Name: PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 학습하세요 Salmonella typhimurium에서 트립토판 신타제를 하루 만에 정제하는 빠른 프로토콜입니다. 암모늄 황산 분획과 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 야생형 및 돌연변이 효소 복합체를 효율적으로 분리할 수 있습니다.

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<ol><li>Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+multienzyme+complex+with+an+intramolecular+tunnel%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Record%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a multienzyme complex with an intramolecular tunnel.</a> Chemical Record. 1 (2), 140-151 (2001).</li>
<li>Raboni, S., Bettati, S., Mozzarelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+synthase%3A+a+mine+for+enzymologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life%22%5BJournal%5D)">Tryptophan synthase: a mine for enzymologists.</a> Cellular and Molecular Life. 66 (14), 2391-2403 (2009).</li>
<li>Dunn, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+regulation+of+substrate+channeling+and+catalysis+in+the+tryptophan+synthase+bienzyme+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Allosteric regulation of substrate channeling and catalysis in the tryptophan synthase bienzyme complex.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 519 (2), 154-166 (2012).</li>
<li>Chaudhary, K., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protozoan+genomics+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protozoan genomics for drug discovery.</a> Nature Biotechnology. 23 (9), 1089-1091 (2005).</li>
<li>Caldwell, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphisms+in+Chlamydia+trachomatis+tryptophan+synthase+genes+differentiate+between+genital+and+ocular+isolates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Polymorphisms in Chlamydia trachomatis tryptophan synthase genes differentiate between genital and ocular isolates.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (11), 1757-1769 (2003).</li>
<li>Kulik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+structural+basis+of+the+catalytic+mechanism+and+the+regulation+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium+and+BX1+from+maize%2C+two+evolutionarily+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">On the structural basis of the catalytic mechanism and the regulation of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium and BX1 from maize, two evolutionarily related enzymes.</a> Journal of Molecular Biology. 352 (3), 608-620 (2005).</li>
<li>Barends, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanistic+implications+of+a+tryptophan+synthase+quinonoid+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanistic implications of a tryptophan synthase quinonoid intermediate.</a> Chembiochem. 9 (7), 1024-1028 (2008).</li>
<li>Hatanaka, M., White, E. A., Horibata, K., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+catalytic+properties+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%2C+a+two-component+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A study of the catalytic properties of Escherichia coli tryptophan synthetase, a two-component enzyme.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 596-606 (1962).</li>
<li>Henning, U., Helinski, D. R., Chao, F. C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A+protein+of+the+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+Purification%2C+crystallization%2C+and+composition+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The A protein of the tryptophan synthetase of Escherichia coli. Purification, crystallization, and composition studies.</a> Journal of Biological Chemistry. 237, 1523-1530 (1962).</li>
<li>Wilson, D. A., Crawford, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+properties+of+the+B+component+of+Escherichia+coli+tryptophan+synthetase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and properties of the B component of Escherichia coli tryptophan synthetase.</a> Journal of Biological Chemistry. 240 (12), 4801-4808 (1965).</li>
<li>Adachi, O., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+preparing+crystalline+beta+2+subunit+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli+in+high+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid method for preparing crystalline beta 2 subunit of tryptophan synthetase of Escherichia coli in high yield.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (17), 5430-5434 (1974).</li>
<li>Adachi, O., Kohn, L. D., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+alpha2+beta2+complexes+of+tryptophan+synthetase+of+Escherichia+coli.+A+comparison+between+the+native+complex+and+the+reconstituted+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystalline alpha2 beta2 complexes of tryptophan synthetase of Escherichia coli. A comparison between the native complex and the reconstituted complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 249 (24), 7756-7763 (1974).</li>
<li>Higgins, W., Fairwell, T., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+proteolytic+derivative+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase.+Identification+of+the+site+of+cleavage+and+characterization+of+the+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An active proteolytic derivative of the alpha subunit of tryptophan synthase. Identification of the site of cleavage and characterization of the fragments.</a> Biochemistry. 18 (22), 4827-4835 (1979).</li>
<li>Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+crystallographic+data+of+the+tryptophan+synthase+alpha+2+beta+2+complex+from+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray crystallographic data of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 complex from Salmonella typhimurium.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3716-3718 (1985).</li>
<li>Miles, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+subunit+of+tryptophan+synthase.+Clarification+of+the+roles+of+histidine+86%2C+lysine+87%2C+arginine+148%2C+cysteine+170%2C+and+cysteine+230%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The beta subunit of tryptophan synthase. Clarification of the roles of histidine 86, lysine 87, arginine 148, cysteine 170, and cysteine 230.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (11), 6280-6287 (1989).</li>
