Name: 유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 TGF-β 신호 및 상피-중간엽 전환(EMT) 연구 방법을 NMuMG 세포를 이용하여. 웨스턴 블롯, 루시퍼라제 분석, qPCR, 면역형광 염색 기법을 활용한 포괄적인 실험 프로토콜입니다.

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우리는 J.Z. 및 암 유전체학 센터 네덜란드 (CGC)에 중국 장학금 위원회 (CSC)의 지원을 인정합니다. NL) to P.t.D.

1. 서양 블로팅을 사용하여 TGF β 유도 SMAD2 인산화 분석
참고: 선하성 인간 유방 MCF10A-Ras 세포는 TGF-β 신호 반응을 조사하는 예로 사용되었다33. 원칙적으로, 아래에 설명된 방법은 다른 TGF-β 반응형 세포주에도 적용됩니다.
<ol><li>덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)/F12에서 37°C에서 유방 상피 세포주 MCF10A-Ras를 배양하여 5%의 말 세럼을 함유하고 있는 L-글루타민을 함유하고, 20 ng/mL 표피 성장 인자 (EGF), 10 mg/mL 인슐린, 100 ng/mL 콜레라 엔테토톡신, 0.5 mg/mL 하이드로코르티손, 1:100 페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep).</li>
	<li>1 분 동안 0.25 % 트립신-EDTA의 1 mL로 MCF10A-Ras 세포를 트립시니징하고 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포를 계산합니다.</li>
	<li>5×105 세포의 밀도로 6 웰 플레이트로 종자 세포/ 잘.</li>
	<li>하룻밤 동안 성장한 후, TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% 지방산 이없는 소 세럼 알부민(BSA))로 세포를 치료한 다음 배양 배지를 제거하고 인산염 완충식 염수(PBS)의 1mL로 두 번 부드럽게 세척한다.</li>
	<li>얼음에 6웰 플레이트에 식힌 세포를 식히고 프리쿨드 무선 면역 강수량 분석(RIPA) 용해 버퍼(150mM NaCl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1% SDS, 50m Tris-HCls-HClpH PH pH 8, 50m TCls-HClpPH pH pH 8,0.0, 감산 제고)의 150 μL을 첨가합니다. 용해가 얼음위를 10분 동안 진행할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>플라스틱 셀 스크레이퍼를 사용하여 고추 세포를 긁어 낸 다음 셀 현탁액을 미리 냉각 된 미세 원심 분리기 튜브로 부드럽게 옮기십시오.</li>
	<li>원심분리기 세포는 4°C에서 150 원심력(xg)에서10분 동안 용액을 분리하고 상피관을 신선한 1.5mL 미세원심분리기로 이송한다.</li>
	<li>세제 호환(DC) 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	<li>각 시료로부터 단백질 30 μg를 10% 나트륨 도데실 황산폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(SDS-PAGE) 젤에 적재하고 1.5-2시간 동안 100V의 전압으로 젤을 실행한다.</li>
	<li>1-1.5시간 동안 110V의 전압으로 젤에서 45μm 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달한다.</li>
	<li>PVDF 멤브레인을 단백질 측(젤을 향하고 있던 측)을 가진 적절한 용기로 옮기고, 증류수에서 멤브레인을 잠시 헹구는다.</li>
	<li>물을 버리고 Ponceau S 용액을 추가하고 멤브레인을 흔들 플랫폼에 1-2 분 동안 놓습니다.</li>
	<li>신속하게 헹구고 1 분 동안 세척하여 증류수로 멤브레인을 염색하십시오.</li>
	<li>그런 다음 PVDF 멤브레인을 라이트 박스에 넣고 사진을 찍어 동일한 총 단백질 로딩을 확인합니다.</li>
	<li>Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl 및 0.1 % Tween 20)로 트리스 버퍼식 식염수로 멤브레인을 세척하여 눈에 띄는 염색이 없을 때까지 막을 씻으하십시오.</li>
	<li>멤브레인을 블로킹 버퍼(TBST 용액의 탈지 우유 5%)에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>TBST로 멤브레인을 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>인-SMAD2(p-SMAD2; 1:1000, 홈메이드 34),총 SMAD2/3 1:1000 및 글리세랄데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH; 1:1000)에 대한 1차 항체로 멤브레인을 4°C에서 하룻밤 사이에 배양한다.</li>
	<li>TBST로 멤브레인을 두 번 세척하고 2 시간 동안 토끼 또는 마우스 (1:5000)에 대한 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.</li>
	<li>웨스턴 ECL 기판으로 PVDF 멤브레인을 30초 동안 배양하고 이미징 시스템을 사용하여 신호를 감지합니다.</li>
	<li>생물학적 삼중 생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다.</li>
</ol>2. TGF-β 유도SMAD3 의존적 전사 반응 분석
<ol><li>SMAD3/SMAD4 의존CAGA12-luciferase 전사 기자 분석 작업을 수행합니다.<ol>
<li>1단계에서 설명된 바와 같이 MCF10A-Ras 세포를 배양하고 트립시니화합니다. 5×104 세포/웰에서 24웰 플레이트로 세포를 종자 세포와 세포가 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>시드 후, TGF-β/SMAD3-유도가능(CAGA) 12루시파아제 전사 기자의100 ng와 각각 의 세포를 폴리에틸렌민(PEI)을 이용한 β-갈라토시다제 발현 구조의35 및 80 ng를 구성한다. β 갈라콘토시다아제의 트랜스페싱은 서로 다른 우물 간의 트랜스포션 효율의 차이를 정상화하는 데 사용됩니다. 삼중으로 모든 실험 그룹을 설정합니다.</li>
		<li>24시간 의 배양 후 혈청이 없는 DMEM-높은 포도당을 가진 세포를 굶주리고, 6시간 후에는 TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)를 세포에 차량 제어로 첨가한다.</li>
		<li>또 다른 24 시간 의 배양 후, 미리 따뜻해진 PBS로 두 번 세포를 씻으시다.</li>
		<li>120 μL/잘 1× 용해 버퍼를 넣고 4°C에서 20분간 부드럽게 흔들어 줍니다.</li>
		<li>30 μL의 용액을 96웰의 흰색 분석 마이크로플레이트의 각 웰에 전송하여 발광계를 사용하여 루시파아제 활성을 측정합니다.</li>
		<li>β-갈라코시다제 활성을 측정하기 위해 96웰투명 플레이트의 각 웰에 50 μL의 lysate를 전송합니다.</li>
		<li>β-갈라콘토시다아제 활성으로 루시파라제 활성을 정상화하고 생물학적 삼중생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 사용하여 TGF-β 표적 유전자의 발현을 분석한다.<ol>
<li>1단계에서 설명된 바와 같이 MCF10A-Ras 세포를 배양하고 트립시니화합니다. 5×105 세포 /웰에서 6 웰 플레이트로 세포를 종자 세포와 세포가 하룻밤 동안 부착 할 수 있습니다.</li>
		<li>TGF-β(5 ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)를 6시간 동안 처리한 다음 PBS 1mL로 두 번 세포를 세척합니다.</li>
		<li>RNA 격리 키트를 사용하여 총 RNA를 분리합니다.</li>
		<li>나노드롭을 사용하여 RNA 농도를 결정하고 제1 가닥 cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA 1 μg로 cDNA 합성을 수행한다.</li>
		<li>실시간 PCR 검출 시스템을 사용하여 GAPDH를 위한 특정 인간 전방 및 역 프라이머를 포함하는 10μL 반응 혼합물에서 10배 희석 된 cDNA를 가진 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 수행하십시오(정규화용), SERPINE1(PAI-1 단백질, TGF-β/SMAD 표적 유전자) ,SMAD7(TGF β-β/SMAD 표적 유전자)를 포함한다. 삼중으로 모든 실험 그룹을 설정합니다. 참고: qRT-PCR에서 표적 인간 유전자를 검출하는 데 사용되는 프라이머 서열은 표 1에나열됩니다.</li>
		<li>다음 qPCR 반응 조건을 사용하십시오: 초기화, 3분 동안 95°C; 10초 동안 95°C; 어닐링, 60°C 30초; 및 확장, 10초 동안 80°C; 데니션, 어닐링 및 확장은 40회 반복된다.</li>
		<li>생물학적 삼중 생물을 얻기 위해 적어도 세 번 실험을 반복한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. TGF β 유도 EMT의 분석
<ol><li>서양 블로팅을 사용하여 단백질 수준에서 EMT 마커의 발현을 분석합니다. 참고: TGF-β 유도 된 EMT의 분석은 마우스 NMuMG 상피 세포를 예로 사용하여36,37을나타내고 있다.<ol>
<li>배양 NMuMG 세포는 DMEM-높은 포도당 배지에서 37°C에서 10% 태아 소 혈청과 1:100 펜-스트렙으로 보충하였다. 단백질 절연 및 검출을 위해 1단계에서 설명된 방법을 사용합니다. 참고: 다음 항체는 이 실험에서 사용됩니다: E-cadherin, 1:1000; N-카데린, 1:1000; 달팽이, 1:1000; 슬러그, 1:1000; 튜부린, 1:1000(그림 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2단계에 설명된 바와 같이 정량적 실시간 PCR을 사용하여 mRNA 수준에서 EMT 마커의 발현을 분석한다. 참고: CDH1(E-cadherin 단백질 인코딩), 달팽이 및 ZEB2(그림 3)를포함한 qRT-PCR에 사용되는 모든 마우스 프라이머가 표 1에나열되어 있다.</li>
	<li>간접 면역 형광 및 직접 형광 염색을 사용하여 EMT 공정을 분석합니다.<ol>
<li>E-카데린의 간접 면역 형광 염색<ol>
<li>멸균 18mm 사이드 스퀘어 글래스 커버립을 6웰 플레이트(웰당 1개의 커버슬립)에 놓습니다.</li>
			<li>종자 1×105 NMuMG 세포는 6웰 플레이트 당 완전한 DMEM2 mL을 가지고 있으며 세포가 하룻밤 동안 부착할 수 있도록 합니다.</li>
			<li>부착 셀이 있는 커버립을 새로운 6웰 플레이트로 부드럽게 이동하고 우물에 배양 배지 2mL을 추가합니다.</li>
			<li>2일 동안 TGF-β(5ng/mL) 또는 리간드 버퍼(4mM HCl, 0.1% BSA)로 세포를 치료한다.</li>
			<li>배양 배지를 제거하고 예동 PBS 1mL로 셀을 두 번 부드럽게 씻으십시오.</li>
			<li>4% 파라포름알데히드의 1mL을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 수정합니다. 그런 다음 PBS 1mL로 셀을 두 번 부드럽게 씻으십시오.</li>
			<li>0.1% 트리톤 X-100으로 고정된 세포를 실온에서 10분 동안 과미화하고 PBS로 셀을 두 번 세척합니다.</li>
			<li>실온에서 1 시간 동안 PBS에서 5 % BSA로 세포를 차단하고 PBS로 두 번 세포를 씻으시다.</li>
			<li>E-cadherin에 대 한 기본 항체를 추가 (희석 1:1000 PBS에서) 각 커버 슬립의 상단에 실온에서 1 시간 동안 배양.</li>
			<li>1차 항체를 제거하고 PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.</li>
			<li>알렉사 플루오 555 이차 항체(PBS에서 희석1:500)를 각 커버슬립의 상단에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 덮습니다.</li>
			<li>이차 항체를 제거하고 PBS로 커버슬립을 세 번 세척합니다.</li>
			<li>커버슬립(아래쪽을 향한 셀)을 4′,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 장착 매체를 사용하여 유리 슬라이드에 장착하고 빛으로부터 보호되는 4°C의 상자에 장착된 슬라이드를 보관합니다.</li>
			<li>SP8 공초점 현미경으로 염색을 관찰하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>필라멘트 (F)-액틴의 직접 형광 얼룩.<ol>
<li>3.3.1.1 단계를 따라 샘플을 준비합니다. 3.3.1.9로.</li>
			<li>알렉사 플루어 488 Phalloidin을 추가하여 세포를 얼룩 488 Phalloidin (1:1000) 에 대한 1 어둠 속에서 실온에서 1 시간 필라멘트 액틴을 시각화 (F-actin).</li>
			<li>PBS로 셀을 세 번 씻습니다.</li>
			<li>DAPI장착 매체를 사용하여 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 SP8 공초점 현미경으로 이미지를 찍습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

