Name: 뮤린 심폐 복합체의 탈세포화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 배우세요 뮤린 심폐 복합체의 탈세포화 방법으로 세포외기질(ECM) 스캐폴드를 제조하는 기술입니다. 이 프로토콜은 구조적 무결성을 유지한 채 생화학 및 해부학적 분석이 가능하게 하며, 재생의학 연구에 활용됩니다.

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우리는 현미경 접근을 제공하기 위한 이바나 노박 교수와 Nynne Meyn Christensen 박사(코펜하겐 대학)에게 감사드립니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 (ERC-2015-CoG-682881-MATRICAN)에 의해 지원되었다; AEM-G, OW, RR 및 JTE); 룬드벡 재단(R286-2018-621) 박사 과정 펠로우십; MR; 스웨덴 연구 위원회 (2017-03389; CDM); 스웨덴 암 학회, 암폰덴 (CAN 2016/783, 19 0632 Pj, 및 190007; CDM); 독일 암 원조 (도이치 크렙실페; RR); 덴마크 암 학회 (R204-A12454; RR).

여기에 포함 된 모든 절차는 코펜하겐 대학의 실험 의학을 규제하는 윤리위원회에 의해 검토되고 승인되었으며 덴마크 및 유럽 법률에 동의합니다. 이 프로토콜을 보여주기 위해, 우리는 나이의 8-12 주의 암컷 BALB/cJ 마우스및 11주의 MMTV-PyMT 여성 마우스를 사용했습니다.
참고: 탈세포화된 ECM 스캐폴드의 세균 오염을 피하면 최고의 이미징 결과를 제공하고 장기적인 샘플 저장이 가능합니다. 따라서 모든 단계를 멸균하는 것이 중요합니다. 따라서 봉합사, 마이크로 봉합사, 용액, 튜브, 루어 커넥터 및 카테터를 포함한 모든 기기 및 수술 재료는 멸균되어야합니다. 폴리스티렌 트레이를 포함한 표면은 70% 에탄올로 소독되어야 하며, 관류는 바람직하게는 라미나르 플로우 후드 하에서 수행되어야 한다. 달리 명시되지 않는 한 모든 절차는 실온에서 진행됩니다.
1. 사후 미세 수술
<ol><li>CO2 챔버를 사용하여 마우스를 안락사시합니다.<ol>
<li>마우스를 4L 챔버에 넣고 0.2 L/min부터 2분 동안 100% CO2로 채우기 시작하여 3분 후 0.8 L/min의 흐름에 도달할 때까지 증가합니다. 마우스는 처음 2 분 동안 의식이 떨어지면 호흡이 중단되어야합니다 (일반적으로 약 5 분, 그러나 흐름은 필요에 따라 유지 될 수 있습니다). 다음 단계로 진행하기 전에 사망을 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>흉부, 복부 및 마우스 뒷면을 모발 클리퍼로 면도하고 70 %의 에탄올로 소독하십시오. 면도는 이미징 또는 생화학 적 분석을위한 샘플에 머리카락이 존재하기 때문에 유물의 수를 크게 줄입니다.</li>
	<li>마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하여 앞다리와 뒷다리뿐만 아니라 머리와 꼬리를 확장합니다. 미세 수술 현미경 아래에 놓습니다.</li>
	<li>마요 직선 패턴 가위를 사용하여 하복부 부위에서 하복부로 흐르는 큐탄 절개를 사용하여 외과적 접근을 설정하고 흉부 벽과 복막을 노출하기 위해 피하부 피하한다.</li>
	<li>미세 수술 가위를 사용하여 흉부 벽의 양쪽에 있는 여섯 번째 늑간 공간을 따라 가슴 흉부 전공 및 가슴 경 경미한 근육을 잘라.</li>
	<li>직선 패턴 가위를 사용하여 이전 절개를 따라 흉골을 자른 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단한 다음 흉부 벽의 양쪽을 상승시키고 고정하여 심폐 복합체를 노출시킵니다.</li>
	<li>둥근 팁 마이크로 포셉 (또는 Dumont 마이크로 집게)을 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 섬세하게 분리하여 부착물을 제거합니다. 이것은 주요 선박을 공개합니다.</li>
	<li>소생을 사용하여 내림차리 정맥을 소작하고 직선 패턴 가위를 사용하여 식도를 자른다.</li>
	<li>날카로운 마이크로 포셉을 사용하여, brachiocephalic 정맥과 brachiocephalic을 분리, 일반적인 경동맥을 왼쪽 및 결찰 및 소작을 용이하게하기 위해 기본 조직에서 subclavian 동맥을 왼쪽.</li>
	<li>마이크로 바늘 홀더를 사용하여, 날카로운 마이크로 집약과 9-0 봉합사 장소 바늘은 brachiocephalic의 출현 위에 바늘, 일반적인 경동맥을 왼쪽 및 왼쪽 subclavian 동맥.</li>
	<li>brachiocephalic 정맥을 소생.</li>
	<li>중간선을 따라 침샘을 분리하여 목 근육과 기관지를 노출시합니다. 근육을 분리하여 갑상선 인대를 노출시하십시오. 마이크로 가위를 사용하여 인대를 단면으로 입구를 엽니다.</li>
