PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Salmonella typhimurium에서 추출한 효소 트립토판 합성효소를 정제하는 이 프로토콜은 빠르고 간단하며 짧습니다. 황산암모니아 분별 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하면 야생형 및 돌연변이 트립토판 합성효소 복합체를 단 하루 만에 정제할 수 있습니다. 이 기술은 암모니아 설페이트 분별 및 크기 배제 크로마토그래피가 태그가 지정되지 않은 단백질을 정제하는 데 일반적으로 사용되기 때문에 다른 관련 단백질을 정제하는 데 적용할 수 있습니다.

시작하려면 10초 펄스와 20초 휴식을 사용하여 20주기 동안 80% 진폭의 얼음물 수조에서 초음파 처리하여 세포 펠릿을 파괴합니다. 세포 용해물을 30, 25 섭씨 온도에 30 분 동안 000 시간 g에 원심 분리하고, 펠릿 제거 없이 상등액을 흡인하십시오. 정화된 상등액 분획을 실온에서 0.45마이크로미터 필터로 여과합니다.

20% 포화에 도달할 때까지 소량의 황산암모늄을 여과액에 천천히 첨가합니다. 섭씨 25도에서 황산암모늄 분별을 수행하고 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액을 10분 동안 부드럽게 저어줍니다. 용액을 다시 10분 동안 원심분리하고 나중에 사용할 수 있도록 상등액을 깨끗한 플라스크에 옮깁니다.

펠릿을 20ml의 샘플 버퍼에 부드럽게 재현탁시키고 SDS-PAGE를 실행할 샘플을 준비합니다. 30% 포화에 도달할 때까지 상등액에 황산암모늄을 첨가하고 기포를 피하면서 용액을 저어줍니다. 용액을 다시 10분 동안 원심분리하고 나중에 사용할 수 있도록 상층액을 깨끗한 플라스크에 옮깁니다.

얻어진 40% 펠릿 분획을 10ml의 샘플 버퍼 2에 부드럽게 재현탁시키고 SDS-PAGE를 실행할 샘플을 준비합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20분 동안 10, 000회 g에서 40% 단백질 샘플을 마이크로 원심분리하고, 얻어진 상등액을 분당 0.5밀리리터의 유속으로 고속 단백질 액체 크로마토그래피 기기에 부착된 이전에 평형을 이룬 HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR 컬럼에 로드합니다. Coomassie brilliant blue로 염색된 12%SDS-PAGE 젤에서 수집된 피크 분획과 황산암모늄 분획을 평가합니다.

3, 000 시간 g에, 4 섭씨 온도에 회전시켜서 100 kilodalton 원심 여과기를 가진 사나운 유형 또는 돌연변이 알파 2 beta-two Salmonella typhimurium 트립토판 synthase 복합물을 집중시키십시오. 농축한 단백질을 신선한 2 밀리리터 관으로 옮기고, 다시 10, 4개 도에 10 분 동안 g 000 번 골재를 제거하기 위하여 원심분리하십시오. 샘플의 단백질 농도를 측정한 후 밀리리터당 20-25mg씩 0.5ml 분취량을 준비합니다.

액체 질소에 급속 동결하고 영하 80도에서 보관하십시오. 물에 200 밀리몰 스페르민의 5 밀리리터 스톡 용액을 준비하고 영하 20도에서 500 마이크로 리터 분취액에 보관하십시오. 그런 다음 물에 30%폴리에틸렌 글리콜 8, 000의 50밀리리터 원액을 준비하고 섭씨 25도에서 50밀리리터 일회용 원심분리기 원추형 플라스크에 25밀리리터를 보관합니다.

1몰 염화세슘과 염화나트륨의 25ml 원액을 각각 물에 넣고 섭씨 25도로 유지합니다. 1몰 바이신의 50ml 원액 3세트를 준비하고 수산화세슘 또는 수산화나트륨으로 적정하여 pH 7.6, 7.8 및 8에서 완충 용액을 얻습니다. 용액의 25ml 부분 표본을 섭씨 4도로 유지합니다.