<li>Rhee, S., Parris, K. D., Ahmed, S. A., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+of+K%2B+or+Cs%2B+for+Na%2B+induces+local+and+long-range+changes+in+the+three-dimensional+structure+of+the+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exchange of K+ or Cs+ for Na+ induces local and long-range changes in the three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha2beta2 complex.</a> Biochemistry. 35 (13), 4211-4221 (1996).</li>
<li>Rhee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+mutant+%28betaK87T%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+with+ligands+bound+to+the+active+sites+of+the+alpha-+and+beta-subunits+reveal+ligand-induced+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a mutant (betaK87T) tryptophan synthase alpha2beta2 complex with ligands bound to the active sites of the alpha- and beta-subunits reveal ligand-induced conformational changes.</a> Biochemistry. 36 (25), 7664-7680 (1997).</li>
<li>Schneider, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop+closure+and+intersubunit+communication+in+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 37 (16), 5394-5406 (1998).</li>
<li>Rhee, S., Miles, E. W., Davies, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crystallography+of+a+true+substrate%2C+indole-3-glycerol+phosphate%2C+bound+to+a+mutant+%28alphaD60N%29+tryptophan+synthase+alpha2beta2+complex+reveals+the+correct+orientation+of+active+site+alphaGlu49%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cryo-crystallography of a true substrate, indole-3-glycerol phosphate, bound to a mutant (alphaD60N) tryptophan synthase alpha2beta2 complex reveals the correct orientation of active site alphaGlu49.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (15), 8553-8555 (1998).</li>
<li>Weyand, M., Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+wild-type+tryptophan+synthase+complexed+with+the+natural+substrate+indole-3-glycerol+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of wild-type tryptophan synthase complexed with the natural substrate indole-3-glycerol phosphate.</a> Biochemistry. 38 (50), 16469-16480 (1999).</li>
<li>Sachpatzidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallographic+studies+of+phosphonate-based+alpha-reaction+transition-state+analogues+complexed+to+tryptophan+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Crystallographic studies of phosphonate-based alpha-reaction transition-state analogues complexed to tryptophan synthase.</a> Biochemistry. 38 (39), 12665-12674 (1999).</li>
<li>Yang, L. H., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+mutagenesis+and+overexpression+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium%3A+On+the+roles+of+beta+%282%29+subunit+Lys-382%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">PCR mutagenesis and overexpression of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium: On the roles of beta (2) subunit Lys-382.</a> Protein Expression and Purification. 8 (2), 126-136 (1996).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY. (2012).</li>
<li>Lowry, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Measurement+with+the+Folin+Phenol+Reagent%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent.</a> Journal of Biological Chemistry. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Kawasaki, H., Bauerle, R., Zon, G., Ahmed, S. A., Miles, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mutagenesis+of+the+alpha+subunit+of+tryptophan+synthase+from+Salmonella+typhimurium.+Changing+arginine+179+to+leucine+alters+the+reciprocal+transmission+of+substrate-induced+conformational+changes+between+the+alpha+and+beta+2+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Site-specific mutagenesis of the alpha subunit of tryptophan synthase from Salmonella typhimurium. Changing arginine 179 to leucine alters the reciprocal transmission of substrate-induced conformational changes between the alpha and beta 2 subunits.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (22), 10678-10683 (1987).</li>
<li>Battye, T. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Evans, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+and+Assessment+of+Data+Quality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Scaling and Assessment of Data Quality.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, Pt 1 72-82 (2006).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+replacement+with+MOLREP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 1 22-25 (2010).</li>
<li>Adams, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHENIX%3A+a+comprehensive+Python-based+system+for+macromolecular+structure+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 2 213-221 (2010).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+of+macromolecular+structures+by+the+maximum-likelihood+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 53, Pt 3 240-255 (1997).</li>
<li>Afonine, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+automated+crystallographic+structure+refinement+with+phenix.refine%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 68, Pt 4 352-367 (2012).</li>
<li>Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+content+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Solvent content of protein crystals.</a> Journal of Molecular Biology. 33 (2), 491-497 (1968).</li>
<li>Kantardjieff, K. A., Matthews Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coefficient+probabilities%3A+Improved+estimates+for+unit+cell+contents+of+proteins%2C+DNA%2C+and+protein-nucleic+acid+complex+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">coefficient probabilities: Improved estimates for unit cell contents of proteins, DNA, and protein-nucleic acid complex crystals.</a> Protein Science. 12 (9), 1865-1871 (2003).</li>
</ol>

