Name: 막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 막 단백질을 나노디스크에 공동 번역 삽입하는 방법을. 세제 없이 효율적이고 안정적인 막 단백질 합성이 가능하며, 구조 연구와 기능 분석에 활용됩니다.

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DFG(Deutsche Forschungsgemeinschaft) 보조금 BE1911/8-1, LOEWE 프로젝트 GLUE 및 협업 연구 센터인 Transport and Communication across Membranes(SFB807)에 재정 지원에 감사드립니다.

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<li>Shelby, M. L., He, W., Dang, A. T., Kuhl, T. L., Coleman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+co-translational+approaches+for+producing+mammalian+receptors%3A+expanding+the+cell-free+expression+toolbox+using+nanolipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cell-free co-translational approaches for producing mammalian receptors: expanding the cell-free expression toolbox using nanolipoproteins.</a> Frontiers in Pharmacology. 10 (744), 1-12 (2019).</li>
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<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+native+membrane+protein+assembly+in+nanodiscs+by+combined+non-covalent+mass+spectrometry+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Analyzing native membrane protein assembly in nanodiscs by combined non-covalent mass spectrometry and synthetic biology.</a> eLife. 6, 1-19 (2017).</li>
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<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+requirements+for+the+enzymatic+activity+of+MraY+translocases+and+in+vitro+reconstitution+of+the+lipid+II+synthesis+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lipid requirements for the enzymatic activity of MraY translocases and in vitro reconstitution of the lipid II synthesis pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (5), 2535-2546 (2016).</li>
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<li>Schwarz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+scale+expression+of+membrane+proteins+in+Escherichia+coli-based+continuous+exchange+cell-free+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparative scale expression of membrane proteins in Escherichia coli-based continuous exchange cell-free systems.</a> Nature Protocols. 2 (11), 2945-2957 (2007).</li>
<li>Yang, J. P., Cirico, T., Katzen, F., Peterson, T. C., Kudlicki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+a+functional+G+protein-coupled+receptor+complexed+with+nanometer+scale+bilayer+discs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of a functional G protein-coupled receptor complexed with nanometer scale bilayer discs.</a> BMC Biotechnology. 11 (57), (2011).</li>
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<li>Henrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+function+cell-free+electrophysiological+and+optical+analysis+of+ion+pumps+in+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">From gene to function cell-free electrophysiological and optical analysis of ion pumps in nanodiscs.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1331-1341 (2017).</li>
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</ol>

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CF 발현을 최적화하기 위한 설정 및 전략과 기능성 MP를 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하는 방법이 설명되어 있습니다. 필요한 장비는 바이오리액터, 프렌치 프레스 장치 또는 이와 유사한 장치, UV/VIS 및 형광 판독기, 2구획 구성 설정에 적합한 CF 반응 용기 및 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 추가 표준 장비로는 대장균 세포 수확을 위한 원심분리기와 S30 용해물 준비를 위해 최소 30,000 x g에 도달하는 탁상용 원심분리기가 있습니다. S80-S100 용해물을 준비해야하는 경우 초 원심 분리기가 필요합니다. 나열된 장비는 생화학 실험실에서 정기적으로 사용할 수 있으며 CF 발현을 시작하기 위해 더 큰 초기 투자가 필요하지 않습니다. 또한 CF 용해물 및 T7RNAP 제제를 위한 대장균 세포의 발효 및 취급은 일반적이고 강력한 기술입니다. 가장 비싼 화합물은 CF 용해물, T7RNA 및 나노 디스크입니다. 신뢰할 수 있고 효율적인 프로토콜로 제조할 수 있으며 분취량...