	<li>기관지에 27 G 카테터를 소개하고 기관지나뭇가지가 기관지(예: 카테터에 대한 저항이 충족될 때까지 3mm 후퇴)까지 섬세하게 밀어 넣습니다. 기관지 의 방해하지 않도록주의하십시오. 6-0 봉합사를 사용하여, 카테터를 확보하기 위해 기관 주위에 3 바늘을 놓습니다.</li>
	<li>12 흉부 척추의 높이에서 마우스를 절제합니다. 내림차순 대동맥은 척추에 앞쪽으로 실행되며 척추와 함께 여기에 단면해야합니다. 하반부 반쪽을 따로 설정합니다.</li>
	<li>대동맥을 역행하여 대동맥에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 9-0 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5mm부터 대오르타 주변에 4 개의 바늘을 놓습니다.</li>
</ol>2. 세포 탈세포화
<ol><li>실리콘 튜빙과 루어 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 15 분 동안 200 μL / 분에서 탈이온 된 물로 퍼퓨즈하십시오. 탈세포화 중에 이 유량을 유지합니다.</li>
	<li>관류제를 탈옥수산나트륨(DOC)을 0.5%로 변경하고 밤새 퍼퓨즈한다.</li>
	<li>관류제를 분류제를 탈화된 물에 희석한 도데딜 황산염(SDS) 나트륨0.1%로 변경하고 8시간 동안 퍼퓨즈한다.</li>
	<li>24 시간 동안 SDS와 DOC를 씻어 밤새 다이온 된 물로 퍼퓨즈하십시오.</li>
	<li>변세포화된 심장과 폐는 곡선 가위를 사용하여 흉부에 부착물을 분리하고 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신과 0.3μM 나트륨 아지드를 4°C에서 12주 동안 보관할 수 있다. 스캐폴드가 생화학적 분석(예를 들어 질량 분석법)에 사용되는 경우 액체 질소에서 동결을 스냅합니다.</li>
</ol>3. 면역 염색
<ol><li>이미징 계획: 1차 항체(또는 항체)와 형광공이이차 항체의 조합을 서로 일치시키고 형광 현미경의 레이저 라인에 맞게 결정한다.</li>
	<li>6% (v/v) 당나귀 세럼을 포함하는 냉동 튜브에 몰입하여 샘플을 차단 - 3 % (w / v) 소 세럼 알부민 (BSA) 하룻밤.</li>
	<li>24 시간 동안 PBS에서 3 % 당나귀 혈청에서 1 차 항체 (또는 항체)로 배양.</li>
	<li>PBS(PBST)에서 0.05% tween 20으로 매번 1시간 동안 5회 세척합니다.</li>
	<li>24시간 PBS에서 3% 당나귀 혈청에서 형광으로 공주된 이차 항체(또는 항체)로 샘플을 배양한다.</li>
	<li>0.05%(PBST)로 1시간 동안 5회 세척합니다. 각 세척 사이에 1h를 기다립니다.</li>
	<li>탈이온된 물을 넣고 직접 조명으로부터 4°C 떨어진 곳에 보관하십시오. 이 시점에서 스캐폴드는 이미지할 준비가 되어 있습니다.</li>
</ol>4. 이미징
<ol><li>샘플을 유리 바닥 접시에 넣고 두 방울의 저장 액수 (PBS 또는 탈온 화 된 물)로 가습하십시오.</li>
	<li>목표를 준비합니다. 물 침지 목표를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>형광광을 사용하여 샘플을 검사합니다.</li>
	<li>컴퓨터 제어로 전환합니다. 레이저를 켜고 레이저 강도, 핀홀 조리개, 검출기 파장, 게인, 해상도 및 줌을 조정합니다. z 스택의 수와 단계 크기를 설정하고 인수를 시작합니다. 조직 침투를 늘리고 빛, 표백 및 조직 손상의 산란을 최소화하기 위해 다광 레이저 여기를 사용하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>5. 헤마톡시린-에신 염색
<ol><li>안락사 마우스에서 1 폐 엽을 소비합니다.</li>
	<li>10mm x 10mm x 5mm 극저온에 놓고 약 500μL의 100μL로 덮습니다.</li>
	<li>드라이 아이스 (-70 °C)에 동결하고 그 온도에서 샘플을 유지합니다.</li>
	<li>2.5 단계에 따라 가공 된 마우스에서 세포 제거 된 폐 엽 1 개를 소비합니다.</li>
	<li>최대 표면적아래로 극저온에 놓고 5.2 단계에서 지정된 대로 OCT 화합물로 덮습니다.</li>
	<li>드라이 아이스(-70°C)를 동결하고 그렇지 않으면 필요할 때까지 샘플을 해당 온도에서 유지합니다. 샘플은 적어도 12 주 동안 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>섹션 동결 조직 블록 -20 °C는 5 μm 두께와 극저온에서 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 배치하고 -80 ° C에 저장합니다.</li>