TGF-β/SMAD 시그널링은 EMT7을유도하여 유방암 세포 침습성 및 전이를 촉진할 수 있기 때문에 유방암 진행에 중추적인 역할을 한다. 여기서, 우리는 SMAD 중재 전사 및 생물학적 반응에 수용체 유도 SMAD 활성화에서 TGF-β 시작된 신호를 조사하기 위하여 논리적인 워크플로우를 기술했습니다. 우리는 SMAD2 인산화의 분석을 기술함으로써 시작, TGF-β 유도 SMAD3 의존 전사 반응 과 EMT 마커 발현 모두 유전자와 단백질 수준에서 계속 TGF-β/SMAD 신호 반응을 분석하였고, 마지막으로 TGF-β 유도 EMT를 검사하였다. 우리는 PAI-1 프로모터로부터 파생된 CAGA 상자를 포함하는 CAGA 12-루시파아제 전사 기자를 사용하여 TGF-β/SMAD 시그널링경로(35)의활성을 모니터링하였다. 이 리포터 구성은 정품 인증을 위해 SMAD3 및 SMAD4가 필요합니다. 이전 연구는 SMAD4의 녹다운 TGF-β 유도 CAGA12-luciferase 활동37을 감쇠 것으로 나타났습니다. SMAD2 및 SMAD3를 포함한 내인성 SMADs의 인산화 상태를 결정하는 기자 분석 외에도 TGF-β 시그널링 반응을 조사하는 또 다른 방법이다. 실제로, TGF-β 가족의 다른 구성원, 성장 및 분화 인자 (GDF)-8/myostatin 및 GDF-9와 같은, 또한 TβRI를 참여시켜 SMAD2/3 단백질을 통해 신호를 트랜스듀스42,43,44. CAGA12-luciferase기자 이외에, 몇몇 유사한 기자는 TGF-β 신호의 활성화를 검출하기 위하여 이용되었습니다. 예를 들어, JunB 프로모터로부터 유래된 반응 요소를 가진 전사(SBE)4-Lux리포터는 TGF-β, 활성 및BMPs(45)에의해 효율적으로 유도될 수 있다.
서양 블로팅 및 qPCR은 상피 마커 (즉, E-cadherin) 및 중간 엽 마커 (즉, N-cadherin, 달팽이, 슬러그 및 Zeb2)의 발현을 조사하는 고전적인 방법입니다 TGF-β 유도 EMT를 분석하는 데 사용되었다. 우리는 또한 E-카데린의 간접적인 면역 형광 염색 및 F-actin의 직접적인 형광 염색을 수행했습니다. 이러한 assays는 TGF-β 치료 후 세포의 중간 엽 표현형을 더욱 검증하였다. 면역형광 염색의 한계는 세포가 항체와 화상 진찰을 가진 잠복하기 전에 고정될 필요가 있고, 살아있는 세포에 있는 EMT 마커 발현에 있는 변경을 조사하기 어렵다는 것입니다. 최근에는 A549 폐 아데노암-비멘틴-RFP와 같은 EMT 리포터 세포주 설계를 통해 적색 형광단백질(RFP)의 발현을 통해 상피세포의 중간경세포 로의 변혁을 실시간으로 모니터링할 수 있게 되었다. 이 플랫폼은 약물 검진 및 신약 개발에 활용될 수 있다46. 생활 세포에서 F-액틴 구조를 더럽히수 있는 17아미노산 펩타이드인 LifeAct 염료는 세포 과정을 방해하지 않고 실시간으로 액틴 세포골격을 시각화하는 귀중한 도구가 되고있다(47). 이 연구에서는, 우리는 두 개의 작은 분자 억제제사용, SB431542 및 GW788388, TGF-β 신호 및 TGF-β 유도 된 EMT에 그들의 억제 효과 확인. 특히, GW788388은 TβRI 및 TβRII 활성을 강력하게 억제하고, SB431542는 TβRI(및 ALK4 및 ALK7)에만 억제 효과를 갖는다. 이전 연구에 따르면 GW788388은 SB43154240보다 생체 내에서 더 강력하다. EMT의 억제 외에도 GW788388은 신장내섬유증 마커의 발현을 감소시키고, 당뇨병 마우스에서 GW788388의 경구 투여를 현저히 감소시켜25,48.
EMT는 암세포 가소성을 증진하는 데 필수적인 역할을 하며 약물 내성 및 전이(49)를초래한다. 따라서, 특정 세포독성약물(50)을 가진 EMT 유래 세포를 표적으로 하거나 중간엽-상피 전이(MET)51을 통한 재분화를 유도하는 것은 암세포 전이 및 치료 저항을 극복하기 위한 접근법으로 제안되고 있다. 그러나, MET는 EMT의 치료 적 회귀를 사용할 때 비생산적 일 수 있는 먼장기(52)에서전파된 암세포의 증식에 기여한다. 최근에는 EMT 유래 유방암 세포를 직접 표적화하여아디포세포(30)로분화하여 치료적 이분화 접근법을 보고하였다. 이셰이 로넨 등의 연구. al.30은 TGF-β 장기 치료에 응하여 중간엽 세포로의 전환을 겪은 Py2T 뮤린 상피 암세포를 사용하였다. 그(것)들은 MEK 억제제와 조합하여 rosiglitazone 향상된 상피 분화 및 선포발생을 증명했다. 그러나, 우리는 rosiglitazone 혼자 백석 Py2T 뮤린 세포의 전분을 증분세포로 유도하기에 충분하다는 것을 것을을 발견했습니다.
요약하자면, 이 연구에서 사용된 방법은 TGF-β 시그널링 및 TGF-β 유도된 EMT를 조사하기 위한 논리적 워크플로우를 제공했습니다. 두 억제제, SB431542 및 GW788388, TGF-β 유도 된 응답 및 EMT를 차단할 수 있습니다. 또한, 우리는 또한 로시글리타존만이 특정 TGF-β 유도된 중간엽 유방암 세포에서 염분신생을 유도한다는 것을 입증하였다. 비록 우리가 TGF-β 반응을 조사하기 위하여 몇몇 유방암 세포 주를 사용하더라도, 여기에서 기술된 방법은 그밖 (암) 세포로 추정될 수 있었습니다. 여기에서, 우리는 세포 반응을 유도하기 위하여 각종 TGF-β 농도를 이용했습니다. 대부분의 세포 유형에서, TGF-β 0.01-10 ng/mL53의 농도 범위에서 그것의 생물학적 활성을 발휘 하 고 복용량 응답 패턴에서 신호를 유도. 1차 내피 세포에서는 소 대동맥 내피 세포를 포함한 TGF-β 0.025 ng/mL에서 인광SMAD2의 실질적인 발현을 유도하고, 0.25 ng/mL에서 최대에 도달하고, 높은 농도53에응답하여 이 수준에 머물렀다. 우리의 연구에서, 우리는 강한 응답을 얻기 위해 전사 기자 분석에 대한 MCF10A -Ras 세포에서 TGF-β (5 ng/mL)의 고농도를 사용했다. SMAD2 인산화 및 표적 유전자 발현은 낮은 용량에서 TGF-β 의해 유도될 수 있다; 따라서, 우리는 세포를 치료 하기 위해 2.5 ng/mL TGF-β 사용. 그러나, 가장 적합한 작업 농도는 세포 유형 및 추정 효과에 따라 달라집니다. TGF-β 최고의 농도 를 결정 하려면, 다른 복용량으로 세포를 치료 (낮은에서 높은) 권장.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.
NMuMG cells are non-transformed epithelial breast cells established from a mouse mammary gland. NMuMG cells are frequently used as a model system to investigate TGF-&#946;-induced epithelial to mesenchymal transition (EMT). EMT is induced by TGF-&#946; in premalignant human MCF 10A-RAS (M2) cells and mouse MMTV-PyMT breast cancer cell line. The article has been updated to reflect this.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61830/studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal">Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells</a>.&#160;NMuMG was mislabeled as&#160;cancer cells.

