막 단백질을 미리 형성된 나노디스크에 공동 번역 삽입

이 프로토콜은 매우 효율적이고 다재다능합니다. 거의 모든 막 단백질에 적용할 수 있으며 전체 생산 절차가 하루 이내에 완료됩니다. 합성된 막 단백질은 공급된 리간드에 의해 이미 동시 번역으로 안정화될 수 있습니다.

세제 접촉은 완전히 피하며, 단백질은 제공되고 맞춤화된 멤브레인 환경에서 직접 삽입 및 접힙니다. 구조적 접근, 기능적 특성화 및 항체 생성은 주요 응용 분야입니다. 또한 이 기술은 막 단백질 접힘 및 기능에 대한 지질 영향을 분석하는 데 간단합니다.

배양 3일차에 10리터의 멸균 섭씨 37도 YPTG 배지를 15리터 교반 탱크 반응기에 100ml의 사전 배양 물을 접종합니다. 그리고 높은 통기에 있는 분 당 500 회전을 가진 37 섭씨 온도에 박테리아를 배양하십시오. 과도한 거품을 방지하려면 멸균 소포제를 추가하십시오.

세포가 mid-log 단계에 도달하면 배양액에 300ml의 에탄올을 추가하고 섭씨 42도에서 45분 동안 높은 폭기에서 분당 500회 회전하면서 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 원심분리로 세포를 수확하고 주걱과 피펫을 사용하여 300ml의 S30A 완충액에 세포를 완전히 재현탁합니다. 재현탁한 박테리아를 두 번 원심분리하고 세척당 300ml의 신선한 S30A로 펠릿을 세척합니다.

두 번째 세척 후 1.1 부피의 S30B 완충액에 세포를 재현탁합니다. 미리 냉각된 프렌치 프레스 압력 셀로 현탁액을 로드하고 1, 평방 인치 게이지 당 000파운드로 셀을 한 번 방해합니다. 불안정한 성분을 제거하고 리보솜에서 mRNA를 방출하려면 용해물을 0.4몰 염화나트륨으로 조정하고 섭씨 42도의 수조에서 45분 동안 샘플을 배양합니다.

멤브레인 스캐폴드 단백질 나노 디스크를 조립하려면 MSP1E3D1 용액과 지질 용액을 혼합하고 DPC를 최종 농도 0.1%로 첨가하고 표에 따라 반응을 적절한 최종 부피로 조정하고 부드러운 교반 하에서 섭씨 21도에서 1시간 동안 반응을 배양합니다. 배양이 끝나면 투석 카세트의 멤브레인을 디스크 형성 완충액으로 미리 적시고 주사기를 사용하여 어셈블리 혼합물을 카세트에 로드합니다. 다음으로, 10 킬로달톤 분자량 컷오프로 디스크 형성 완충액 평형 원심 필터 장치로 혼합물을 옮기기 전에 교반하면서 실온에서 10-20시간 동안 3개의 5리터 용량의 디스크 형성 완충액에 대한 반응을 투석합니다.

그런 다음 UV-Vis 리더를 사용하여 원심분리하여 반응을 최소 300마이크로몰로 농축하여 농도를 측정합니다. 3밀리리터 연속 교환 무세포 반응을 준비하려면 3밀리리터 투석 카세트의 멤브레인을 100밀리몰 트리스-아세테이트로 평형을 이룹니다. 그리고 주사기를 사용하여 반응 혼합물을 카세트로 옮깁니다.

주사기를 사용하여 반응 혼합물 구획에서 과도한 공기를 제거하고 카세트를 투석실에 넣습니다. 챔버에 60ml의 공급 혼합물을 채우고 챔버에 뚜껑을 놓습니다. 뚜껑을 제자리에 고정한 후 섭씨 30도에서 분당 200회 회전으로 12-16시간 동안 챔버를 배양합니다.