	<li>공기가 건조 될 때까지 실온으로 슬라이드를 가져 가라 (약 20 분).</li>
	<li>PBS에 잠시 몰입하고 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드에 슬라이드를 몰입하여 수정하십시오. PBS에서 5분 동안 한 번 씻은 다음 증류수로 5분 동안 두 번 씻습니다.</li>
	<li>메이어의 헤마톡시린 솔루션에 10분 동안 몰입하십시오. 이번에는 조직 소스 및 얼룩 준비에 따라 최적화 될 수있다.</li>
	<li>10 분 동안 흐르는 증류수 아래 코플린 항아리에서 씻으라.</li>
	<li>에오신 용액에 7분 동안 담가 두면 됩니다. 이번에는 조직 소스 및 얼룩 준비에 따라 최적화 될 수있다.</li>
	<li>에탄올을 50% 찍어 에탄올70% 에탄올에 잠시 담그고, 96% 및 100% 에탄올에서 30초 동안 여분의 에오신과 탈수증을 제거합니다. 자일렌에 여러 번 찍어.</li>
	<li>DPX 장착 중간 크기의 몇 방울을 바르고 유리 커버슬립을 놓습니다.</li>
	<li>슬라이드를 화학 후드 아래에 밤새 건조시십시오.</li>
	<li>슬라이드 스캐너에서 슬라이드를 스캔합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+not+just+pretty+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: not just pretty fibrils.</a> Science. 326, 1216-1219 (2009).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISDoT%3A+in+situ+decellularization+of+tissues+for+high-resolution+imaging+and+proteomic+analysis+of+native+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ISDoT: in situ decellularization of tissues for high-resolution imaging and proteomic analysis of native extracellular matrix.</a> Nature Medicine. 23, 890-898 (2017).</li>
<li>Mayorca-Guiliani, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+antibody+staining+of+mouse+tissues+to+map+native+extracellular+matrix+structures+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D.</a> Nature Protocols. 14, 3395-3425 (2019).</li>
<li>White, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+detergents+on+the+tissue+decellularization+process%3A+A+TOF-sims+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">The impact of detergents on the tissue decellularization process: A TOF-sims study.</a> Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+re-engineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Organ re-engineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nature Medicine. 16, 814-820 (2010).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10, 1709-1727 (2015).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9, 1682-1697 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nature Protocols. 7, 1983-1995 (2012).</li>
<li>Wershof, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FIJI+Macro+for+quantifying+pattern+in+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">A FIJI Macro for quantifying pattern in extracellular matrix.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