막 단백질(MPs)은 수성 환경에서의 불용성으로 인해 단백질 생산 연구에서 도전적인 표적입니다. 기존의 MP 생산 플랫폼은 대장균, 효모 또는 진핵 세포와 같은 세포 기반 시스템으로 구성됩니다. 합성된 재조합 MP는 세포막으로부터 추출되거나 봉입체로부터 재접힌다1. 세제 가용화 후, MP는 체외 재구성 프로토콜을 확립하여 적절한 막 환경으로 옮겨질 수 있습니다. 소포 및 리포좀 외에도 MP는 나노 디스크2 또는 살리 프로3 입자 형태의 평면 막으로 재구성되어 최근에 일상적인 기술이되었습니다. 그러나 이러한 모든 전략은 불안정화, 올리고머의 해리, 심지어 단백질 구조및 활성의 손실을 초래할 수 있는 MP와의 세제 접촉을 의미합니다4. 따라서 최적의 세제 가용화 및 재구성 조건을 위한 스크리닝은 지루하고 시간이 많이 소요될 수 있습니다5.
무세포(CF) 시스템의 개방 특성으로 인해 발현 반응이 정의된 지질 조성으로 미리 형성된 멤브레인에 직접 공급될 수 있습니다. 이 지질 기반 발현 모드(L-CF)에서, 합성된 MP는 제공된 이중층(6,7)에 공동 병진적으로 삽입할 기회를 갖는다(도 1). 평면 지질 이중층 디스크(8)를 둘러싸는 막 스캐폴드 단백질(MSP)로 구성된 나노디스크는 이러한 전략9, 10에 특히 적합한 것으로 보인다. 나노디스크는 다양한 지질로 시험관 내에서 일상적으로 조립할 수 있고, 매우 안정적이며, 스톡은 최대 1mM까지 농축될 수 있다. 그러나 대장균에서의 MSP 발현 및 정제가 필요합니다. 대안적인 전략으로서, MSP는 리포좀11,12,13과 함께 공급된 CF 반응에서 표적 MP와 함께 발현될 수 있다. MSP와 MP 모두에 대한 DNA 템플릿이 반응에 추가되고 발현 시 MP/나노디스크가 형성될 수 있습니다. MSP 생산은 피할 수 있지만 공동 발현 전략은 최종 DNA 주형 농도를 신중하게 미세 조정해야 하며 샘플 생산 효율성의 더 높은 변동을 기대할 수 있습니다.
미리 형성된 나노 디스크의 막에 MP의 공동 번역 삽입은 트랜스 로콘 기계 및 신호 서열13,14,15,16과 독립적 인 비 생리 학적 및 여전히 크게 알려지지 않은 메커니즘입니다. 삽입 효율의 주요 결정 인자는 막 단백질의 유형뿐만 아니라 제공된 막의 지질 조성이며, 음전하를 띤 지질에 대한 빈번한 선호15,17. 나노디스크 막이 크기가 상대적으로 제한되어 있기 때문에, MP 삽입시 상당한 양의 지질이 방출된다(18). 나노디스크 크기의 변화는 더 높은 올리고머 MP 복합체(15,18)의 삽입 및 튜닝을 가능하게 한다. 그 중에서도 이온 채널 KcsA, 이온 펌프 프로테오르호돕신(PR) 및 다제 수송체 EmrE15,18에 대해 호모올리고머 복합체의 올바른 조립이 나타났습니다. MP는 상대적으로 동일한 주파수로 양쪽에서 대칭 나노 디스크 막으로 들어갈 가능성이 높습니다. 따라서 하나의 나노 디스크에 삽입 된 상이한 단량체 또는 올리고머는 반대 배향을 가질 수 있음을 고려해야한다. 그러나, 배향의 편향은 PR 헥사머 및 KcsA 사량체18의 형성에 대해 보고된 바와 같은 협력적 삽입 메커니즘에 의해 야기될 수 있다. MP 방향의 추가 편향은 아마도 나노 디스크 멤브레인의 가장자리에 삽입 된 MP의 방향 스위치로 인해 발생할 수 있습니다.