저자는 공개하고 경쟁 금융 이익을 선언 할 아무것도 없다.

우리는 성공적으로 구조 기능 상관 관계 연구를위한2β2 βQ114A, α2β2 βK167T,α2 β2 βS377A 세인트TS 복합체를 α 돌연변이 형태를 성공적으로 설계했다. 처음에, 우리는 이전 정화 프로토콜을 사용하여 돌연변이를 정화하기 위해 노력했다22,이는 정제 하는 동안 PEG 8000 및 spermine와 α2β2세인트TS 복합 결정화를 필요로. 결정화 속도는 돌연변이 형태와 용액의 복합체 농도에 따라 다르지만, 결정이 큰 용액 부피에서 나타나는 시기를 예측하기 어렵다. 결정화는 장시간(48-96h) 후에 달성되거나 결정화 개시 후 PEG 8000의 추가 금액을 추가하는 데 필요한 중 하나를 달성할 수있다.15.
<p class="jove_...

트립토판 신타제(TS) 바이엔자임 복합체(α2 β 2)는알로스터 효소로, 박테리아, 식물, 곰팡이1,2,3에서아미노산 L-트립토판의 생합성에서 마지막 두 단계를 촉매한다. 박테리아 살모넬라 장내 세로바 티피무리움 (St)은인간과 다른 동물에서 심각한 위장 감염을 일으킨다. 인간과 더 높은 동물은 TS(EC 4.2.1.20)가 없기 때문에, S. typhimurium α2β2 TS 복합체 (α2β2StTS)의 억제는 크립토스포리디오스및 결핵4,생식기 및 안구 감염5,그리고잠재적인 그녀의 발동을 위한 잠재적 인 약물 대상으로 탐구되었습니다. α 서브유닛은 인돌-3-글리세롤-인산염(IGP)의 알돌리틱 분열을 글리세랄데히드-3-인산염(GAP)과 인돌로 촉매하여, 인돌닌 타우토머 중간체및 그 후 카본-카본 결합 분열의 형성을 통해 GAP및 인돌3,6을생성한다. β 촉매 부위에는 쉬프 베이스를 통해 β-Lys87에 결합된 피리독살 5′-인산염(PLP) 보조 분자가 포함되어 있으며, 이는 효소 β 서브유닛3,7에서반응하는 과정에서 전자 싱크로 기능한다. β 사이트는 L-트립토판과 PLP 의존 반응에서 물 분자를 제공하기 위해 인돌에 의해 L-세린 사이드 체인 하이드록실의 교체를 촉매한다. 세인트 (주) TS는 다효소 복합체2,3내의 기질 채널링 및 알로스터통신을 조사하는 오랜 모델역할을 한다. TS의 α 및 β 서브유닛 간의 양방향 알로스터 통신은 L-트립토판 합성3동안 촉매 단계를 동기화하고 인돌 방출을 방지할 필요가 있다. 이러한 노력을 확장하기 위해, 우리는 여러 돌연변이 (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr 및 β-Ser377Ala)를 단일 지점 돌연변이로 제조하여 효소 구조, 메커니즘 및 세인트TS β 서브 유닛의 촉매 부위에서의 관계의 추가 탐구에 사용할 수 있습니다.
α2β2StTS의 촉매 메커니즘에 대한 자세한 연구는 에디스 W. 마일즈의 연구 그룹에 의해 시작되었습니다. 네이티브 대장균 α2 β2 TS 복합체를 통한 초기 연구는 격리된 α 서브유닛8,9,격리된 β 서브유닛10,11 및 α2 β 2TS 단지의 재구성에 초점을 맞추고 있다12. 정제는 황산염 강수량 암모늄, 샘플 투석, DEAE-세바덱스 크로마토그래피, 투석 및 DEAE-Sephadex 컬럼12에대한 제2 크로마토그래피 라운드에 의해 수행되었다. 또 다른 프로토콜에서, 동일한 복합체의 정제는 DEAE-Sephadex 컬럼에 정제된 세포 용재를 적재하고 세파로즈 4B 컬럼, 황산암모늄 강수량 및투석(13)에크로마토그래피 단계를 거쳐 개선되었다. 두 정화 프로토콜모두 4-5일 동안 지속됩니다. 대장균 α2 β2 TS 복합체는 결정화되었지만 그 당시 의결은 X선 회절에 적합하지 않았다.
