Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

이 기술을 통해 연구원들은 먹이를 주고 단독으로 높은 처리량의 측정을 수행하여 수백 마리의 개별 모기가 소비하는 식사량을 비교할 수 있습니다. 식사의 내용을 변경하거나 다른 실험 그룹이 소비하는 양을 비교하는 데 적응할 수 있습니다. 이 프로토콜은 사용자 친화적이고 저렴한 비용을 목표로 합니다.

약리학 적 및 유전 적 조작을 위해, 모기의 혈액 먹이 및 홍수 후 먹이 행동을 연구합니다. 이 프로토콜에는 구성이 매우 중요합니다. 모기에게 먹이를 빨리 전달할 수 있도록 설정 및 시약을 미리 준비하십시오.

시작하려면 1.98-2ml의 제분된 양의 혈액을 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 형광 기반 식사 크기 정량화를 수행하는 경우 플루오레세인 용액을 최종 농도 0.002%에 첨가하여 플루오레세인을 첨가한 것과 동일한 양만큼 혈액량을 줄입니다. 최종 식사 제형의 1ml를 유지하여 참조 표준 곡선을 생성합니다.

플루오레세인이 함유된 모든 식사와 용액은 알루미늄 호일로 싸거나 어두운 곳에 보관해야 합니다. 단백질이 없는 식염수 가루를 준비하려면 15ml 원뿔형 튜브에 600마이크로리터의 400밀리몰 중탄산나트륨과 1.39밀리리터의 이중 증류수를 섞습니다. 식사 크기의 형광 기반 정량화를 나중에 수행해야 하는 경우 플루오레세인 용액을 최종 농도 0.002%로 첨가하여 첨가된 플루오레세인과 동일한 양만큼 물의 부피를 줄입니다.

0.002%플루오레세인을 함유한 최종 식사 제형을 최소 1mL 유지하여 기준 표준 곡선을 생성합니다. 배달할 준비가 될 때까지 준비된 음식을 따로 보관하십시오. 플루오레세인이 함유된 모든 식사와 용액은 알루미늄 호일로 싸거나 어두운 곳에 보관해야 합니다.

실험용 암컷 모기 그룹을 용기에 넣고 그물로 덮습니다. 이 암컷이 먹이실에 적응할 수 있도록 합니다. 먹이를 주지 않는 모기의 대조군 그룹을 따로 마련하십시오.

GLI 튜브를 구성하려면 50ml 원뿔형 튜브에 40ml의 100% 글리세롤을 채웁니다. 누출 가능성을 최소화하기 위해 열린 원뿔형 튜브를 두 조각의 파라필름으로 밀봉합니다. 선택적으로 고무 밴드를 사용하여 파라필름을 제자리에 고정합니다.

구멍이나 틈이 없는지 확인하기 위해 튜브를 뒤집습니다. 식사 배달 장치를 만들려면 날카로운 면도날이나 라베를 사용하여 원뿔형 튜브의 나사 캡에 있는 중앙 2.5cm 구멍을 자릅니다. 파라필름 조각을 고르게 늘려 크기가 대략 두 배가

파라필름은 모기가 쉽게 뚫을 수 있을 만큼 얇아야 하지만 누출이 없어야 합니다. 나사 캡의 외부 표면을 파라필름으로 밀봉하여 구멍을 완전히 덮고 캡을 따로 보관합니다. 밀봉된 글리세롤 튜브와 혈액 및 식염수 가루, 섭씨 42-45도의 수조를 최소 15분 동안 가열합니다.

따뜻하게 데운 식사에 ATP를 넣고 완전히 소용돌이치십시오. 데워진 음식 2 밀리리터를 스크류 캡의 내부 챔버에 피펫으로 넣고 거꾸로 데운 글리세롤로 채워진 원뿔형 튜브를 그 위에 부드럽게 올려 놓았습니다. 부분적으로, 식사가 담긴 캡을 글리세롤이 채워진 튜브에 끼우고 식사나 글리세롤이 누출되는 것을 방지할 만큼만 조입니다.

조립된 글리 튜브를 모기통 위에 놓고 이산화탄소를 바르고 모기가 최소 15분 동안 먹이를 먹을 수 있도록 하여 최대 섭식 속도를 달성합니다. 공급 후 GLI 튜브 캡은 생물학적 위험 폐기물로 폐기하거나 낮은 비율의 표백제 용액에 담그고 물로 철저히 헹군 후 재사용할 수 있습니다. 참조 표준 곡선을 생성하려면 실험 모기 그룹에 제공된 0.002%플루오레세인이 포함된 동일한 식사의 연속 희석액을 준비합니다.