E. coli 균주로부터 CF 용해물의 생산은 신뢰할 수 있는 일상적인 기술이며 거의 모든 생화학 실험실(19,20)에서 수행될 수 있습니다. 이황화 다리 형성 외에도 MP가 대장균 용해물을 사용하여 합성되는 경우 대부분의 다른 번역 후 변형이 없다는 점을 고려해야합니다. 이것은 구조 연구를 위해 더 균질한 샘플을 생성할 수 있지만 개별 MP 표적의 기능에 대한 잠재적 영향을 배제해야 할 수도 있습니다. 그러나, E. coli CF 용해물에서 G- 단백질 결합 수용체 (GPCR) 14,21,22, 진핵 수송 체 23 또는 큰 이종 이성질체 어셈블리 24의 고품질 샘플의 효율적인 생산은 복잡한 표적에 대한 적합성을 나타냅니다. 시료의 분취 스케일 양(≈ 1 mg/mL)은 반응 혼합물(RM)과 공급 혼합물(FM) 구획으로 구성된 2구획 연속 교환 무세포(CECF) 구성으로 얻을 수 있습니다. FM 부피는 RM 부피의 15 내지 20배를 초과하고, 저분자량 에너지 화합물 및 전구체(19)의 저장소를 제공한다. 따라서 발현 반응은 수 시간 동안 연장되고 MP 표적의 최종 수율이 증가합니다. RM 및 FM 구획은 10-14kDa 컷오프가있는 투석막으로 분리됩니다. 두 구획에는 CECF 반응 용기의 특수 설계가 필요합니다(그림 1). RM 용기로서의 상업용 투석 카세트와 FM을 보유하는 맞춤형 플렉시 유리 용기가 적합한 예입니다. MP 수율은 RM:FM 비율을 수정하거나 일정 기간 배양 후 FM을 교환하여 추가로 조작할 수 있습니다.
MP의 수율과 품질은 종종 반응 파라미터의 집중적인 최적화를 필요로 합니다. CF 발현의 중요한 장점은 MP의 개별 요구 사항에 따라 거의 모든 화합물을 수정하고 미세 조정할 수 있다는 것입니다. 간단한 전략은 먼저 기본 생산 프로토콜을 수립하여 MP의 수율을 개선하는 데 집중한 다음 반응 및 접힘 조건을 미세 조정하여 MP 품질을 최적화하는 것입니다. CF 용해물에 생리학적 과정이 없고 복잡성이 감소하면MP25의 효율적인 생산을 위한 높은 성공률이 발생합니다. DNA 주형 설계 및Mg2+ 이온 농도의 최적화를 위한 통상적인 고려사항은 대부분의 경우 만족스러운 수율(26)을 얻기에 충분하다. 발현 모드에 따라, MP 품질의 최적화는 더 다양한 파라미터가 스크리닝될 필요가 있기 때문에(14,17,22) 시간이 많이 소요될 수 있다.
설명된 CF 발현 플랫폼을 확립하려면 대장균 CF 용해물(i), T7 RNA 중합효소(ii), 나노디스크(iii) 및 염기성 CECF 반응 화합물(iv)의 생산에 프로토콜이 필요합니다(그림 1). E. coli K12 균주 A1927 또는 BL21 유도체는 효율적인 S30(30,000 x g에서 원심분리) 용해물의 제조에 자주 사용됩니다. S30 용해물 외에, 다른 g-force(예: S12)에서 원심분리된 상응하는 용해물이 사용될 수 있다. 용해물은 발현 효율과 프로테옴 복잡성이 다릅니다. 기재된 프로토콜에 의해 제조된 S30 용해물의 프로테옴은도 28에서 상세히 연구되었다. S30 프로테옴에는 여전히 이온 채널의 발현 및 분석시 배경 문제를 일으킬 수있는 일부 잔류 외막 단백질이 포함되어 있습니다. 이러한 표적의 경우 S80-S100 용해물을 사용하는 것이 좋습니다. 용해물 준비 중 유용한 변형은 세포의 중간 로그 성장 단계에서 열 충격과 에탄올 공급을 결합하여 SOS 반응을 유도하는 것입니다. 생성된 HS30 용해물은 샤페론이 풍부하고, 개선된 MP 폴딩(22)을 위해 S30 용해물과의 블렌드에 사용될 수 있다. 대장균 용해물에서의 CF 발현은 T7 RNA 중합효소(T7RNAP)에 의해 제어되는 프로모터를 포함하는 DNA 주형과의 결합된 전사/번역 과정으로 작동됩니다. 효소는 pAR1219 플라스미드29를 운반하는 BL21(DE3) 스타 세포에서 효율적으로 생산될 수 있습니다.