조직 동요에 기초한 탈세포화 기술은 ECM 구조를 변경하여 ECM 구조 분석에 적합하지 않습니다4. 관류 탈세포화는 기관의 대자와 같은 해부학 경로를 사용하여 모세관 침대 또는 말단 폐포에 도달 할 수 있으며 장기 전체에 세포 탈세포화제의 전달을 용이하게합니다. 조직 탈세포화를 위한 zwitterionic, 음이온 및 비이온 세제의 사용은 보고되지만, 도데실 황산염 나트륨(SDS, 음이온성)은 마우스 지방 패드2에서 피브릴라 콜라겐을 선형화하지만 폐에서는 알 수 없습니다. 이것은 세제의 선택이 ECM 구조를 유지하기 위하여 표적 조직에 적응하는, 최적화되어야 한다는 것을 건의합니다. 조직 정리 방법은 ECM 교차 연결을 변경할 수 있는 화학 물질을 필요로 하지만 ECM 분석에 사...

ECM은 다세포 유기체의 모든 세포를 수용하는 단백질과 글리칸으로 만든 3차원 네트워크로, 장기에게 모양과 세포 거동을 평생 동안 조절합니다1. 계란 수정에서, 세포는 ECM을 구축하고 리모델링하고, 차례로 엄격하게 그것에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜의 목적은 마우스가 포유류 병리학학에서 가장 많이 사용되는 모델 유기체이기 때문에 마우스 ECM을 분석하고 매핑하는 방법을 여는 것이다.
이 방법의 개발은 전이 연관된 네이티브 ECM2의 특성화 및 분리의 필요성에 의해 주도되었다. 종양이 적당한 해부학 혈관화가 부족하고 마우스는 상대적으로 작은 유기체이기 때문에, 미세 외과 적 절차는 종양으로 이어지는 주요 혈관의 순환을 분리하면서 대동맥을 역행하도록 설계되었으며,이에 따라 시약 흐름에 초점을 맞추고 종양 탈세포화를 허용합니다. 이 방법은 면역 스테인드 및 이미지화 할 수있는 보존 된 구조2를 가진 ECM 스캐폴드를 생성하여 서브미칸 세부 사항으로 ECM 구조 매핑을 허용합니다. 이 프로토콜을 수행하기 위해, 그것의 사용에 잠재적인 한계를 나타낼 수 있는 외과 및 미세 수술 기술 (해부, 미세 주입 및 카테터화)를 취득할 필요가 있습니다. 우리의 지식에, 이 방법은 네이티브 ECM 구조 이미징 분석을 위한 최첨단을 나타냅니다2,3.