새로운 연구에서는, 재조합 및 야생형 형태의 S. typhimurium α2β2 TS 복합체는14,15로정결되었다. 재조합 α2β2stTS 복합체는 pEBA-10 발현 벡터를 운반하는 대장균 CB149로 과발현되었다. 초기 결정화 및 X선 회절 데이터 수집 및 분석α2β2StTS 복합체의 분석은14보고되었다. 그러나, α 같은 길고 얇은 바늘2β2세인트TS 크리스탈 구조 연구를 손상. 더 나은 X선 회절 데이터를 수집하기 위해, 또 다른 정화 프로토콜은 α2β2StTS 복합체15의야생 유형 및 돌연변이 형태를 정화하기 위해 설명되었다. 정화는 스퍼민과 PEG 8,000을 사용하여 초기 침전을 명확히 된 세포 용액으로 수행하였고 큰 부피가 큰 침전물을 원심분리에 의해 제거하였다. α 2 β2세인트TS복합체의 높은 양을 포함하는 상주 분획은 황색 결정이 침전될 때까지 4°C에서 16-48h로 저장하였다. 크리스탈은 다른 버퍼에 대해 세척하고 광범위하게 투석되었습니다. 단백질 복합체는 황산암모늄을 함유하는 완충액으로재결정되었고, 투석15. 단백질 결정화는 용액의 단백질 및 침전물 농도에 따라 달라지지만, 용액에서 다른 돌연변이 형태인 α2β2StTS 콤플렉스에 대한 정화를 모니터링, 예측 및 재현하기는 어렵다. 이 프로토콜은 크로마토그래피 방법을 사용하지 않는다는 장점이 있습니다. 그러나, 단점은 결정화, 투석 및 재결정화에 필요한 긴 정화 시간이며, 전형적으로 5-7일이 필요하다. X선 데이터 수집에 적합한 결정을 얻기 위해 600개 이상의 결정화 조건은 단백질 농도, 온도, 강수제(PEG 4,000, 6,000 및 8,000) 및 첨가제(CaCl2,MnCl2,ZnCl2,카다베린, 퍼드린, 퍼드린, 스프레딘, 스프레시네, 스프레딘, 스프레시네,15. 크리스탈은 더 나은 결정 형태를 가지고 있었고 12 % PEG 8,000 및 2 mM 스페민을 포함하는 조건에서 더 빠르게 성장했습니다. 결정화는 4, 30 또는 42°C보다 25°C에서 더 유리했으며3일 15일이내에 최대 치수로 성장하였다. 몇몇α2β 2StTS 결정 구조물은 그 당시 (1996-1999)16,17,18,19,20,21 및 그밖 많은 구조물이 현재까지 간행되었습니다 보고되었습니다.
여기서 주요 목적은 트립토판 신체화를 정화하고 단백질 결정화를 최적화하기 위한 대체 프로토콜을 제시하는 것입니다. 본 작품은 야생형 절연 α 서브유닛(αStTS), 격리된 β 서브유닛(βStTS), α2 β2st TS 복합체, α2 β2StTS 복합체의 야생형 및 돌연변이 형태 를 정화하는 상당한 개선을보여준다. 정제 시간이 현저히 단축되고 결정화 및 극저온 보호가 최적화되었기 때문에 과거의 프로토콜에 비해 이점이 상당합니다. 이 작품에서 설계된 α2β2세인트TS 복합체의 돌연변이 형태는 야생 형 형태에 사용되는 동일한 조건 근처에서 결정화되었습니다. 그러나, 미세 결정화 최적화는 거의 원자 분해능에서 구조 판정을 위한 충분한 품질의 큰 단결정획득이 필요하였다. 현재까지, 단백질 데이터 뱅크(PDB)에 증착된 134개의 트립토판 신체 결정 구조물이 있으며, 각각 101, 31 및 2개의 결정 구조를 각각 박테리아, 고고학 및 진핵생물에 대해 회계합니다. 멋지게, 73 구조는 S. 엔테리카 세로바 티피무륨에 속하고 5 α 의 5 결정 구조2β2세인트TS 단지는 1.50 Angstroms보다 높은 해상도 한계를 가지고있다. 당연히, 4 아웃 5 우리의 연구 그룹에서 준비 되었다 (PDB IDs:5CGQ 에서 1.18 Å, 4HT3 에서 1.30 Å, 4HPJ 에서 1.45 Å, 6DZ4 에서 1.45 Å 해상도). α2β2StTS 복합체의 돌연변이 형태의 정제 된 결정 구조는 L-트립토판 합성에 관련된 필수 아미노산 잔류물이 연주 되는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공 할 것으로 예상됩니다.