MSP1E3D1의 두 사본은 직경이 10-12 nm 인 하나의 나노 디스크로 조립되지만 아래에 설명 된 프로토콜은 다른 MSP 유도체에도 작동 할 수 있습니다. 그러나, MSP1E3D1로 형성된 것보다 큰 나노디스크는 덜 안정한 경향이 있는 반면, MSP1과 같은 MSP 유도체로 형성된 더 작은 나노디스크는 더 큰 MPs 또는 MP 복합체를 수용하지 못할 수 있다. MSP1E3D1 나노디스크는 매우 다양한 지질 또는 지질 혼합물로 시험관내에서 조립할 수 있습니다. 예비 성형 된 나노 디스크는 일반적으로 -80 ° C에서 > 1 년 동안 안정하지만 안정성은 지질 성분에 따라 다를 수 있습니다. MP의 접힘 및 안정성에 대한 지질 효과를 스크리닝하려면 대표적인 다양한 지질/지질 혼합물로 조립된 포괄적인 나노디스크 세트를 준비해야 합니다. 다음의 지질은 좋은 출발 선택을 제공할 수 있다: 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-락-글리세롤) (DMPG), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DMPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-락-(1-글리세롤) (DOPG), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-glycerol) (POPG) 및 1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린 (POPC).
3mL CECF 반응의 제조를 위한 프로토콜이 기재되어 있다. 1:1 비율로 추가 확장 또는 축소가 가능합니다. 2구획 CECF 구성의 경우 모든 화합물을 포함하는 RM과 저분자량 화합물만 포함하는 FM을 준비해야 합니다. 10-14kDa MWCO의 상업용 3mL 투석 장치를 RM 용기로 사용할 수 있으며, 이를 FM을 고정하는 맞춤형 플렉시 유리 용기에 넣을 수 있습니다(그림 1D)30. RM:FM의 비율은 1:20이므로 3mL RM에 대해 60mL의 FM을 준비해야 합니다. 여러 성분의 품질, 농도 또는 유형은 합성된 MP의 최종 수율 및/또는 품질에 중요할 수 있습니다(표 1). DNA 주형은 공개된 가이드라인에 따라 제조되어야 하며, 표적의 판독 프레임의 코돈 최적화는 생성물 수율을 더욱 크게 향상시킬 수 있다(26). 분취 규모 CECF 반응의 경우, PR 생산을 위한 확립된 프로토콜이 기재되어 있다. 새로운 MP에 대한 발현 프로토콜을 확립하려면 일반적으로 수율과 품질을 개선하기 위해 특정 화합물(표 1)의 최적화 스크린을 수행해야 합니다. Mg2+ 이온의 경우, 상이한 DNA 주형에 대해 유의한 변화를 자주 보여주는 잘 집중된 최적 농도가 존재한다. T7RNAP 또는 S30 용해물의 새로운 배치와 같은 다른 CF 반응 화합물은 최적의Mg2+ 농도를 추가로 이동시킬 수 있습니다. 예로서, 14-24 mM 농도의 범위 내에서 및 2 mM의 단계에서의 전형적인Mg2+ 화가 설명된다. 각 농도는 중복 및 분석 규모 CECF 반응으로 스크리닝됩니다. CECF 반응 용기로서, RM을 보유하는 맞춤형 Mini-CECF 플렉시글라스 용기(30 )가 FM을 보유하는 표준 24웰 마이크로플레이트와 조합하여 사용된다(도 1B). 대안적으로, 96-딥 웰 마이크로플레이트 또는 적절한 셋업의 다른 상용 투석기 장치와 조합된 상업용 투석 카트리지가 사용될 수 있다(도 1C).