<table><tbody><tr><td>MICROSURGERY</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-0 봉합사, 삼각형 절편 바늘(Vicryl)</td><td>Ethicon</td><td>6301124</td><td></td></tr><tr><td>9-0 마이크로 봉합사(Safil)</td><td>B Braun</td><td>G1048611</td><td></td></tr><tr><td>Adson 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>치아가 있는 Adson 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 마이크로니들 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>no. 12061-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 마우스 안락사용 환기실</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈이온수 (Milli-Q IQ 7000, 초순수 실험실 용수 시스템)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>일회용 폴리스티렌 트레이 (~30 &times; 50 cm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경 (Greenough, 두 팔 구즈넥 포함)</td><td>Leica</td><td>S6 D</td><td></td></tr><tr><td>양단 마이크로스파튤라</td><td>Fine Science Tools</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 마이크로펜치 (2개)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 마이크로펜셉스와 45°; 팁 (2개)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>이발기</td><td>Oster</td><td>76998-320-051</td><td></td></tr><tr><td>Halsey 바늘 홀더(텅스텐 카바이드 죠 포함)</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>정맥 주사 24게이지 카테터(Insyte)</td><td>BD</td><td>381512</td><td></td></tr><tr><td>정맥 주사 26게이지 카테터(Terumo)</td><td>Surflo-W</td><td>SR+DM2619WX</td><td></td></tr><tr><td>메이요 가위 (터프 컷, 스트레이트)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>14110-15</td><td></td></tr><tr><td>고리 팁이있는 마이크로 집게 (2 개)</td> <td>Aesculap</td><td>FM571R</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 스프링 가위 (Vannas, 곡선)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>미니 커터</td><td>KLS Martin</td><td>80-008-03-04</td><td></td></tr><tr><td>Molt Periostotome</td><td>Aesculap</td><td>D0543R</td><td></td></tr><tr><td>바늘(27 게이지; Microlance)</td><td>BD</td><td>21018</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월 (멸균) 또는 수술용 냅킨&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>톱니 가위 (CeramaCut, straight)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>주걱 (Freer-Yasargil)</td><td>Aesculap</td><td>OL166R</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (1 mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021001</td><td></td></tr><tr><td>주사기(10mL; Plastipak)</td><td>BD</td><td>3021110</td><td></td></tr><tr><td>힘줄 가위 (Walton)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14077-09</td><td></td></tr><tr><td>IMMUNOSTAINING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 당나귀 안티 기니피그 IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>BSA(알부민 소 분율 V, 표준 등급, 동결건조)&nbsp;</td><td>Serva</td><td>11930.03</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV 다클론 항체 (RRID: AB_2276457)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>AB756P</td><td>숙주: 토끼</td></tr><tr><td>PBS(pH 7.4, 10배, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>70011044 숙주: 염소</td></tr><tr><td>페리오스틴 다클론 항체(Manuel Koch의 친절한 선물. RRID:AB2801621)</td><td></td><td></td><td>호스트:</td></tr><tr><td>칼날 no.11 (pcs. 10)</td><td>VWR</td><td>233-5364)</td><td></td></tr><tr><td>세럼 (일반 당나귀 혈청)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td><강력한>이미징</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 검출기 (하이브리드 검출기 (Leica, HyD S 모델) 및 광전자 증배관 (PMT; )&nbsp;</td><td>라이카</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 형광 광원&nbsp;</td><td>라이카</td><td>EL6000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 현미경 (도립 다광자 현미경)&nbsp;</td><td>라이카</td><td>SP5-X MP</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 대물렌즈(람다 블루, 20&times;, 0.70 개구수(NA) IMM UV)&nbsp;</td><td>라이카</td><td>HCX PL AP&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; 2광자 Ti&ndash; 사파이어 레이저(Spectra-physics, Mai Tai DeepSee 모델)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 백색광 레이저(WLL)&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DECELLULARIZATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올 (절대 알코올 99.9%); 절대 알코올은 탈이온수를 사용하여 70% (vol/vol)로 조정해야 합니다.</td><td>매실</td><td>1680766</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수 (Milli-Q IQ 7000, 초순수 실험실 급수 시스템)&nbsp;</td><td>Merck</td><td>ZIQ7000T0</td><td></td></tr><tr><td>Luer-to-tubing male fittings (1/8 inch)</td><td>World Precision Instruments</td><td>13158-100</td><td></td></tr><tr><td>PBS (pH 7.4, 10&times;, Gibco)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프(12채널 포함)</td><td>Ole Dich</td><td>110AC(R)20G75</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜브(2mm 내경 및 4mm 외</td>경 포함)<td>Ole Dich</td><td>31399</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>08591-1ML-F</td><td></td></tr><tr><td>소듐 데옥시콜레이트(DOC)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실황산</td><td>염 시그마-알드리치</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td><강한>H& E 염색</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>15434389</td><td></td></tr><tr><td>96% 에탄올</td><td>자두</td><td>201446-5L</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>자두</td><td>201152-1L</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립(24x50mm, 1000개)</td><td>Hounisen</td><td>422.245</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds 중간체(15 x 15 x 5mm, 100개)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td></td></tr><tr><td>DPX 마운팅 매체</td><td>Hounisen</td><td>1001.0025</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y 용액 알코올 0.5%</td><td>Sigma</td><td>1024390500</td><td></td></tr><tr><td>Feather 마이크로톰 블레이드 스테인리스강, C35(50개)</td><td>Pfm 의료용</td><td>207500003</td><td></td></tr><tr><td> Fisherbrand Superfrost Plus 슬라이드(25 x 75mm, 144개)</td><td>Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6319483 Mayers hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>MHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>OCT 화합물</td><td>VWR</td><td>361603E</td><td></td></tr><tr><td>슬라이드 스캐너 (Nanozoomer)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Sigma</td><td>534056-4L</td><td></td></tr></tbody></table>

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

Decellularization of the Murine Cardiopulmonary Complex

우리는 여기에 마우스 심장과 폐에 대한 탈세포화 프로토콜을 제시합니다. ECM 토폴로지 및 컴포지션을 분석하는 데 사용할 수 있는 구조적 ECM 스캐폴드를 생성합니다. 그것은 탈세포 에이전트로 심혼 과 폐를 퍼퓨퓨어하기 위하여 안락사 마우스의 기관 및 대오르타를 카테터로 케이터터로 디자인된 미세 외과 절차를 기반으로 합니다. 탈세포화된 심폐 복합체는 구조적인 ECM 단백질의 위치를 밝히기 위하여 그 후에 면역염색될 수 있습니다. 전체 절차는 4 일 이내에 완료 할 수 있습니다.
이 프로토콜에서 발생하는 ECM 스캐폴드는 치수 왜곡이 없습니다. 세포의 부재는 3D에서 서브 미칸 해상도에 ECM 구조의 구조적 검사를 가능하게한다. 이 프로토콜은 섬유증과 암의 마우스 모델을 포함하여 4 주 된 어린 쥐로부터 건강하고 병에 걸린 조직에 적용 될 수 있으며, 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 결정하는 방법을 열어.