Erratum: Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

세포카인 변환 성장 인자-β(TGF-β)은 TGF-β(즉, TGF-β1, -β2 및 -β3), 뼈 형태성 단백질(BmPs) 및 활성제1,2를포함하는 구조적으로 및 기능적으로 관련된 폴리펩티드의 대규모 그룹의 프로토타입이다. 이러한 사이토카인은 모두 배아 발달과 조직 및 장기 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을한다. TGF-β 잘못 조절하면 암4,5를포함한 다양한 질병으로 이어질 수 있다. TGF-β 암 진행에 복잡 한, 이중 역할을 재생: 정상 및 premalignant 상피 세포에서, TGF-β 확산을 억제 하 고 세포 멸 각을 유도 하 여 종양 억제제로 행동6,7; 그러나 종양 진행 후기 단계에서, 종양 억제유전자의 발병 또는 상실의 활성화에 의해 세포정전기 반응이 막힐 때, TGF-β 암세포에서 상피-중간엽 전이(EMT)를 촉진하여 종양 증강제역할을 하며, 이를 통해 암세포 침입 및 전이, 종양 종양 내 세포 에 작용, 면역 및제90의세포에 작용한다.
TGF-β 성숙한 카박스-말기 TGF-β 및 대기 시간 관련 펩티드(LAP)11을포함하는 비활성 전구체 분자로서 분비된다. 이 작은 복합체는 잠복 TGF-β 결합 단백질(LTBP)12에의해 공유적으로 결합될 수 있다. 성숙한 TGF-β 방출은 LAP를 갈라놓는 특정 프로테아제의 작용또는 INtegrin의존공정(13,14)에서LAP의 기계적 당기기에 의해 중재될 수 있다. LTBP 이외에, 당단백질 A 반복우세(GARP)는 규제 T 세포(Tregs)의 표면에 높게 발현되고 TGF-β15,16의활성화를 조절하는 LTBP와 유사한 역할을 한다. GARP는 이황화 연결 및 비응성 협회를 통해 잠재 TGF-β 직접 결합합니다. GARP/TGF-β 복합체로부터 TGF-β 활성화하려면 통합이필요합니다(17). 성숙한 TGF-β TGF-β 세린/테로닌 키나아제 수용체, 즉 TGF-β 타입 I(TβRI) 및 TGF-β 타입 II(TβRII) 수용체(TβRII)수용체(TβRII) 수용체에 결합하여 시그널링을 시작한다. TGF-β 결합은 TβRII에 대한 TβRI의 모집과 이종복합체의 형성을 촉진한다. 이어서, TβRI는 짧은 글리신 및 세린이 풍부한(GS) 모티프로 세린 및 티레오닌 잔류물에 TβRII 키나아제에 의해 인포화되어19,20의활성화를 이룩한다. 활성화 시, 활성화된 TβRI는 기판을 모집하고 인광한다: SMAD2 및 SMAD3(그림1)를포함하는 2개의 수용체 특이적 SMADs(R-SMADs). R-SMADs는 프롤라인이 풍부한 링커영역(그림 2)으로구분되는 두 개의 소위 Mad homology 도메인인 MH1 및 MH2와 유사한 전체 구조를 공유합니다. SMAD3의 MH1 도메인 내의 DNA 결합 모티프는 SMAD2와 SMAD3 사이에 보존되지 않으며, SMAD2는 MH1 도메인(exon 3 및 L1)에 두 번의 삽입으로 인해 DNA를 직접 결합할 수 없습니다. SMAD2 및 SMAD3는 C-테르미니(그림2)에서SSXS 모티프의 인산화에 의해 활성화될 수 있다. 인광SMAD2/3 형태이종 복합체는 공통SMAD 중재자, SMAD4, 표적 유전자의 전사를 조절하기 위해 핵으로 배회(그림 1)7,21. 이러한 정식 SMAD 신호 경로는 정확하게 조절되며 세포 운명 및 종양 세포 전이 및침입(22)의조절과 같은 특정 세포 및 조직 반응을 생성한다. TGF-β-SMAD 시그널링 외에도, 비-SMAD 신호 경로는 또한 다운스트림 세포 반응을 조절하기 위해 수용체에 의해 직접 활성화될 수있다(23).
종양 진행 중, TGF-β 유도된 SMAD 의존및 SMAD 독립적인 통로의 활성화는 EMT의 유도를 위해 필요하다. EMT는 종양 세포가 상피 표현형으로부터 분화되는 가역적 과정으로, 세포-세포 접촉의 손실과 지방-기저 극성 감소와 연관되어, 향상된 운동성 및 침입능력(24)을가진 중간키말 표현형으로 분리된다. EMT는 N-카데린, 바이멘틴, Zeb2 및 달팽이1/2를 포함한 중간엽 마커 단백질의 발현이 증가하고, E-cadherin 및 β 카테닌(그림3)25와같은 상피 마커의 수반되는 다운레코딩을 특징으로 한다. 그러나 상피에서 중간엽 상태로의 전환은 종종 불완전하며 세포는 혼합 상피 및 중간엽(E/M) 특성을 얻습니다. 국제 EMT 협회에 의해 최근 논문은 상피 - 중간 가소성 (EMP)26로중간 E / M phenotypic 상태를 겪고 세포의 과정을 설명하기 위해 제안했다. 이러한 가소성은 부분 EMT, 하이브리드 E/M 상태, 메타안정 EMT 상태, EMT 연속체 및 EMT스펙트럼(26)을지칭한다. EMT 동안, 종양 세포는 암 줄기 세포 (CSC) 특성을 얻고 분리 유도 된 세포멸에 더내성이된다(27). EMT는 1차 종양 세포에서 침습적 표현형의 획득을 담당하고 암 진행을 유도하는 반면, 중간엽 상피 전이(MET)는 먼 전이성부위에서전파된 종양 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 것으로나타났다. 최근 연구에 따르면 EMT 유래 유방암 세포는 세포로 분화될 수 있으며, 이는 전이를 억제하고 종양 세포 및 재발된암(30)에서치료 저항을 극복할 수 있는 기회를 제공할 수 있다. 유방 발암증에 있는 EMT의 활성화에 있는 TGF β 신호의 중요한 역할 때문에, 우리는 서양 블로팅에 대한 상세한 프로토콜을 제시, 루시파라제 전사 기자 분석, 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR), 및 TGF-β 신호의 조사를위한 면역 fluorescence, TGF-β 유도 EMT, 및 EMT 유래 murine 유방 epithelial 종양 세포의 과분화. 이 기술은 세포 생물학 필드에 있는 가장 일반적으로 이용된 분석 공구입니다. qRT-PCR은 정량적 방식으로 mRNA 발현 수준을 검출, 특성화 및 정량화하는 데 사용됩니다. 대체 기술인 정량PCR(qPCR)에 비해 역전사(RT)-PCR을 사용하여 반정성 방식으로 mRNA 발현을 결정할 수 있다31,32. 서양 블로팅은 반정성 방식으로 감도 및 특이성의 장점을 갖는 주어진 세포 용해 시료의 특정 단백질 수준을 검사하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 또한 그밖 신호 경로에 적용될 수 있는 TGF-β 신호신호를 조사하는 것을 돕기 위하여 유전자 발현에서 단백질 발현에 변경을 분석하는 체계적인 워크플로우를 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm 사이드 스퀘어 글라스 커버슬립</td><td>Menzel Gl&auml; SER</td><td>631-1331</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21422</td><td></td></tr><tr><td>Anti-E-cadherin 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610181</td><td></td></tr><tr><td>항글리세르알데히드 3-인산염 탈수소효소(GAPDH) 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-N-cadherin 항체</td><td>BD Biosciences</td><td>610920</td><td></td></tr><tr><td>항슬러그 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>9585</td><td></td></tr><tr><td>항 SMAD2/3 항체</td><td>Becton Dickinson</td><td>610842</td><td></td></tr><tr><td>항달팽이 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>3879</td><td></td></tr><tr><td>항 세뇨관 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>2148</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 장독소</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>선명도 웨스턴 ECL 기질</td><td>Bio-Rad</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>DC 단백질 분석 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>5000111</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-고혈당</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-고혈당 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 변형 된 독수리' s 배지 (DMEM)/F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11039047</td><td></td></tr><tr><td>피 성장 인자 (EGF)</td><td>Merck Millipore</td><td>01-107</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>BioWest</td><td>S1860-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq qPCR 마스터 믹스</td><td>PROMEGA</td><td>A600X</td><td></td></tr><tr><td>호스 세럼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0135</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>미니 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II 키트</td><td>BIOKE&acute;</td><td></td><td></td>740955</tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(Pen-Strep)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸레니민(PEI)</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S 솔루션</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7170</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA 합성 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>557366-M</td><td></td></tr><tr><td>탈지유</td><td>Campina: Elk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc 이미징 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>17001402</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect 검출 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td></td></tr><tr><td>광도계</td><td>Perkin Elmer</td><td>2030-0050</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 분광 광도계</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr></tbody></table>