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (sodium salt) (DMPG)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>840445P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850345C</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sodium salt) (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids (USA)</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>1,2 디올레올오일-sn-글리세로-3-포스포-RAC-(1-글리세롤) (나트륨염) (DOPG)</td><td>아반티 폴라 지질(미국)</td><td>840475C</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린(POPC)</td><td>아반티 극성 지질(미국)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-라크-글리세롤) (나트륨 염) (POPG)</td><td>아반티 폴라 지질(미국)</td><td>840034C</td><td></td></tr><tr><td>2-아미노-2-(하이드록시메틸)- 프로판-1,3-디올(트리스)</td><td>칼 로스(독일)</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>칼 로스(독일)</td><td>4227</td><td></td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>칼 로스(독일)</td><td>9781</td><td></td></tr><tr><td>[3H]-디하이드로알프레놀롤 하이드로클로라이드</td><td>American Radiolabeled Chemicals(미국)</td><td>ART0134</td><td></td></tr><tr><td>아세틸 포스페이트 리튬 칼륨 염(ACP)</td><td>머크( 독일)</td><td>1409</td><td></td></tr><tr><td>아데노신 5'-트리포스페이트(ATP)</td><td>시그마 알드리치(독일)</td><td>A9251</td><td></td></tr><tr><td>알프레놀롤 하이드로클로라이드</td><td>머크(독일)</td><td>A0360000</td><td></td></tr><tr><td>음이온 교환 크로마토그래피 컬럼 재질: Q-sepharose&reg;</td><td>Sigma-Aldrich (독일)</td><td>Q1126</td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브 유형 GE 446EC-1</td><td>Gettinge (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>생물 반응기 유형 884 124/1</td><td>B.Braun (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Sorvall RC12BP +; Thermo Scientific (독일); 소르발 RC-5C; Thermo Scientific (독일); 미크로 22 R; Hettich (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cholic acid</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>8137</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>3862</td><td></td></tr><tr><td>배양 플라스크 500ml 배플 플라스크, 2L 배플 플라스크</td><td>Schott Duran (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytidine 5'-triphosphate disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich (독일)</td><td>C1506</td><td></td></tr><tr><td>D-포도당 일수화물</td><td>Carl Roth(독일)</td><td>6780</td><td></td></tr><tr><td>인산수소칼륨 삼수화물</td><td>Carl Roth(독일)</td><td>6878</td><td></td></tr><tr><td>투석 튜빙 SpectrumTM Labs Spectra/PorTM 12-14kD MWCO 표준 RC 튜빙</td><td>Fisher Scientific(독일)</td><td>8700152</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreit</td><td>Carl Roth(독일)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Carl Roth (독일)</td> <td>K928</td><td></td></tr><tr><td>Folinic acid 칼슘 염 수화물</td><td>Sigma-Aldrich (독일)</td> <td>47612</td><td></td></tr><tr><td>프랑스 압력 세포 교란 장치</td><td>SLM; Amico Instruments (미국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>3783</td><td></td></tr><tr><td>구아노신 5'-트리포스페이트 디소듐 염 (GTP)</td><td>Sigma-Aldrich (독일)</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>K025</td><td></td></tr><tr><td>IMAC 컬럼: HiTrap IMAC HP 5 mL</td><td>GE Life Sciences (독일)</td><td>GE17-5248</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>3899</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필-&베타;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>2316</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>T832</td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>3076.1</td><td></td></tr><tr><td>L-아르기닌</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>6908</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파라긴</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>HN23</td><td></td></tr><tr><td>L-아스파르트산</td><td>칼 로스(독일)</td><td>T202</td><td></td></tr><tr><td>L-시스테인</td><td>칼 로스(독일)</td><td>T203</td><td></td></tr><tr><td>L-글루탐산</td><td>칼 로스(독일)</td><td>3774</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>칼 로스(독일)</td><td>3772</td><td></td></tr><tr><td>L-글리신</td><td>칼 로스(독일)</td><td>3187</td><td></td></tr><tr><td>L-히스티딘</td><td>칼 Roth (독일)</td><td>3852</td><td></td></tr><tr><td>L-이소류신</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>3922</td><td></td></tr><tr><td>L-류신</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>1699</td><td></td></tr><tr><td>L-라이신</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>4207</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>9359</td><td></td></tr><tr><td>L-프롤린</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>1713</td><td></td></tr><tr><td>L-페닐알라닌</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>1709</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>4682</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>1738</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>7700</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>T207</td><td></td></tr><tr><td>MD100 투석 유닛</td><td>Scienova (독일)</td><td>40077</td><td></td></tr><tr><td>N-2-Hydroxyethylpiperazine-><N'-2-ethansulfonic acid (HEPES)</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecylphosphocholine</td><td>Antrace (미국)</td><td>F308S</td><td></td></tr><tr><td>PAGE 챔버 : Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Biorad (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE 젤 캐스팅 시스템 : Mini Protean Handcast systems</td><td>Biorad (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAGE 젤 전원 공급 장치: Power Pac 3000</td><td>Biorad(독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>카제인</td><td>Carl Roth(독일)</td><td>6681</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프: ip-12</td><td>Ismatec(독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>포스포에놀 피루브산 모노칼륨</td>염 <td>Sigma Aldrich(독일)</td><td>860077</td><td></td></tr><tr><td>인산이수소칼</td>륨(<td>독일)</td><td>P018</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 칼</td>륨 <td>Carl Roth (독일)</td><td>4986</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Carl Roth (독일)</td><td>6781</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate Kinase</td><td>Roche (독일)</td><td>10109045001</td><td></td></tr><tr><td>섬광 계수기: Hidex 300 SL</td><td>Hidex (핀란드)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS 펠릿</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>8029</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich (독일)</td><td>K305</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Carl Roth (독일)</td><td>P029</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 Nanodrop</td><td>Peqlab (독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계/형광 리더 Spark&reg;</td><td>테칸 (스위스)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>tRNA (E. coli)</td> <td>Roche (독일)</td> <td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>울트라 sonificator</td><td>Labsonic U, B. Braun (독일)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>우리딘 5'- 트리포스페이트 삼 나트륨 염 (UTP)</td><td>시그마 - 알드리치 (독일)</td> <td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>Y-30 소포제</td><td>시그마 - 알드리치 (독일)</td> <td>A6457</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>칼 로스 (독일)</td><td>2904</td><td></td></tr></tbody></table>