심폐 탈세포화 프로토콜을 성공적으로 완료한 후, 대동맥 아크와 같은 부속 조직뿐만 아니라 심장과 폐는 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린-에오신 염색(도 1)에 의해 검증될 수 있으며, 이는 네이티브 조직과 비교하여 핵의 제거를 보여주는 것이다. 이 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그것의 용해할 수 없는 ECM 구조는 그대로2입니다. 도 2 는 마우스 심장 폐 복합체를 성공적으로 침투하는 데 필요한 주요 수술 단계의 회로도 표현을 나타낸다.
ECM 이미징 표준 설정에서, 이차 항체는 녹색, 빨강 및 극적 형광 채널 (즉...

이 프로토콜은 마우스의 심장과 폐를 탈세포화하는 것을 목표로합니다. 생성된 세포외 매트릭스(ECM) 스캐폴드는 면역염색및 이미지화되어 구성요소의 위치와 토폴로지를 매핑할 수 있다.

We present here a decellularization protocol for mouse heart and lungs. It produces structural ECM scaffolds that can be used to analyze ECM topology and ...

이 프로토콜은 세포외 행렬에 대한 게이트웨이입니다. 그것은 복잡성과 하위 미크로네 규모까지의 구조입니다. 따라서 이 방법의 주요 장점은 구조적 무결성을 유지하는 세포외 매트릭스를 얻을 수 있게 하여 생화학 및 해부학 적 분석의 길을 열어준다는 것입니다.절차를 시연하는 것은 알레한드로 마요르카 길라니, 라파엘 루텐, 마리아 라파에바, 현재 내 실험실과 크리스 매드슨에 있었고 누가 내 실험실에 있었고 룬드 대학에서 작업을 계속했다. 모발 클리퍼로 안락사 마우스의 흉부, 복부 및 뒷면을 면도하여 시작합니다. 70%에탄올로 이 지역을 소독합니다.그런 다음 마우스를 폴리스티렌 트레이에 고정하여 네 개의 끝 뒷다리와 머리와 꼬리를 확장합니다. 미세 수술 현미경 아래에 놓습니다. 마요 직선 패턴 가위를 사용하여, 하부 부위에서 하복부로 의한 배분 절개를 하고 흉부 벽과 복막을 노출하도록 피하한다.그런 다음 흉부 벽의 양쪽에 있는 여섯 번째 늑간 공간을 따라 가슴 경 전공을 절단하고 가슴 경 경미한 근육을 잘라 미세 수술 가위를 사용합니다. 직선 패턴 가위로 이전 절개를 따라 흉골을 자른다. 그런 다음 긴 축을 따라 흉골을 절단하여 스터노절제술을 완료합니다.고양및 핀, 흉부 벽의 양쪽은 심폐 복합체를 노출합니다. 둥근 기울어진 마이크로 포셉을 사용하여 흉선과 주변 지방 조직을 섬세하게 잡아 당겨 서 부착물을 제거합니다. 그리고 마이크로 가위로 식도를 잘라냅니다.날카로운 마이크로 집게와 brachiocephalic 동맥을 분리합니다. 그런 다음 왼쪽 공통 경동맥을 분리하고 혈관분해와 소작을 용이하게 하기 위해 기본 조직으로부터 서브클라비아 동맥을 분리합니다. 마이크로니들 홀더와 날카로운 마이크로 집게와 9개의 오 봉합사를 사용하여 브라치오페할릭왼쪽 공통 경동맥과 좌측 서브클라비아동맥의 출현 위에 바늘을 놓고 브라치오페할릭 정맥을 소작한다.마이크로 가위를 사용하여 인대를 단면화하여 입구를 엽니다. 기관지에 27 게이지 카테터를 도입하고 기관지가 기관지에 들어갈 때까지 섬세하게 밀어 내어 기관지를 방해하지 않도록 주의하십시오. 6O 봉합사를 사용하여 카테터를 확보하기 위해 기관 주위에 3 개의 바늘을 놓습니다.12 흉부 척추의 높이에서 마우스를 절제하고, 내림차순 아오르타는 척추에 전방으로 실행하고 척추와 함께 여기에 단면해야합니다. Aorta를 개조하고 대동맥 호에 도달할 때까지 카테터를 밀어 넣습니다. 봉합사를 사용하여 카테터 팁 아래 5밀리미터에서 시작하여 아오르타 주변에 4개의 바늘을 놓습니다.실리콘 튜빙과 낮은 커넥터를 사용하여 마우스를 펌프 시스템에 연결합니다. 분당 200 마이크로리터에서 15분 동안 탈화된 물로 퍼퓨즈합니다. 그런 다음 관류제를 0.5%DOC로 변경하고, 탈이온화된 물에 희석하고 밤새 퍼퓨즈합니다.