유방암과 정상 세포에서 tgf β 신호 및 tgf β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Studying TGF-&#946; Signaling and TGF-&#946;-induced Epithelial-to-mesenchymal Transition in Breast Cancer and Normal Cells

성장 인자 변환-β (TGF-β) 세포 간 통신에 중요 한 역할을 하는 분 비 다 기능 요인. TGF-β 신호의 동요는 유방암으로 이어질 수 있습니다. TGF-β 본질적인 세린/테로닌 키나아제 도메인을 포함하는 특정 세포 표면 TGF-β 타입 I 및 타입 II 수용체(즉, TβRI 및 TβRII)를 통해 증식 및 분화에 미치는 영향을 유도한다. TGF-β 유도이종 복합체 형성시, 활성화된 TβRI는 SMAD2 및 SMAD3인광에 의한 세포내 신호를 유도한다. 이러한 활성화된 SMADs는 플라스미노겐 활성화 억제제 1(PAI-1, SERPINE1 유전자에 의해 인코딩된 PAI-1)을 포함한 특정 표적 유전자를 조절하기 위해 SMAD4를 가진 이성모 복합체를 형성한다. 상피-중간엽 전이(EMT)의 유도는 1차 부위또는 먼 부위의 식민지화 과정에서 상피암세포를 허용하여 침략적인 표현형을 얻고 종양 진행을 유도한다. TGF-β EMT를 운전하여 유방암 침입의 강력한 유도자 역할을한다. 여기서, 우리는 선악성 인간 MCF10A-RAS (M2) 세포 및 마우스 NMuMG 상피 세포를 예로 사용하여 TGF β 신호 및 EMT 반응을 조사하는 체계적인 방법을 설명합니다. 당사는 루시프라아제 리포터 활성 및 SERPINE1 표적 유전자 발현을 이용한 서양 블로팅, SMAD3/SMAD4 의존적 전사 활성에 의한 TGF-β 유도된 SMAD2 인산화를 정하는 방법을 설명한다.qRT-PCR). 또한, 형태, 상피 및 중간엽 마커 발현, 필라멘트 액틴 염색 및 E-cadherin의 면역 형광 염색의 변화를 측정하여 TGF-β 유도 된 EMT를 검사하는 방법이 기재된다. 2개의 선택적 소분자 TGF-β 수용체 키나아제 억제제, GW788388 및 SB431542, TGF-β 유도SMAD2 인산화, 표적 유전자 및 EMT 마커 발현의 변화를 차단하기 위해 사용되었다. 더욱이, 우리는 중간엽 유방 Py2T 뮤린 상피 종양 세포의 전도를 선각세포로 기술합니다. 유방암에서 TGF-β 유도 된 신호 및 EMT를 검사하는 방법은 유방암에 대한 새로운 치료 접근법에 기여할 수 있습니다.