표준 곡선의 첫 번째 용액을 만들려면 0.002% 플루오레세인을 함유한 50마이크로리터의 식사를 950마이크로리터의 PBS에 넣고 철저히 와동합니다. 나머지 표준 곡선 해에 대해 2배 희석을 수행하고, 각 희석이 이루어지기 훨씬 전에 와류를 수행합니다. 각 표준 곡선 용액을 96웰 PCR 플레이트의 첫 번째 열에 있는 8개의 웰 각각에 100마이크로리터씩 피펫팅합니다.

동일한 8개의 웰 각각에 마취 또는 냉동 비급여 방제 모기 1개를 추가합니다. 반복 측정을 위해 플레이트의 두 번째 열에서 반복합니다. 비공급 대조군 및 실험군을 위해 각각 남은 웰에 100마이크로리터의 PBS를 추가합니다.

음성 대조군으로, 플레이트의 다음 두 열에 있는 각 웰에 먹이를 주지 않은 모기 한 마리를 추가합니다. 먹이를 제공받은 실험 그룹의 나머지 우물에 우물당 한 마리의 모기를 추가합니다. 비드 밀 균질화기로 조직을 파괴하는 경우 각 웰에 3개의 밀리미터 붕규산 고체 유리 비드를 추가합니다.

플레이트를 조심스럽게 밀봉하고 조직을 파괴한 다음 2000RPM에서 플레이트를 1-2분 동안 원심분리하여 용해물을 수집합니다. 각 웰에 180마이크로리터의 PBS가 있는 검은색 96웰 플레이트를 준비합니다. 그런 다음 각 웰에 20마이크로리터의 용해물을 넣고 섞습니다.

485 excitation 및 520 emission channels가 있는 플레이트 리더를 사용하여 fluorescein intensity를 측정합니다. 해당 형광 강도 측정에 대해 알려진 식사량의 양을 플로팅하여 참조 표준 곡선을 생성합니다. 생성된 참조 표준 곡선을 사용하여 각 실험 그룹 모기가 섭취한 식사량을 외삽합니다.

각 실험 그룹 개인의 형광 강도 판독값에서 비공급 음성 대조군의 평균 형광 강도 판독값을 빼서 기준선 조직 자가형광을 보정합니다. 혈액 공급 실험에서 플루오레세인 가루 크기를 측정하기 위해, 먹이를 먹지 않은 모기와 0.002%의 플루오레세인이 함유된 알려진 먹이 부피를 포함하는 지정된 기준 우물에서 형광 판독값을 표시하여 표준 곡선을 생성했습니다. 먹이를 먹지 않은 음성 대조군 모기 또는 먹이를 제공받은 실험 모기 그룹의 모기가 포함된 나머지 우물의 형광 판독값을 이 표준 곡선과 비교하여 섭취된 식사량을 정량화합니다.

실험 그룹의 모든 암컷에게 혈액 식사가 제공되었지만 일부 모기는 먹이를 먹었고 일부는 먹이를 먹지 않았습니다. 이 프로토콜은 다양한 단백질 성분을 가진 식사를 제공하고 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 불소가 첨가된 식사를 사용하여 수집된 데이터는 다음과 같습니다.

모기에게 불소가 없는 먹이를 제공한 후 눈으로 먹이를 먹었는지 안 먹었는지에 대한 점수를 매기는 독립적인 실험도 수행되었습니다. 이 프로토콜은 모기 숙주가 행동을 찾는 것을 조절하는 약물과 함께 식사의 소비량을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 실험에서, 여성은 인간 NPY 2 수용체 작용제와 함께 식염수 ATP 식사를 제공했다.

이 기술은 또한 gly 튜브를 0.002%플루오레세인을 함유한 10% 자당으로 포화된 면봉으로 교환하여 꿀 섭취 행동을 측정하는 데 사용되었으며, 그룹 체중 측정에서 정확하게 식별할 수 없는 더 작거나 더 다양한 식사 크기를 측정하는 데 사용할 수 있음을 보여주었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때 가장 중요한 것은 이벤트에서 샘플을 구성하고 먹이를 먹지 않은 모기와 표준 곡선을 생성하기 위해 각 식사당 1ML을 따로 두는 것입니다. 이 절차에 따라 혈액 공급 후 동물의 행동을 관찰하고 소화를 추적할 수 있습니다.

이 방법을 통해 연구자들은 유전자 변형 모기의 식사 섭취 변화를 평가할 수 있습니다. 또한 모기에게 약물을 전달하고 행동에 미치는 영향을 테스트하는 간단하고 신속하며 비침습적인 방법을 제공합니다.