다음날, 회류제를 탈화된 물에 희석한 0.1%SDS로 변경하고 8시간 동안 퍼퓨즈한다. 그런 다음 SDS와 DOC를 씻어 24 시간 동안 탈화된 물로 퍼퓨징하여 흉부에 부착물을 분리하여 탈세포 된 심장과 폐를 다시 씻어 내보도록 합니다.멸균 저온 튜브에 1%페니실린 연쇄상 구균및 섭씨 4도에 0.3 마이크로몰라 나트륨 아지드를 사용하여 분해된 물에 조직을 저장합니다. 면역 염색을 수행하기 위해, 하룻밤 6 %의 당나귀 혈청과 3 %BSA를 포함하는 냉동 튜브에서 인큐베이팅하여 샘플을 차단합니다. 그런 다음 PBS에서 3%당나귀 혈청에서 24시간 동안 1차 항체로 배양한다.인큐베이션 후 세척당 1시간 동안 PBST에서 샘플을 5회 세척합니다. PBS에서 3%당나귀 혈청에서 형광으로 공주된 이차 항체를 24시간 동안 배양한다. 그런 다음 PBST에서 세서를 반복합니다.이온화된 물을 추가하고 직접 조명에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 샘플을 이미지화하려면 유리 바닥 접시에 넣고 두 방울의 저장 액으로 가습하십시오. 목표를 설정하고 형광광을 사용하여 샘플을 검사합니다.컴퓨터 제어로 전환, 레이저를 켜고 레이저 강도, 핀홀 조리개, 검출기 파장, 게인, 해상도 및 줌을 조정합니다. Z 스택의 숫자와 단계 크기를 설정한 다음 인수를 시작합니다. 안락사 된 마우스에서 하나의 폐 엽을 소비하고 5 밀리미터 저온 금형에 의해 10 10 10에 배치합니다.약 500마일의 100마일 마이크로리터의 OCT 화합물로 덮고 드라이 아이스에 얼립니다. 샘플을 해당 온도에서 유지관리합니다. 가공 된 마우스에서 탈세포 폐 엽 하나를 소비하고, 아래로 가장 큰 표면적을 가진 냉동 금형에 배치하고 OCT 화합물로 덮습니다.드라이 아이스에 샘플을 동결하고 그렇지 않으면 필요할 때까지 그 온도에서 유지합니다. 샘플은 적어도 12 주 동안 저장할 수 있습니다. 냉동 조직 블록을 영하 20도의 5마이크로미터 섹션으로 섹션화하려면 저온을 사용하십시오.그리고 접착제 유리 슬라이드에 섹션을 배치합니다. 공기가 건조 될 때까지 슬라이드를 실온으로 옮기십시오. PBS에서 슬라이드를 잠깐 몰입하고 PBS에서 4 %의 파라포름알데히드를 15 분 동안 담가 두십시오.PBS에서 한 번 씻은 다음, 세척당 5분 동안 증류수로 두 번 씻습니다. 마이어의 헤마톡슬린 솔루션에 10분 간 슬라이드를 담그십시오. 다음으로, 10 분 동안 증류수 아래 코플랜드 항아리에 슬라이드를 세척하고 7 분 동안 eosin 용액에 담급.자일렌에 여러 번 찍어. DPX 장착 중간 크기의 몇 방울을 바르고 유리 커버 슬립을 놓습니다. 슬라이드를 화학 후드 아래에서 밤새 건조한 다음 슬라이드 스캐너에서 스캔합니다.프로토콜을 성공적으로 완료한 후 심장과 폐 및 NX 조직은 세포가 없습니다. 탈세포화는 ECM 스캐폴드의 헤마톡시린 에신 염색에 의해 검증될 수 있다. 비계는 신선한 장기의 치수를 유지하고 그 부전적 ECM 구조는 그대로입니다.ECM 스캐폴드는 투과성 및 광 침투성이 증가하는 것으로 나타났다. 전동 현미경 단계와 이 프로토콜을 사용하면 서브 미크론 해상도에서 전체 마운트 샘플의 3차원 타일 이미징을 허용합니다. 완전한 균일 한 탈화를 달성하기 위해 관심기관을 향해 흐름을 피하는 것이 필수적입니다.혈관의 미세 수술 해부 및 결찰이 효과적이어야합니다. 그리고 동시에 네이티브 VCM 구조를 유지하기 위해 대상 조직을 존중한다. 이 절차에 따라, 비계는 구조 적인 ECM 단백질을 위해 풍부하게 될 것이고 질량 분광법 또는 조직 공학을 위해 사용될 수 있습니다.이 기술은 세포외 매트릭스의 고해상도 매핑을 위한 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 혈관 구조를 통해 세제의 사전 관류를 적용하여 탈세포화된 세포외 기질 또는 ECM 골격을 생성하는 방법을 보여줍니다. 그런 다음 구조적 ECM 스캐폴드를 사용하여 심폐 질환과 관련된 ECM 리모델링을 분석할 수 있습니다.