TGF β 신호 분석 TGF-β 시그널링의 핵심 단계는 TβRI 키나아제(TβRI kinase38,39)에의해 SSXS 모티프(그림2)에서가장 많은 카복시 단자 세린 잔류물의 인광화이다. TGF-β 신호 반응을 조사하기 위해, 우리는 인으로 SMAD2의 서양 블로팅을 수행. 선불인간 유방 MCF10A-Ras 세포에서, SMAD2의 인광은 1시간 동안 TGF-β 자극에 반응하여 크게 증가했으며, 총 SMAD2/3의 발현은 TGF-β 치료에 의해 영향을 받지 않았다(도 4A). TGF-β 유도된 SMAD3/4-driven CAGA-luc 전사 기자 분석서를 사용함으로써, TGF-β 비처리세포(도 4B)에비해 MCF10A-Ras 세포 선에서 루시파라제 기자를 현저하게 유도한 것으로 나타났습니다. 더욱이, 우리는 SMAD7 및 SERPINE1 (PAI-1 단백질을 인코딩)를 포함하여 TGF-β 잘 특징적인 직접 전사 유전자 표적이 TGF-β 처리된 MCF10A-Ras 세포(도4C)에서높게 발현되었다는 것을 관찰했습니다.
TGF-β 유도 EMT의 분석 우리는 형태학적 변화, mRNA에서 EMT 마커의 발현 및 EMT 마커의 면역 형광 염색 과 같은 다양한 방법으로 TGF-β 유도 된 EMT를평가했다 36. 1 및 2 일 동안 TGF-β 처리 된 NMuMG 상피 세포는 상 대비 현미경 검사법(도 5A)에의해 표시된 바와 같이 고전적인 상피 형태에서 스핀들 모양의 중간 엽과 같은 형태로 변경되었습니다. 형태학적 변화에 따라, 우리는 TGF-β 치료가 N-cadherin, 달팽이 및 슬러그(도 5B)를포함하여 중간 엽 마커의 단백질 발현의 증가를 주도것을 관찰했다. 대조적으로, 상피 마커인 E-cadherin은 TGF-β처리(도 5B)의2일 후에 NMuMG 세포에서 다운조절하였다. 또한, EMT 마커의 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하였다. CDH1(E-cadherin 단백질인코딩)은 현저히 감소하였고, 달팽이 및 아연 핑거 E-박스 결합 동종상자 2(ZEB2)와 같은 중간엽 마커는 치료되지 않은 세포에 비해 NMuMG 세포에서 TGF-β 자극 후 현저하게 증가하였다(도5C). NMuMG 세포에서 TGF-β 유도 된 EMT는 E-cadherin의 면역 형광 염색에 의해 더 확인되었다. 2일 동안 TGF-β 자극시, NMuMG 세포는 공초점 현미경검사(도5D)에의해 분석된 바와 같이 유도되지 않은 대조군에서 세포보다 E-cadherin을 적게 발현하였다. 더욱이, NMuMG 세포는 TGF-β 존재하여 더 많은 액틴 스트레스 섬유를 형성하였습니다, 공초점 현미경 검사법에 의해 도시된 바와 같이(도 5E).
SB431542 및 GW788388은 TGF β 신호 및 TGF-β 유도 EMT를 억제합니다. SB431542는 TβRI의 키나아제 도메인의 ATP 경쟁 억제제이며, 또한 활성수용체와 같은 키나아제 5(ALK5)라고 불리우며, GW788388은 TβRI 및 TβRII 키나아제 활성을 억제한다. 두 억제제 모두 TGF-β 수용체신호(40)를억제할 수 있다. 따라서, 우리는 1 시간 동안 TGF-β 존재하여 GW788388의 상이한 농도를 가진 NMuMG 세포를 처리했습니다. 예상대로, GW788388은 용량 의존형 방식으로 TGF-β 유도SMAD2 인산화를 억제하였다(도6A). 또한, SMAD2의 TGF-β 매개 인산화는 SB431542처리(도 6A)에의해 차단되었다. 인광SMAD2/3은 SMAD4를 가진 이종성 복합체를 형성하고 표적 유전자의 전사를 조절하기 위하여 핵으로 전염됩니다. 따라서, 우리는 SMAD2/3의 면역 형광 염색에 의해 NMuMG 세포에서 SMAD2/3의 전좌를 조사했습니다. 이 데이터는 SB431542 와 GW788388이 NMuMG 세포에서 TGF-β 유도된 핵 전좌 및 SMAD2/3의 축적을 현저히 억제한 것으로나타났습니다(도 6B). 더욱이, SB431542 및 GW788388의 억제 효과는 PAI-1,달팽이, E-cadherin 및 Fibronectin (도 6C)을포함하여 EMT에 관여하는 중요한 TGF-β 표적 유전자의mRNA 발현 수준에서 도 6C로 관찰되었다. 이러한 데이터는 SB431542 및 GW788388 TGF-β 신호 및 TGF-β 유도 EMT를 차단 제안.
중간 엽 유방암 세포의 세포화 의 분석 EMT는 암에 있는 세포 가소성을 향상에 있는 중요한 역할을 하고 치료 저항의 발달에 초래합니다. 암세포 가소성은 강제멸광발생(30)과같은 트랜스 분화 접근법으로 직접 표적화및 억제될 수 있다. 우리는 PY2T 뮤린 유방암 세포를 사용했는데, 이는 마우스 유방 종양 바이러스-폴리마 중형 종양 항원(MMTV-PyMT) 형질성 마우스의 유방 선에서 유래되었으며, EMT 유도 암 세포 가소성의 세포 모델로서 사용하였다. 확립된프로토콜(41)에기초하여, 우리는 EMT 유래 Py2T 뮤린 유방암 세포를 항당뇨병 치료제 로시글리타존과 함께 10일 동안 치료하여 증식을 유도하였다. 아디포게네스는 오일 레드 O 염색을 사용하여 지질 방울을 시각화하여 평가되었다. 지방세포는 로시글리타존처리된 Py2T 뮤린 유방암세포(도7)에서쉽게 검출되었으며, 이는 로시글리타존만으로는 EMT 유래 유방암 세포의 전분적 분화를 촉진하기에 충분하다는 것을 입증하였다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig01.jpg"> 그림 1: TGF-β/SMAD 신호. TGF-β 신호는 TGF-β 타입 II 수용체(TβRII)에 TGF-β 결합을 시작하여, 구성적으로 활성 키나아제, 즉 인광TGF-β 타입 I 수용체(TβRI)를 개시한다. 이어서, 활성화된 TβRI 키나아제 인산SMAD2/3. 2개의 카박스단 인광세린 잔류물을 가진 SMAD2의 SSXS 모티브를 함유한 펩타이드는 인광-SMAD2(p-SMAD2)를 인식하는 폴리클론 항세라를 얻기 위해 사용되었다. 따라서, 서양 블로팅에 의한 p-SMAD2 발현의 분석은 TGF-β 신호 경로의 활성화를 결정하는 데 사용될 수 있다. 인광SMAD2/3은 SMAD4를 사용하여 이종 복합체를 형성할 수 있으며, 이 단지는 전사 반응을 조절하기 위해 핵으로 배회할 수 있습니다. SMAD7 및 SERPINE1(PAI-1 단백질 인코딩)과 같은 TGF-β 표적 유전자의 mRNA 발현에 대한 CAGA 12-루시포라이 리포터 분석 및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)은 TGF-β 유도 SMAD3-의존적 전사 반응을 분석하는 데 사용될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig02.jpg"> 그림 2: R-SMADs(SMAD2 및 SMAD3)의 회로도 구조. MH1(파란색) 및 MH2(노란색) 도메인은 R-SMAD 간에 보존되지만 링커 영역(회색)은 보존되지 않습니다. SMAD3의 MH1 도메인은 DNA 결합 모티프를 품고 있으며, SMAD2는 MH1 도메인에 삽입(엑슨 3)으로 인해 DNA를 직접 결합할 수 없습니다. MH2 도메인은 SMAD 올리고머화, TGF-β 수용체와의 상호 작용 및 단백질 결합을 중재하며 전사 조절에 관여합니다. SMAD2 및 SMAD3는 C 테르미니에서 SSXS 모티프(빨간색)의 인광에 의해 활성화될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig03.jpg"> 도 3: TGF-β 유도 EMT. TGF-β 유도 된 상피 - 중간 엽 전이 (EMT) 동안, 세포는 향상된 세포 운동성 및 침입 능력과 중간 엽 특성의 상피 및 획득의 손실을 겪습니다. EMT의 유도는 N-cadherin, Zeb2 및 Snail1/2와 같은 중간엽 마커의 발현뿐만 아니라 E-cadherin, β-카테닌 및 클라우디엔-1을 포함한 상피 마커의 하향 조절으로 이어집니다. 