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

Co-Translational Insertion of Membrane Proteins into Preformed Nanodiscs

무세포 발현 시스템을 사용하면 반응 환경을 맞춤 설계하여 막 단백질과 같은 복잡한 단백질의 기능적 접힘도 지원할 수 있습니다. 막 단백질을 나노 디스크로 공급되는 미리 형성되고 정의된 막으로 공동 번역 삽입 및 접는 실험 절차가 시연됩니다. 이 프로토콜은 세제가 전혀 없으며 하루 이내에 밀리그램의 정제된 샘플을 생성할 수 있습니다. 생성된 멤브레인 단백질/나노디스크 샘플은 결정화, 핵자기 공명 또는 전자 현미경과 같은 다양한 기능 연구 및 구조 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 무세포 용해물, 설계된 멤브레인이 있는 나노디스크, 중요 스톡 용액 및 2구획 무세포 발현 반응의 조립과 같은 기본 핵심 구성 요소의 준비에 대해 설명합니다. 막 단백질의 접힘 요구 사항은 매우 다양할 수 있으므로 이 프로토콜의 주요 초점은 중요한 염기성 반응 화합물, 나노디스크의 막 조성, 산화 환원 및 샤페론 환경 또는 DNA 주형 설계와 같은 샘플 품질에 중요한 파라미터 및 반응 단계의 조절입니다. 전체 과정은 프로테오르호돕신과 G-단백질 결합 수용체의 합성으로 입증됩니다.

미세 조정 반응 화합물이 합성된 MP의 최종 수율 또는 품질에 미치는 영향이 예시됩니다. 빈번한 일상적인 접근법은 시스템 효율의 편리한 모니터로서 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현에 의해 CF 반응에서 최적의 Mg2+ 농도를 조정하는 것입니다. 예를 들어, GFP는 14와 24 mM 사이의 Mg 2+ 농도에서pET-21a(+) 벡터로부터 합성되었습니다(그림 2). SDS-PAGE 분석은 20 mM에서 최적의Mg2+ 농도를 확인하였고 (도 2A), 이는 CF 반응 상청액의 상보적 형광 측정(485 nm에서의 여기, 535 nm에서의 방출 측정)에 양호하게 일치한다(도 2B). pIVEX 2.3 벡터로부터 발현된 박테리아 PR의 CF 발현 및 pET-21a(+) 벡터로부터 발현된 칠면조 β1 아...

사전 형성된 나노디스크에 공동 번역하여 삽입하면 세제와의 접촉 없이 정의된 지질 환경에서 무세포 합성된 막 단백질을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필수 시스템 구성 요소의 준비와 발현 효율성 및 샘플 품질을 개선하기 위한 중요한 파라미터를 설명합니다.

Cell-free expression systems allow the tailored design of reaction environments to support the functional folding of even complex proteins such as ...