심폐 복합체 탈세포화: 쥐 모델에서 심장 및 폐를 탈세포화하는 기술

신속하고 완벽하게 역행 재관류를 통해 그대로 돼지의 심장에서 세포 구성 요소를 제거하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 여러 임상 응용 프로그램에서 사용하기 위해 가능성이있는 사이트 특정 심장 세포 외 기질 비계를 산출.

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

전체 장기 탈세포화는 재생 의학에 사용될 수 있는 자연적인 생물학적 골격을 생성합니다. 폐 재생의 비인간 영장류 모델에 대한 설명이 제시되는데, 이는 전체 폐가 탈세포화되고 성체 줄기 세포와 내피 세포를 파종하여 혈관 순환과 액체 매체 환기를 촉진하는 생물 반응기에 파종되는 것입니다.

Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor(특수 대형 장기 생물반응기를 이용한 비인간 영장류 폐 탈세포화 및 재세포화)

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격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

이 연구에서 우리는 재생 연구에 사용되는 소설, 신생아, 쥐의 심장 발판을위한 방법론을 제공합니다.

신생아 심장 공사장 공중 발판 : 회생 연구 소설 행렬

심근세포의 세포주기 변이와 세포 분열을 구별하기 위해 심근세포 핵의 명확한 식별을 위한 Myh6-H2B-mCh 형질전환 마우스와 세포 분열과 세포주기 변이를 구별하기 위한 CAG-eGFP-아닐린 마우스의 두 가지 형질전환 마우스 라인을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

출생 후 심근 세포의 세포주기 변화의 시각화 및 핵의 결정

심장 세포 외 기질 (ECM) 생활 내내 개장 하는 생리 적 지속 하는 동안 조직 및 장기에서 핵심 프로세스를 조정 하는 분자의 복잡 한 네트워크입니다. 태아 및 성인 심 혼의 표준된 decellularization는 네이티브 아키텍처 및 biomechanical 속성을 포착 하 여 3D 컨텍스트에서 두 조직의 비교 실험 연구를 허용 합니다.

시험관 연구에 대 한 3D 같은 플랫폼으로 태아와 성인 심장 조직 Explants의 비교 Decellularization

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

고전적으로, 마우스 배아 판막 원초의 심내막은 횡단, 관상 또는 시상 절편을 사용하여 분석되었습니다. 판막 형성 영역에서 심내막의 2차원 이미징에 대한 우리의 새로운 접근 방식은 판막 발달 중 심내막의 평면 극성 및 세포 재배열 분석을 가능하게 합니다.

엔 페이스 마우스 배아에서 평면 형태형성 분석을 위한 심내막 쿠션 준비

이 프로토콜은 쥐 폐 정맥의 현미경 유도 분리 및 면역형광 염색을 보여줍니다. 좌심방, 폐정맥 및 해당 폐가 포함된 조직 샘플을 준비하고 심장 Troponin T 및 Connexin 43에 대해 염색합니다.

쥐 폐 정맥에서 심근 슬리브의 미세 해부 및 면역형광 염색

이 논문은 탈세포화(decellularization) 및 재세포화(recellularization) 방법을 사용하여 생체공학적 마우스 폐를 만드는 방법을 설명합니다. 또한 후속 정소성 폐 이식에 대해서도 자세히 설명합니다.

탈세포화된 마우스 폐와 1차 인간 내피 세포를 이용한 생체공학적 폐 이식

배우세요 뮤린 심폐 복합체의 탈세포화 방법으로 세포외기질(ECM) 스캐폴드를 제조하는 기술입니다. 이 프로토콜은 구조적 무결성을 유지한 채 생화학 및 해부학적 분석이 가능하게 하며, 재생의학 연구에 활용됩니다.

뮤린 심폐 복합체의 탈세포화

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