상피/중간엽(E/M) 특성의 축적된 손실 또는 이득은 세포가 가역적인 방식으로 중간 상태로 진입하게 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig04.jpg"> 그림 4: MCF10A-Ras 세포에서 TGF-β 신호 반응. (A)MCF10A-Ras 세포는 TGF-β(2.5 ng/mL)의 유무에 관계없이 1시간 동안 처리되었고, 세포 용액은 인광SMAD2(p-SMAD2), 총 SMAD2/3 및 GAPDH(로딩 컨트롤로서)에 대해 면역계로 정하였다. 크기 마커가 오른쪽에 표시됩니다. 단점: TGF-β 치료 없이 제어 그룹. (B)MCF10A-Ras 세포에서 SMAD3-SMAD4 의존CAGA 12-루시파라제(LUC) 전사 기자를 이용한 TGF-β(5 ng/mL) 활성분석. 값은 β-갈라콘토시다아제(βGal) 활성으로 정규화된다. 데이터는 s.d, n = 3의 평균 ± 표현됩니다. 학생의 t 시험, ***P ≤ 0.001(C)qRT-PCR 분석은 TGF-β 표적 유전자 SMAD7 및 SERPINE1 (PAI-1 단백질을 인코딩) MCF10A-Ras 세포에서 TGF-β (2.5 ng/mL)로 6 시간 동안 치료하였다. GAPDH는 내부 제어로 사용되었습니다. 데이터는 s.d, n = 3의 평균 ± 표현됩니다. 학생의 테스트, ***P ≤ 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig05.jpg"> 도 5: NMuMG 세포에서 TGF-β 유도 EMT. (a)TGF-β(2.5 ng/mL)로 처리된 NMuMG 세포의 형태는 1 또는 2일 동안. TGF-β 존재, NMuMG 세포는 중간 엽 표현형으로 분화. 스케일 바 = 150 μm(B)NMuMG 세포는 2 일 동안 TGF-β (5 ng/mL)의 유무에 관계없이 처리되었으며, EMT 마커는 서양 블로팅에 의해 분석되었다. 크기 마커는 오른쪽에 표시된 대로 표시됩니다. 단점: TGF-β 치료 없이 제어 그룹. (C)NMuMG 세포에서 EMT 마커(CDH1(E-cadherin 단백질인코딩)의 유전자 발현분석, 달팽이 및 ZEB2)를 TGF-β(5 ng/mL)로 2일 동안 치료하였다. GAPDH는 내부 제어로 사용되었습니다. 결과는 평균 ± s.d., n = 3로 표현됩니다. 학생의 t-테스트, *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, *P ≤ 0.001. (D)NMuMG 세포는 TGF-β(2.5 ng/mL) 처리 후 상피 마커 E-cadherin(red)의 발현을 검출하기 위해 면역형광에 의해 염색되었다( 2.5 ng/mL) 처리. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색되었다. 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 캡처되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(E)NMuMG 세포는 F-액틴을 시각화하기 위해 플루오레세인-플라로이드(green)로 염색하였다. 핵은 DAPI (파란색)로 반염색되었다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig06.jpg"> 도 6: TGF-β시그널링 및 TGF-β 유도 EMT는 SB431542 및 GW788388에 의해 억제되었다. (A)NMuMG 세포는 1시간 동안 TGF-β(5 ng/mL)의 존재 또는 부재에서 SB431542(SB) 또는 GW788388(GW)의 표시 농도10μM로 처리되었다. 세포 용해는 p-SMAD2, SMAD2/3 및 GAPDH를 위해 면역블레드되었다. (B)NMuMG 세포는 SMAD2/3(green)의 핵 전좌를 검출하기 위해 면역불과민증에 의해 염색된 TGF-β 5ng/mL의 존재 또는 부재에서 GW788388(GW)의 5μM(SB) 또는 10μM(GW)으로 처리되었다. 이미지는 공초점 현미경 검사법으로 캡처되었습니다. (C) SNAIL, E-Cadherin 및 Fibronectin을 포함한 PAI-1 및 EMT 마커를 코딩하는 유전자를 포함한 TGF-β 표적 유전자의 발현은 SB 또는 GW β 치료 후 NMuMG 세포에서 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 48시간 동안 분석하였다. GAPDH는 로딩 제어 역할을 했습니다. 제어는 처리되지 않은 세포를 나타냅니다. 이 그림은 피터슨 M. 외에서수정되었습니다. 34 게시자의 허락을 받아. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61830/61830fig07.jpg"> 도 7: EMT 유래 Py2T 뮤린 유방암 세포는 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. Py2T 뮤린 유방암 세포는 완전한 EMT를 유도하기 위해 20 일 동안 2 ng/mL TGF-β 자극되었다. 이어서, 세포는 비관성 암세포의 분화를 허용하고 송포발생을 유도하기 위해 10일 동안 DMSO를 차량 제어 또는 로시글리타존(2 μM)으로 치료하였다. 배지는 2일마다 변경되었습니다. 치료 10 일 후, 세포는 기름 적색 O. 스케일 바 = 50 μm로 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61830/61830fig07large.jpg" target="_blank">염색하였다.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>종</td>
			<td>유전자 이름</td>
			<td colspan="2">전진 (5'~ 3')</td>
			<td colspan="2">역(5'에서 3')</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">사람의</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGCACCACCAACTGCTTAGC</td>
			<td colspan="2">GGCATGGGGTGGTCATGAG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMAD7</td>
			<td colspan="2">TCCAGATGCTGTGCCTCC</td>
			<td colspan="2">GTCCGAATTGAGCTGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>세르피인1</td>
			<td colspan="2">카카오카가CGGCACT</td>
			<td colspan="2">캣CGGGCGTGGTGAACTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">마우스</td>
			<td>GAPDH</td>
			<td colspan="2">TGGCAAAGTGG가트GTTGCC</td>
			<td colspan="2">아가그게트가그GCTTCCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>CDH1</td>
			<td colspan="2">ACCAAAGTGACGCTGAAGTC</td>
			<td colspan="2">가가트GTACTTGGCAATGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>달팽이</td>
			<td colspan="2">카GCTGGCCAGGCTCGGT</td>
			<td colspan="2">GCGAGGGCCTCCGGAGCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZEB2</td>
			<td colspan="2">TTCTGCAGCCTCTGTAGGTAGCC</td>
			<td colspan="2">TTCTGGCCCCATTGCATCAT</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: qRT-PCR에 사용되는 프라이머.