마그네슘 이온 스크리닝을 위한 60마이크로리터 세포 교환 무세포 반응 설정을 준비하려면 새로 준비된 3X Master Mix 60마이크로리터를 반응 혼합물에 추가하고 825마이크로리터를 공급 혼합물에 추가합니다. 그리고 먹이 혼합물에 물을 채웁니다. 볼텍싱 후 825마이크로리터의 공급 혼합물을 24웰 마이크로플레이트의 3개 웰 각각에 추가합니다.

분자량이 10-14 킬로달톤인 재생 셀룰로오스 투석관을 약 25 x 20mm 크기의 조각으로 자르고 0.05%의 아지드화나트륨이 보충된 물에 보관합니다. mini-cell exchange cell-free 용기 조립하기 전에 티슈를 사용하여 투석막에서 과도한 수분을 제거하고 각 용기에 멤브레인 조각을 하나씩 놓습니다. 폴리테트라플루오로에틸렌 링으로 멤브레인을 고정하고 미니 용기를 공급 혼합물의 한 웰로 옮깁니다.

표에 표시된 대로 반응 혼합물에 고분자 성분을 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다. 60마이크로리터의 반응 혼합물을 반응 용기에 넣고 기포가 생기지 않도록 주의합니다. 그리고 24웰 플레이트에 8x10cm 크기의 밀봉 열가소성 필름 시트 2장을 감습니다.

웰 플레이트의 뚜껑을 테이프로 제자리에 고정하고 플레이트를 섭씨 30도에서 12-16시간 동안 교반하면서 분당 200회 회전하여 플레이트를 놓습니다. 다음 날 아침, 피펫 팁을 사용하여 mini-cell exchange cell-free 용기의 투석막을 뚫고 반응 혼합물을 흡인합니다. 반응 혼합물을 새 원심분리기 튜브와 원심분리기로 옮겨 침전물을 제거합니다.

그런 다음 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 여기에서는 합성된 막 단백질의 최종 수율 또는 품질에 대한 미세 조정 반응 화합물의 대표적인 영향을 보여줍니다. 이 분석에서 T-beta-one 아드레날린 수용체의 전반적인 합성 및 나노 디스크 가용화는 분석된 모든 멤브레인 조성에서 유사했습니다.

대조적으로, 합성된 G 단백질 결합 수용체의 품질에서 훨씬 더 높은 변동이 감지되었으며, DMPC 및 POPC 지질에서 얻은 활성이 가장 낮았고 DOPG 및 POPG가 적용되었을 때 가장 높은 활성이 관찰되었습니다. 종합하면, 이러한 결과는 지방산 사슬의 유연성뿐만 아니라 지질 헤드 그룹의 전하가 이 세포막 단백질의 접힘과 활성에 대한 중요한 조절제임을 나타냅니다. 최종 나노디스크 농도는 또한 멤브레인 단백질 품질에 중요한 요소가 될 수 있습니다.

예를 들어, 나노디스크 농도가 3.75 내지 60 마이크로몰 범위 내에서 스크리닝되는 경우, 약 30마이크로몰 나노디스크에서 G 단백질 결합 수용체의 완전한 용해를 얻어 1:3 멤브레인 단백질 대 나노디스크 비율을 제공합니다. 대조적으로, 프로테오로돕신의 완전한 가용화는 약 10마이크로몰 나노디스크로 달성할 수 있으며, 이는 10:1 프로테오호돕신 대 나노디스크 비율을 제공합니다. 정확한 피펫팅과 고품질 구성품은 확실히 필수입니다.

용해물 준비를 위한 중요한 단계는 중간 로그 단계에서 세포를 수확하고 고염 단계를 적용하는 것입니다. 이 기술은 멤브레인 단백질 합성의 복잡성을 크게 줄입니다. 이전에는 까다로웠던 표적이 효율적으로 합성되어 지금까지 약학적으로 관련된 단백질의 분자 구조에 대해 작업할 수 있습니다.