이 프로토콜은 매우 효율적이고 다재다능합니다. 거의 모든 막 단백질에 적용할 수 있으며 전체 생산 절차가 하루 이내에 완료됩니다. 합성된 막 단백질은 공급된 리간드에 의해 이미 동시 번역으로 안정화될 수 있습니다.세제 접촉은 완전히 피하며, 단백질은 제공되고 맞춤화된 멤브레인 환경에서 직접 삽입 및 접힙니다. 구조적 접근, 기능적 특성화 및 항체 생성은 주요 응용 분야입니다. 또한 이 기술은 막 단백질 접힘 및 기능에 대한 지질 영향을 분석하는 데 간단합니다.배양 3일차에 10리터의 멸균 섭씨 37도 YPTG 배지를 15리터 교반 탱크 반응기에 100ml의 사전 배양 물을 접종합니다. 그리고 높은 통기에 있는 분 당 500 회전을 가진 37 섭씨 온도에 박테리아를 배양하십시오. 과도한 거품을 방지하려면 멸균 소포제를 추가하십시오.세포가 mid-log 단계에 도달하면 배양액에 300ml의 에탄올을 추가하고 섭씨 42도에서 45분 동안 높은 폭기에서 분당 500회 회전하면서 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수확하고 주걱과 피펫을 사용하여 300ml의 S30A 완충액에 세포를 완전히 재현탁합니다. 재현탁한 박테리아를 두 번 원심분리하고 세척당 300ml의 신선한 S30A로 펠릿을 세척합니다.두 번째 세척 후 1.1 부피의 S30B 완충액에 세포를 재현탁합니다. 미리 냉각된 프렌치 프레스 압력 셀로 현탁액을 로드하고 1, 평방 인치 게이지 당 000파운드로 셀을 한 번 방해합니다. 불안정한 성분을 제거하고 리보솜에서 mRNA를 방출하려면 용해물을 0.4몰 염화나트륨으로 조정하고 섭씨 42도의 수조에서 45분 동안 샘플을 배양합니다.멤브레인 스캐폴드 단백질 나노 디스크를 조립하려면 MSP1E3D1 용액과 지질 용액을 혼합하고 DPC를 최종 농도 0.1%로 첨가하고 표에 따라 반응을 적절한 최종 부피로 조정하고 부드러운 교반 하에서 섭씨 21도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 배양이 끝나면 투석 카세트의 멤브레인을 디스크 형성 완충액으로 미리 적시고 주사기를 사용하여 어셈블리 혼합물을 카세트에 로드합니다. 다음으로, 10 킬로달톤 분자량 컷오프로 디스크 형성 완충액 평형 원심 필터 장치로 혼합물을 옮기기 전에 교반하면서 실온에서 10-20시간 동안 3개의 5리터 용량의 디스크 형성 완충액에 대한 반응을 투석합니다.그런 다음 UV-Vis 리더를 사용하여 원심분리하여 반응을 최소 300마이크로몰로 농축하여 농도를 측정합니다. 3밀리리터 연속 교환 무세포 반응을 준비하려면 3밀리리터 투석 카세트의 멤브레인을 100밀리몰 트리스-아세테이트로 평형을 이룹니다. 그리고 주사기를 사용하여 반응 혼합물을 카세트로 옮깁니다.주사기를 사용하여 반응 혼합물 구획에서 과도한 공기를 제거하고 카세트를 투석실에 넣습니다. 챔버에 60ml의 공급 혼합물을 채우고 챔버에 뚜껑을 놓습니다. 뚜껑을 제자리에 고정한 후 섭씨 30도에서 분당 200회 회전으로 12-16시간 동안 챔버를 배양합니다.마그네슘 이온 스크리닝을 위한 60마이크로리터 세포 교환 무세포 반응 설정을 준비하려면 새로 준비된 3X Master Mix 60마이크로리터를 반응 혼합물에 추가하고 825마이크로리터를 공급 혼합물에 추가합니다. 그리고 먹이 혼합물에 물을 채웁니다. 볼텍싱 후 825마이크로리터의 공급 혼합물을 24웰 마이크로플레이트의 3개 웰 각각에 추가합니다.분자량이 10-14 킬로달톤인 재생 셀룰로오스 투석관을 약 25 x 20mm 크기의 조각으로 자르고 0.05%의 아지드화나트륨이 보충된 물에 보관합니다. mini-cell exchange cell-free 용기 조립하기 전에 티슈를 사용하여 투석막에서 과도한 수분을 제거하고 각 용기에 멤브레인 조각을 하나씩 놓습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 링으로 멤브레인을 고정하고 미니 용기를 공급 혼합물의 한 웰로 옮깁니다.표에 표시된 대로 반응 혼합물에 고분자 성분을 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 60마이크로리터의 반응 혼합물을 반응 용기에 넣고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그리고 24웰 플레이트에 8x10cm 크기의 밀봉 열가소성 필름 시트 2장을 감습니다.웰 플레이트의 뚜껑을 테이프로 제자리에 고정하고 플레이트를 섭씨 30도에서 12-16시간 동안 교반하면서 분당 200회 회전하여 플레이트를 놓습니다. 다음 날 아침, 피펫 팁을 사용하여 mini-cell exchange cell-free 용기의 투석막을 뚫고 반응 혼합물을 흡인합니다. 반응 혼합물을 새 원심분리기 튜브와 원심분리기로 옮겨 침전물을 제거합니다.그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 여기에서는 합성된 막 단백질의 최종 수율 또는 품질에 대한 미세 조정 반응 화합물의 대표적인 영향을 보여줍니다. 이 분석에서 T-beta-one 아드레날린 수용체의 전반적인 합성 및 나노 디스크 가용화는 분석된 모든 멤브레인 조성에서 유사했습니다.대조적으로, 합성된 G 단백질 결합 수용체의 품질에서 훨씬 더 높은 변동이 감지되었으며, DMPC 및 POPC 지질에서 얻은 활성이 가장 낮았고 DOPG 및 POPG가 적용되었을 때 가장 높은 활성이 관찰되었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 지방산 사슬의 유연성뿐만 아니라 지질 헤드 그룹의 전하가 이 세포막 단백질의 접힘과 활성에 대한 중요한 조절제임을 나타냅니다. 최종 나노디스크 농도는 또한 멤브레인 단백질 품질에 중요한 요소가 될 수 있습니다.예를 들어, 나노디스크 농도가 3.75 내지 60 마이크로몰 범위 내에서 스크리닝되는 경우, 약 30마이크로몰 나노디스크에서 G 단백질 결합 수용체의 완전한 용해를 얻어 1:3 멤브레인 단백질 대 나노디스크 비율을 제공합니다. 대조적으로, 프로테오로돕신의 완전한 가용화는 약 10마이크로몰 나노디스크로 달성할 수 있으며, 이는 10:1 프로테오호돕신 대 나노디스크 비율을 제공합니다. 정확한 피펫팅과 고품질 구성품은 확실히 필수입니다.용해물 준비를 위한 중요한 단계는 중간 로그 단계에서 세포를 수확하고 고염 단계를 적용하는 것입니다. 이 기술은 멤브레인 단백질 합성의 복잡성을 크게 줄입니다. 이전에는 까다로웠던 표적이 효율적으로 합성되어 지금까지 약학적으로 관련된 단백질의 분자 구조에 대해 작업할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

