후 용액을 5 분 동안 끓입니다. 정량화될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

튜불린 준비의 각 단계에서 이러한 방식으로 샘플을 수집합니다. 용해물을 정화하려면 샘플을 원심분리하고 긴 바늘을 사용하여 투명한 상층액을 새 튜브로 조심스럽게 옮기고 상부 부유층을 피하도록 주의하십시오. 용해물 정화 후에, 상등액에 있는 뜨 물자를 제거하는 것은 근본적입니다, 그렇지 않으면 tubulin 정화의 효율성에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.

정화된 용해물에서 튜불린을 중합하려면 적절한 크기의 튜브에 상층액 1의 전체 부피와 0.2몰 GTP의 1/200 부피 및 따뜻한 글리세롤 절반 부피를 혼합합니다. 혼합물을 부드럽게 피펫으로 만들고 기포가 유입되지 않도록 주의하십시오. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 섭씨 30도의 수조에 20분 동안 넣습니다.

원심분리 후 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 펠릿 2에 존재하는 미세소관을 탈중합하려면 펠릿을 얼음 위에서 5분 동안 얼음처럼 차가운 BRB 80에 재현탁합니다. 먼저 P1000 피펫으로 샘플을 피펫팅한 다음 P200 파이펫으로 얼음 위에서 20분 동안 5분마다 피펫

샘플이 균질해지면 원심분리하고 얻어진 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 튜불린에서 미세소관 관련 단백질을 제거하려면 전체 부피의 상등액 3을 동일한 부피의 예열된 1대몰 파이프 S, 동일한 부피의 예열된 글리세롤 및 1/100 부피의 0.2몰 GTP와 혼합합니다. 원심분리하기 전에 섭씨 30도에서 20분 동안 혼합물을 배양합니다.

미세소관 관련 단백질 함유 상등액 4를 새 튜브로 옮기고, 펠릿에는 중합된 미세소관이 포함되어 있습니다. 세 번째 중합 및 탈중합을 수행한 후, 수확된 튜불린의 양은 SDS 페이지 분석을 통해 정량화할 수 있습니다. 정제 공정의 성공 여부는 Coomassie 염색 SDS 페이지에서 확인할 수 있습니다.

정제된 튜불린의 수율이 예상보다 낮은 것은 두 번째, 네 번째 및 여섯 번째 펠릿 분획에서 더 적은 양의 튜불린과 두 번째, 네 번째 및 여섯 번째 상등액 분획에서 더 많은 양에 의해 입증된 바와 같이 비효율적인 튜불린 중합 때문일 수 있습니다. 정제된 튜불린을 정량화하기 위해 샘플을 알려진 수량의 소 혈청 알부민 옆에서 실행할 수 있습니다. 그런 다음 단백질 밴드의 정량적 밀도 측정을 통해 정제된 튜불린의 양을 계산할 수 있습니다.

튜불린의 변형 상태는 샘플의 면역 블롯 분석을 통해 확인할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 제어된 번역 후 변형(post-translational modification)으로 튜불린을 분리할 수 있습니다. 이 튜불린을 사용하면 튜불린 변형이 미세관 특성과 미세소관 관련 단백질과의 상호 작용에 미치는 영향을 결정할 수 있는 체외 재구성 실험을 설정할 수 있습니다.