알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체 샘플을 얼음 욕조에서 해동합니다. 다음 마이크로 분리기는 10, 25 섭씨 온도에 10 분 동안 000 시간 g에 그것을 검사한다. 투명한 상등액 분획물을 깨끗한 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

상등액의 단백질 농도를 추정하고, 50 밀리몰 세슘 또는 염화나트륨을 함유하는 pH 7.8의 50 밀리몰 바이신 수산화세슘 또는 수산화바이신 나트륨으로 분취액을 밀리리터당 15 밀리그램으로 희석한다. 멸균 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 3개의 24웰 시팅 드롭 플레이트를 위한 500마이크로리터의 저장 용액을 준비합니다. PEG 8, 000 및 spermine의 농도를 변경하고 각 세트에 대한 텍스트 원고에 설명된 대로 완충액 pH를 변경합니다.

관을 덮고, 기포를 제거하기 위하여 10, 000 시간 g에 10 분 동안 10 분 동안 그(것)들을 원심분리하기 전에 관을 덮고, 격렬하게 와동을 일으키십시오. 각 저장소에 이 용액 500마이크로리터를 분배합니다. P-10 마이크로피펫을 사용하여 리터당 15마이크로그램의 단백질 용액 5마이크로리터를 각 드롭 웰에 분배합니다.

그런 다음 각 해당 저장소 용액 5마이크로리터를 단백질 방울에 추가합니다. 혼합하는 동안 기포를 피하고 위아래로 피펫팅하지 마십시오. 마지막으로 투명 접착 테이프로 플레이트를 덮고 25도에서 보관하십시오.

결정은 2일에서 5일 안에 나타나고 2주 이내에 전체 크기로 자랍니다. 이 프로토콜은 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소의 알파 소단위체와 베타 소단위체를 변형된 pET SUMO 벡터에 subclone하는 데 사용되었습니다. His6-SUMO-알파 및 His6-SUMO-베타 트립토판 합성효소 융합 단백질에 해당하는 두 개의 강력한 밴드의 대표적인 SDS-PAGE 결과가 여기에 나와 있습니다.

각 단백질을 니켈-니트릴로트리아세트산 친화성 크로마토그래피 및 황산암모늄 침전으로 정제한 후 His-SUMO-태그 절단, His-SUMO-태그 흔적 제거 및 단백질 농도 측정을 수행했습니다. SEC의 알파 소단위체, 베타 소단위 및 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 용리 프로필과 이들의 피크 분획의 순도가 여기에 나와 있습니다. 트립토판 합성효소 복합체의 돌연변이 형태를 생성한 후, 이종 발현 시스템에서 오염 단백질을 제거하기 위해 황산암모늄 분획을 사용했습니다.

배제 크로마토그래피 컬럼에서 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 상대적 용리 위치를 가진 대표적인 용리 프로파일이 여기에 나와 있습니다. 제외된 피크 분획물의 순도는 풀링(pooling) 전에 SDS-PAGE를 사용하여 분석되었습니다. PEG 8, 000 및 스페르민 농도 및 바이신 완충액 pH를 변화시켜 미세 결정화 최적화를 통해 큰 단결정을 얻었습니다.

형태가 다른 결정은 2일에서 5일 안에 나타났고 2주 이내에 전체 크기로 자랐습니다. 야생형 알파-2 베타-2 Salmonella typhimurium 트립토판 합성효소 복합체의 결정 구조에 대한 전자 밀도 맵의 검증은 결정 구조 정제 후에 설명되었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 트립토판 합성효소 활성 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 실온에서 초기 정제 단계를 완료하십시오.

돌연변이의 결정 구조는 L-트립토판 합성에서 주요 잔류물이 수행하는 메커니즘과 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것으로 예상됩니다.