<table><tbody><tr><td>15 mL 10 kDa 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC901024</td><td>원심 필터 유닛</td></tr><tr><td>15 mL 100 kDa 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td>UFC910024</td><td>원심 필터 유닛</td></tr><tr><td>2 mL 극저온 바이알</td><td>Corning</td><td>CLS430489</td><td>극저온 바이알</td></tr><tr><td>2 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-141</td><td>마이크로 원심분리기 튜브</td></tr><tr><td>24-well Cryschem Plate,</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-158</td>, <td>24-well sitting drop plate</td></tr>, <tr><td>2-mercaptoethanol</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td>Chemical</td></tr>, <tr><td>50mL 원심분리기 원추형 튜브</td><td>, Thermo Scientific</td><td>12-565-270</td><td>원심분리기 원추형 튜브</td></tr>, <tr><td>AB15 ACCUMET Basic</td><td>, Fisher Scientific</td><td>13-636-AB15</td><td>pH 측정기</td></tr>, <tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1356-100</td><td>아가로스 젤</td></tr><tr><td>황산암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td>화학</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>항생제</td></tr><tr><td>박테리아 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>S35836</td><td>인큐베이터.</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>비신</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2646100</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Branson 450 디지털 소탐지기</td><td>Brason</td><td>B450</td><td>세포 교란 물질</td></tr><tr><td>염화 세슘</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP210-100</td><td>화학</td></tr><tr><td>수산화 세</td>슘 <td>Acros 유기물</td><td>AC213601000</td><td>화학 물질</td></tr><tr><td>클로람페니콜</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP904-100</td><td>항생제</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>D1391</td><td>화학</td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP172-5</td><td>화학</td></tr><tr><td>DNA 중합효소</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>HF 중합효소</td></tr><tr><td>dNTP 세트</td><td>Invitrogen</td><td>10-297-018</td><td>dNTP 세트</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td>화학</td></tr><tr><td>Excella E25R 오비탈 셰이커</td><td>Eppendorf New Brunswick</td><td>M1353-0004</td><td>오비탈 인큐베이터</td></tr><tr><td>GE AKTA 프라임 플러스</td><td>GE 헬스케어</td><td>8149-30-0004</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>겔 추출 키트</td><td>Invitrogen</td><td>K210012</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G33-500</td><td>화학</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>R0104S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>His-Trap 컬럼</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-5255-01</td><td>5mL Histrap 컬럼</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196-500</td><td>화학</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0392</td><td>유도제</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Kelvinator Series-100</td><td>Kelvinator</td><td>단종</td><td>초저온 냉동고</td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>액체 육수</td></tr><tr><td>Luria Bertani 한천</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td>고체 육수</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>화학</td></tr><tr><td>NcoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0193S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>Ni-NTA 친화성 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R90115</td><td>Ni-NTA 아가로스 비드</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP233-100</td><td>화학</td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>44-865-0</td><td>화학</td></tr><tr><td>pyridoxal phosphate</td><td>Acros Organics</td><td>AC228170010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>S-200 HR</td><td>Cytiva</td><td>45-000-196</td><td>크기 제외 컬럼</td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156S</td><td>제한 효소</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>화학</td></tr><tr><td>Sorvall RC-5B 원심 분리기</td><td>Sorvall</td><td>8327-30-1004</td><td>바닥 cetrifuge</td></tr><tr><td>Spermine</td><td>Acros Organics</td><td>AC132750010</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Superdex 200 prep grade</td><td>Cytiva</td><td>45-002-491</td><td>크기 제외 컬럼</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>DNA liagse</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Ubl-specific protease 1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12588018</td><td>SUMO 프로테아제</td></tr></tbody></table>