우리는 이 신호 통로에 관련시킨 단백질 및 유전자 발현을 공부해서 TGF β 신호 및 TGF-β 유도한 EMT를 조사하기 위하여 체계적인 워크플로우를 기술합니다. 방법은 서양 블로팅, 루시파라제 기자 분석, qPCR 및 면역 불피스테인링을 포함한다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

Transforming growth factor-&#946; (TGF-&#946;) is a secreted multifunctional factor that plays a key role in intercellular communication. Perturbations of ...

TGF-beta는 정상 세포와 암 세포 모두에서 발생할 수 있는 상피에서 중간엽으로의 전이(epithelial-to-mesenchymal transition, 줄여서 EMT)의 주요 동인입니다. 당사의 프로토콜에 설명된 방법을 통해 연구원들은 TGF-베타 SMAD 신호 전달 및 TGF-베타 유도 EMT 모두에 대한 변조기의 영향을 측정할 수 있습니다. 마우스 유선에서 확립된 비형질전환된 NMuMG 세포는 TGF-beta-induced EMT에 자주 사용되는 모델 시스템입니다.TGF-beta는 이러한 세포에서 매우 강력한 EMT 반응을 유발합니다. 유사한 반응은 암 진행에 기여하는 유방암 세포에서도 볼 수 있습니다. 상피 마이크로 E-cadherin의 염색과 filamentous-actin의 조직을 결합하면 상피에서 중간엽으로의 전이 중에 발생하는 형태학적 변화를 검증하고 더 잘 시각화하는 데 도움이 됩니다.암세포에 의한 중간엽 표현형의 획득은 세포의 이동, 침입 및 전이 능력 증가 및 화학 요법 내성과 관련이 있습니다. 이 방법은 암 진행뿐만 아니라 조직 섬유증과 같은 다른 과정에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도하는 동안 세포 밀도를 잘 제어해야 한다는 점을 명심하십시오.세포의 밀도가 높으면 상피에서 중간엽으로의 전이가 어렵습니다. 이 시각적 시연을 통해 연구원들은 TGF-베타 신호 전달 및 TGF-베타 유도 EMT 실험을 수행하는 방법을 잘 이해할 수 있습니다. E-cadherin의 간접 면역형광 염색을 수행하려면 먼저 멸균 18mm 정사각형 유리 커버슬립을 웰당 하나의 커버슬립인 6웰 플레이트에 넣습니다.100, 000 NMuMG 세포를 2 밀리리터의 완전한 DMEM을 각 웰에 파종하고 세포가 밤새 고착할 수 있도록 합니다. 비형질전환(non-transformion) NMuMG 세포는 TGF-beta-induced EMT를 조사하기 위한 모델 시스템으로 자주 사용됩니다. 다음 날, 부착 세포가 있는 커버슬립을 새로운 6웰 플레이트로 부드럽게 옮기고 웰에 2ml의 배양 배지를 추가합니다.리간드 완충액을 대조군으로 사용하거나 2일 동안 TGF-beta 밀리리터당 5나노그램으로 세포를 처리합니다. 추가된 리간드 완충액은 추가된 TGF-beta와 동일한 부피여야 합니다. 처리 후 배양 배지를 제거하고 예열 된 PBS 1ml로 세포를 두 번 부드럽게 세척합니다.4% 파라포름알데히드 1ml를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 다음 PBS 1ml로 세포를 두 번 부드럽게 세척하여 세포를 고정합니다. 고정된 세포를 실온에서 10분 동안 0.1%Triton X-100으로 투과하고 PBS로 세포를 2회 세척합니다. PBS에서 5%BSA가 있는 세포에 대한 비특이적 단백질 결합을 실온에서 1시간 동안 차단한 다음 PBS로 세척을 반복합니다.각 커버슬립 상단에 E-cadherin에 대한 1차 항체를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 1차 항체를 제거하고 PBS로 각 커버슬립을 3회 세척합니다. Alexa Fluor 555 2차 항체와 Alexa Fluor 488 팔로이딘을 각 커버슬립 상단에 추가합니다.그런 다음 알루미늄 호일로 덮고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 2차 항체를 제거하고 PBS로 커버슬립을 3회 세척합니다. DAPI가 있는 장착 매체를 사용하여 셀이 아래를 향하도록 커버슬립을 유리 슬라이드에 장착하고 장착된 슬라이드를 빛으로부터 보호된 섭씨 4도의 상자에 보관합니다.SP8 컨포칼 현미경으로 염색을 관찰합니다. MCF10A-Ras 세포주에서 SMAD2의 인산화는 TGF-beta 자극에 대한 반응으로 유의하게 증가한 반면, 총 SMAD2 및 3의 발현은 영향을 받지 않았습니다. TGF-beta는 또한 처리되지 않은 세포에 비해 MCF10A-Ras 세포주에서 루시페라제 리포터를 현저하게 유도했습니다.SMAD7 및 SERPINE1를 포함한 TGF-베타의 잘 특성화된 직접 전사 유전자 표적은 TGF-베타 처리된 MCF10A-Ras 유방 세포에서 높게 발현되었습니다. TGF-beta로 처리된 NMuMG 상피 세포는 고전적인 상피 형태에서 방추 모양의 중간엽 유사 형태로 변경되었습니다. 형태학적 변화와 일관되게 TGF-beta 처리는 중간엽 마커의 단백질 발현을 증가시켰습니다.대조적으로, 상피 마커인 E-cadherin은 TGF-beta 치료 2일 후에 하향 조절되었습니다. TGF-beta 자극 후 EMT 마커의 유전자 발현을 조사하기 위해 정량적 real-time polymerase PCR을 사용했습니다. CDH1은 현저히 감소한 반면 중간엽 마커는 증가하였다.TGF-beta 자극 시, NMuMG 세포는 대조군의 세포보다 E-cadherin을 적게 발현했습니다. 더욱이, 세포는 TGF-beta의 존재 하에서 더 많은 액틴 스트레스 섬유를 형성했습니다. 용량 의존적 방식으로 GW788388 억제된 TGF-beta-induced SMAD2 인산화를 사용한 처리.또한, SMAD2의 TGF-beta-mediated phosphorylation은 SB-431542 처리에 의해 차단되었습니다. SB-431542와 GW788388 모두 TGF-beta에 의한 핵 전좌와 NMuMG 세포에서 SMAD2 및 3의 축적을 유의하게 억제하였다. 이 절차에 따라 특정 1차 및 2차 항체를 변경하여 세포 내 이러한 단백질의 발현 수준과 국소화를 조사함으로써 다른 상피-중간엽 거대단백질의 면역형광 염색을 수행할 수 있습니다.