Nanodiscs는 인지질 이중층의 작은 패치로 막 단백질을 포함 작은 원반 모양의 입자입니다. 우리는 디스크에 MalFGK2 수송의 단계별 설립을 보여줍니다 시각적 프로토콜을 제공합니다.

Nanodisc 지질 입자로 ABC의 전송의 Reconstitution을위한 단계별 방법

출처: Gilmore, SF, et al. 백신 개발을 위한 Chlamydia muridarum 의 재조합 주요 외막 단백질에 대한 무세포 규모 생산 및 보조제 추가. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 이중 구획 시스템을 사용하여 나노디스크 안정화 막 단백질 항원의 무세포 합성을 보여줍니다. 이 장치는 효율적인 단백질 합성, 적절한 접힘 및 나노디스크로의 안정적인 통합을 위한 최적의 조건을 유지합니다.

무세포 시스템을 이용한 나노디스크 안정화 막 단백질 항원 합성

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

여기에 우리가 설명 단일 분자 사진 활성화 지역화 현미경 라이브 초파리 melanogaster 의 모터 신경 맨끝에 실시 될 수 있습니다 하는 방법 3 유 충 탈피.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

여기에 제시된 전자 현미경 검사법과 함께 네이티브 세포막 나노입자 시스템을 활용하는 멤브레인 단백질의 올리고메황 상태의 측정을 위한 프로토콜이 여기에 제시된다.

멤브레인 단백질-단백질 상호 작용 분석을 위한 기본 세포막 나노입자 시스템

여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화

여기에서는 인공 지질막에서 높은 시공간 정밀도로 광 조절 및 가역성 단백질 패턴을 생성하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 방법은 청색광 아래에서 파트너 단백질 Nano(야생형 SspB)에 결합하는 모델 멤브레인에 고정된 단백질 iLID(Improved Light-Inducible Dimer)의 국부적인 광활성화로 구성됩니다.

모델 멤브레인에서의 Dynamic light-induced protein pattern

이 글은 고체 지지 지질 이중층에서 단일 단백질 추적용 샘플을 만드는 방법에 대해 상세히 설명합니다. 또한 단일 분자 감도와 빠른 프레임 속도를 가진 단순한 형광 현미경을 설명해 줍니다. 마지막으로, 단일 단백질 궤적을 추출하는 절차를 개괄합니다.

형광현미경을 이용한 지질 이중층 내 단일 단백질 추적

본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.

나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성 체외

배우세요 막 단백질을 나노디스크에 공동 번역 삽입하는 방법을. 세제 없이 효율적이고 안정적인 막 단백질 합성이 가능하며, 구조 연구와 기능 분석에 활용됩니다.

막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

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