pcr 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

살모넬라 타이피무륨의 트립토판 신체(TS) 바이엔자임 복합체(α2β2 TS)를 함유한 구조 연구는 촉매 메커니즘, 알로스터식 거동, 그리고 PLP 의존 효소에서 제품에 기판의 효소 변환에 대한 세부 사항을 더 잘 이해하기 위해 수행되었습니다. 이 작품에서, 고립된 α 및 고립된 β 서브유닛을 생성하는 새로운 표현 시스템은 2일 이내에 고립된 서브유닛으로부터 고량의 순수 서브유닛과 α2 β2stTS 콤플렉스의 정화를 허용하였다. 정제는 친화성 크로마토그래피에 의해 수행되었고, 그 다음으로 친화태그, 황산암모늄 강수량 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 분열이 뒤따랐다. 효소 β 부위의 주요 잔류물의 역할을 더 잘 이해하기 위해, 현장 직접 돌연변이 발생은 이전 구조 연구에서 수행되었다. 또 다른 프로토콜은 야생 유형과 돌연변이 α2β2세인트TS 단지를 정화하기 위해 만들어졌습니다. 암모늄 황산염 분획 및 SEC를 사용하는 간단하고 빠르고 효율적인 프로토콜은 하루에2β2StTS 단지의 α 정화할 수 있었습니다. 이 작업에 기재된 두 정제 프로토콜은 이전 프로토콜과 비교하여 PEG 8000및 spermine을 사용하여 동일한 복합체를 정화하여 정화 프로토콜을 따라 α2β2stTS 단지를 결정화할 때 상당한 이점이 있다. 야생 유형 및 일부 돌연변이 형태의 결정화는 PEG 8000 및 spermine을 사용하여 일부 돌연변이체의 정제를 손상시키는 약간 다른 조건에서 발생합니다. 엑스레이 결정학 연구에 적합한 결정을 준비하기 위해 결정화, 결정 품질 및 냉동 보호를 최적화하기 위해 몇 가지 노력을기울였습니다. 여기에 제시 된 방법은 일반적으로 트립토판 synthase 서브 유닛과 야생 유형 및 돌연변이 α2β2세인트TS 단지의 정화에 적용해야합니다.

α정화- 및 트립토판 신체의 β서브 유닛 살모넬라 타이피무륨 트립토판 신체의 α-서브유닛(αSt TS)과 β-서브유닛(βStTS)은 수정된 pET SUMO 벡터에서 분리하였다. 도 1A는 His6-SUMO-αStTS(레인 αON) 및 His6-SUMO-βStTS(레인 βON) 융합 단백질에 대응하는 두 개의 강력한 밴드의 대표적인 SDS-PAGE 결과를 나타낸다. 이 작업에 기재된 정화 프로토콜은 2일 이내에 두 하위 단위의 정제를 개별적으로 허용하였다. 첫날은 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피, 황산암모늄 강수량, 그 순모 태그 분열, 그의 수모 태그 흔적 제거, 단백질 농도에 의해 각 단...

이 문서는 살모넬라 타이피무륨 트립토판 synthase의 발현 및 정화를 위한 일련의 연속적인 방법을 제시하며, 이 프로토콜은 하루에 단백질 복합체를 정화하는 신속한 시스템이다. 커버되는 방법은 현장 지향 돌연변이 발생, 대장균의단백질 발현, 친화 성염색로그래피, 젤 여과 크로마토그래피 및 결정화입니다.