studying-tgf-signaling-tgf-induced-epithelial-to-mesenchymal

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

양적 성장 인자 (TGF) - β - 유도 3 차원 콜라겐 젤의 침공을 변형 측정하는 분석이 설명되어 있습니다. 이 분석은 유방암 개발의 다른 단계를 나타내는 세포 라인의 MCF10A 시리즈의 활용합니다. 이 방법은 다른 세포 라인과 함께 사용하는 다른 가능성 activators 또는 침해의 억제제를 조사하기 위해 사용될 수 채택 수 있습니다.

TGF - β - 유발 침략을 측정하는 회전 타원체 분석

시간 경과 영상은 특정 행동 매개 변수 독특한 유전 적 병변 사이에 상관 관계가 있는지 확인하기 위해 유방암 위험 유전자 변형 마우스 모델에서 파생 된 기본 preneoplastic 유방 상피 세포의 행동을 평가하는 데 사용됩니다.

기본 Preneoplastic 유방 상피 세포의 시간 경과 영상은 유방암의 유전자 변형 마우스 모델에서 파생

간단한 방법은 세포 유형의 다양한 중간 엽 전이 (EMT)에 상피의 유도에 대해 설명한다. 면역 세포에 의한 EMT 상태에있는 세포의 분석 방법이 포함되어 있습니다.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

이 비디오 기사는 암세포 침입을 유도하는 호르몬, 사이토카인 및/또는 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 수정된 체외 방법에 대해 설명합니다.

수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

선택적 접합 조절은 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에서 필수적인 세포 프로그램인 상피-중간엽 전이(EMT)에 기여하는 것으로 나타났습니다. 여기에서는 EMT 중 선택적 접합을 감지하기 위해 유도 가능한 EMT 모델을 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

상피 - 간엽 전환시 선택적 스 플라이 싱 (alternative splicing)의 검출

여기에서는 상피-중간엽 전이를 거친 중간엽 세포에서 수축 기능을 평가하기 위한 겔 수축 분석법의 개발 및 적용에 대해 설명합니다.

개발<em&gt; 체외</em&gt; 분석은 중간 엽 세포를 시행 한 상피 - 중간 엽 전환의 수축 기능을 평가하는

여기, 우리는 기본 유 방 암 세포 뿐만 monocytes 그리고 콜라겐 저하, 면역 세포 모집, 셀 결과 함께 그들의 직접/간접적인 상호 작용 연구로 형태를 분석 하는 3 차원 문화 방법 설명 침공, 그리고 암 관련 된 염증의 승진.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

내 피 엽 전환 (EndMT)는 EndMT에 관련 된 세포 신호 경로 조사 하는 데 유용의 생체 외에서 유도 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 이 실험 모델에서 EndMT MS-1 내 피 세포에서 TGF-β와 치료에 의해 유발 됩니다.

내 피 엽 전환 성장 인자-β 신호 변환에 의해 유도 된의 분자 분석

여기, 우리는 아 데 노비 루스 기자 시스템을 사용 하 여 하는 TGF-β/Smad3 신호 활동의 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜을 제시. 이 시스템 실시간 transcriptional 활동을 추적 하 고 두 단일 세포에 생체 외에서 그리고 살아있는 동물에 적용 될 수 있다모델.

라이브 셀 이미징 TGF-β/Smad3 신호 통로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 아 데 노 바이러스 기자 시스템을 사용 하 여

우리는 실리콘 고무 (PDMS)로 제작 된 높은 처리량 견인력 분석방법을 제시한다. 이 새로운 분석은 다양한 생물학적 및 생물 의학 적 과정 및 질병 동안 세포 수축성의 물리적 변화를 연구하는 데 적합합니다. 우리는 상피-중간엽 전이 동안 수축성의 TGF-β 의존적 증가를 측정함으로써 이 방법의 유용성을 입증한다.

PDMS를 이용한 높은 처리량 견인력 현미경 검사법은 상피-중간엽 전이에 대한 성장 인자-β 변환의 용량 의존적 효과를 밝혀냅니다.

당사는 세포 형태 변화를 관찰하고 면역형성 염색을 이용한 발현 EndMT 관련 마커 변경을 검사함으로써 내피 세포에서 TGF-β2 유도 EndMT를 조사하는 방법을 설명합니다. CRISPR/Cas9 유전자 편집은 TGF-β2 유도 EndMT에서의 역할을 조사하기 위해 달팽이를 코딩하는 유전자를 고갈시키기 위해 기술및 사용되었다.

TGF-β 매개 내피- 중간엽 전환(EndMT)과 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 사용하여 EndMT 이펙터의 기능평가

배우세요 TGF-β 신호 및 상피-중간엽 전환(EMT) 연구 방법을 NMuMG 세포를 이용하여. 웨스턴 블롯, 루시퍼라제 분석, qPCR, 면역형광 염색 기법을 활용한 포괄적인 실험 프로토콜입니다.

유방암과 정상 세포에서 TGF β 신호 및 TGF β 유도 된 상피 - 중간 엽 전환 연구

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