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Salmonella typhimurium에서 추출한 효소 트립토판 합성효소를 정제하는 이 프로토콜은 빠르고 간단하며 짧습니다. 황산암모니아 분별 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하면 야생형 및 돌연변이 트립토판 합성효소 복합체를 단 하루 만에 정제할 수 있습니다. 이 기술은 암모니아 설페이트 분별 및 크기 배제 크로마토그래피가 태그가 지정되지 않은 단백질을 정제하는 데 일반적으로 사용되기 때문에 다른 관련 단백질을 정제하는 데 적용할 수 있습니다.시작하려면 10초 펄스와 20초 휴식을 사용하여 20주기 동안 80% 진폭의 얼음물 수조에서 초음파 처리하여 세포 펠릿을 파괴합니다. 세포 용해물을 30, 25 섭씨 온도에 30 분 동안 000 시간 g에 원심 분리하고, 펠릿 제거 없이 상등액을 흡인하십시오. 정화된 상등액 분획을 실온에서 0.45마이크로미터 필터로 여과합니다.20% 포화에 도달할 때까지 소량의 황산암모늄을 여과액에 천천히 첨가합니다. 섭씨 25도에서 황산암모늄 분별을 수행하고 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액을 10분 동안 부드럽게 저어줍니다. 용액을 다시 10분 동안 원심분리하고 나중에 사용할 수 있도록 상등액을 깨끗한 플라스크에 옮깁니다.펠릿을 20ml의 샘플 버퍼에 부드럽게 재현탁시키고 SDS-PAGE를 실행할 샘플을 준비합니다. 30% 포화에 도달할 때까지 상등액에 황산암모늄을 첨가하고 기포를 피하면서 용액을 저어줍니다. 용액을 다시 10분 동안 원심분리하고 나중에 사용할 수 있도록 상층액을 깨끗한 플라스크에 옮깁니다.얻어진 40% 펠릿 분획을 10ml의 샘플 버퍼 2에 부드럽게 재현탁시키고 SDS-PAGE를 실행할 샘플을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20분 동안 10, 000회 g에서 40% 단백질 샘플을 마이크로 원심분리하고, 얻어진 상등액을 분당 0.5밀리리터의 유속으로 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기에 부착된 이전에 평형을 이룬 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 컬럼에 로드합니다. Coomassie brilliant blue로 염색된 12%SDS-PAGE 젤에서 수집된 피크 분획과 황산암모늄 분획을 평가합니다.3, 000 시간 g에, 4 섭씨 온도에 회전시켜서 100 kilodalton 원심 여과기를 가진 사나운 유형 또는 돌연변이 알파 2 beta-two Salmonella typhimurium 트립토판 synthase 복합물을 집중시키십시오. 농축한 단백질을 신선한 2 밀리리터 관으로 옮기고, 다시 10, 4개 도에 10 분 동안 g 000 번 골재를 제거하기 위하여 원심분리하십시오. 샘플의 단백질 농도를 측정한 후 밀리리터당 20-25mg씩 0.5ml 분취량을 준비합니다.액체 질소에 급속 동결하고 영하 80도에서 보관하십시오. 물에 200 밀리몰 스페르민의 5 밀리리터 스톡 용액을 준비하고 영하 20도에서 500 마이크로 리터 분취액에 보관하십시오. 그런 다음 물에 30%폴리에틸렌 글리콜 8, 000의 50밀리리터 원액을 준비하고 섭씨 25도에서 50밀리리터 일회용 원심분리기 원추형 플라스크에 25밀리리터를 보관합니다.1몰 염화세슘과 염화나트륨의 25ml 원액을 각각 물에 넣고 섭씨 25도로 유지합니다. 1몰 바이신의 50ml 원액 3세트를 준비하고 수산화세슘 또는 수산화나트륨으로 적정하여 pH 7.6, 7.8 및 8에서 완충 용액을 얻습니다. 용액의 25ml 부분 표본을 섭씨 4도로 유지합니다.알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체 샘플을 얼음 욕조에서 해동합니다. 다음 마이크로 분리기는 10, 25 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 그것을 검사한다. 투명한 상등액 분획물을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮깁니다.상등액의 단백질 농도를 추정하고, 50 밀리몰 세슘 또는 염화나트륨을 함유하는 pH 7.8의 50 밀리몰 바이신 수산화세슘 또는 수산화바이신 나트륨으로 분취액을 밀리리터당 15 밀리그램으로 희석한다. 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 3개의 24웰 시팅 드롭 플레이트를 위한 500마이크로리터의 저장 용액을 준비합니다. PEG 8, 000 및 spermine의 농도를 변경하고 각 세트에 대한 텍스트 원고에 설명된 대로 완충액 pH를 변경합니다.관을 덮고, 기포를 제거하기 위하여 10, 000 시간 g에 10 분 동안 10 분 동안 그(것)들을 원심분리하기 전에 관을 덮고, 격렬하게 와동을 일으키십시오. 각 저장소에 이 용액 500마이크로리터를 분배합니다. P-10 마이크로피펫을 사용하여 리터당 15마이크로그램의 단백질 용액 5마이크로리터를 각 드롭 웰에 분배합니다.그런 다음 각 해당 저장소 용액 5마이크로리터를 단백질 방울에 추가합니다. 혼합하는 동안 기포를 피하고 위아래로 피펫팅하지 마십시오. 마지막으로 투명 접착 테이프로 플레이트를 덮고 25도에서 보관하십시오.결정은 2일에서 5일 안에 나타나고 2주 이내에 전체 크기로 자랍니다. 이 프로토콜은 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소의 알파 소단위체와 베타 소단위체를 변형된 pET SUMO 벡터에 subclone하는 데 사용되었습니다. His6-SUMO-알파 및 His6-SUMO-베타 트립토판 합성효소 융합 단백질에 해당하는 두 개의 강력한 밴드의 대표적인 SDS-PAGE 결과가 여기에 나와 있습니다.각 단백질을 니켈-니트릴로트리아세트산 친화성 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전으로 정제한 후 His-SUMO-태그 절단, His-SUMO-태그 흔적 제거 및 단백질 농도 측정을 수행했습니다. SEC의 알파 소단위체, 베타 소단위 및 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 용리 프로필과 이들의 피크 분획의 순도가 여기에 나와 있습니다. 트립토판 합성효소 복합체의 돌연변이 형태를 생성한 후, 이종 발현 시스템에서 오염 단백질을 제거하기 위해 황산암모늄 분획을 사용했습니다.배제 크로마토그래피 컬럼에서 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 상대적 용리 위치를 가진 대표적인 용리 프로파일이 여기에 나와 있습니다. 제외된 피크 분획물의 순도는 풀링(pooling) 전에 SDS-PAGE를 사용하여 분석되었습니다. PEG 8, 000 및 스페르민 농도 및 바이신 완충액 pH를 변화시켜 미세 결정화 최적화를 통해 큰 단결정을 얻었습니다.형태가 다른 결정은 2일에서 5일 안에 나타났고 2주 이내에 전체 크기로 자랐습니다. 야생형 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 결정 구조에 대한 전자 밀도 맵의 검증은 결정 구조 정제 후에 설명되었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 트립토판 합성효소 활성 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 실온에서 초기 정제 단계를 완료하십시오.돌연변이의 결정 구조는 L-트립토판 합성에서 주요 잔류물이 수행하는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것으로 예상됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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선호도 태그 재조합 단백질의 높은 처리량 정화

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항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

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단일 분자 수준에서 고정밀 FRET 실험을위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 또한,이 방법론은 N- 메틸 -D- 아스 파르 테이트 (NMDA) 수용체의 리간드 결합 도메인에서 3 개의 구조 상태를 확인하는데 사용될 수있다. 정확한 거리를 결정하는 것은 FRET 실험에 기반한 구조 모델을 구축하기위한 첫 번째 단계입니다.

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세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

이 프로토콜은 돌연변이 L274G-메티오닌 tRNA 신테타제(MetRS*)를 발현하는 마우스 라인을 사용하여 아지도노르류신(ANL)으로 세포 유형 특이적 단백질 표지를 수행하는 방법과 표지된 세포 유형 특이적 단백질 분리에 필요한 단계를 설명합니다. 살아있는 마우스에서 (1) 식수와 (2) 복강 주사로 두 가지 가능한 ANL 투여 경로를 설명합니다.

돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

학습하세요 Salmonella typhimurium에서 트립토판 신타제를 하루 만에 정제하는 빠른 프로토콜입니다. 암모늄 황산 분획과 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 야생형 및 돌연변이 효소 복합체를 효율적으로 분리할 수 있습니다.

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

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