Name: 축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경절 세포의 공동 배양을 통한 축삭 재생 평가 방법을. 이 기술은 신경 손상 후 세포 치료 후보 물질로서의 재생 의학 적용 가능성을 밝히는 데 활용됩니다.

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이 작품은 프로젝트 SAF2017-82736-C2-1-R 장관 드 시엔시아 e 이노바시온에서 MTM-F, Fundación Universidad Francisco de Vitoria에서 JS에 의해 재정적으로 지원되었다.

참고: 동물 실험은 국가 및 기관 생물 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. ihOEG (Ts12 및 Ts14) 문화
참고: 이 절차는 조직 배양 생물 안전 캐비닛의 멸균 조건하에서 수행됩니다.
<ol><li>표 1에제공된 50mL ME10 OEG 배양 배지를 준비한다.</li>
	<li>표 1에제공된 대로 DMEM/F12-FBS 5mL을 15mL 원문 튜브에 준비합니다.</li>
	<li>깨끗한 수조에서 37°C에서 두 미디어를 15분 동안 데우습니다.</li>
	<li>깨끗한 수조에서 Ts12 및 Ts14 세포바이알을 37°C에서 해동합니다.</li>
	<li>2단계에서 제조된 DMEM/F12-FBS 배양 배지에 세포를 다시 일시 중지하고 추가합니다.</li>
	<li>200 x g에서5 분 동안 원심 분리기.</li>
	<li>상체를 갈망합니다.</li>
	<li>ME10 배지 의 500 μL을 추가하고 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
	<li>ME10의 3mL로 p60 세포 배양 접시를 준비하고 셀룰러 서스펜션을 드롭 와이즈로 추가합니다.</li>
	<li>플레이트 에 걸쳐 균일하게 세포를 배포하려면 이동합니다.</li>
	<li>배양 세포는 37°C에서 5% CO2로한다. 참고: 합류에 도달한 후, 적어도 다른 구절은 공동 문화를 위한 세포를 최적화하기 위하여 행해져야 합니다. 90%의 합류가 공동 문화를 위해 커버립에 시드하기 전에 필요합니다. Confluent p-60은 Ts14의 경우 7 x 105의 평균 셀 수와 Ts12 세포주에 대해 2.5 x 106의 평균 셀 번호를 가지고있다. Ts12 및 Ts14 세포주마다 2-3일마다 통과되어야 합니다.</li>
</ol>2. 분석용 ihOEG(Ts12 및 Ts14) 준비
참고: 이 단계는 RGN 해부 및 공동 문화 전에 24h를 수행해야 합니다.
<ol><li>12mm Ø 커버립을 10 μg/mL 폴리 L-리신(PLL)으로 1시간 동안 처리합니다. 참고: 커버립은 PLL 솔루션에서 하룻밤 동안 방치할 수 있습니다.</li>
	<li>커버립을 1x 인산완충식염(PBS)으로 세 번 씻습니다.</li>
	<li>p60 세포 배양 접시로부터 Ts12 및 Ts14 ihOEG 세포를 분리한다.<ol>
<li>DMEM/F12-FBS 배양 배지(표1)의4mL을 15mL 원문 튜브에 추가합니다. 깨끗한 수조에서 37 °C에서 따뜻하게합니다.</li>
		<li>접시에서 배지를 제거하고 1x PBS-EDTA1mL로 세포를 세척합니다.</li>
		<li>OEG 세포에 트립신-EDTA 1mL을 추가하고 37°C에서 3-5분, 5% CO2에서3-5분 동안배양한다.
</li>
		<li>p1000 파이펫으로 세포를 수집하고 3.1 단계에서 준비된 매체로 전송합니다.</li>
		<li>200 x g에서5 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>상체를 갈망합니다.</li>
		<li>ME10 배지 1mL을 추가하고 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
		<li>혈종계에서 셀 수를 계산합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종자 80,000 Ts14 세포 또는 100,000 Ts12 세포 /잘 ME10 배지의 500 μL에서 24 웰 플레이트에서 커버립에.</li>
	<li>배양 세포는 37°C에서 5%CO2,24h.</li>
</ol>3. 망막 조직 해부
참고: 2개월 된 수컷 위스타 쥐는 RGN 소스로 사용됩니다. 24웰 세포 접시의 20 개의 우물에 대한 두 개의 망막 (한 마리의 쥐). 사용하기 전에 자동 클클레이브 수술 재료. 파팡 해리 키트는 상업적으로 구입(재료의 표). 재구성에 대한 공급자의 지침을 따릅니다. 5mM 스톡에서 D,L-2-아미노-5-인포노발레산(APV)을 재구성하고 알리쿼트준비한다.
<ol><li>분석 당일, 다음 미디어를 준비한다.<ol>
<li>차가운 EBSS (파아펜 해리 키트의 바이알 1)의 5mL와 p60 세포 배양 접시를 준비합니다.</li>
		<li>p60 세포 배양 접시를 파팔 해리 키트의 재구성된 바이알 2(papain)와 50 μL의 APV로 준비한다.  그런 다음 250 μL의 상반신 3(DNase plus 5 μL)를 추가합니다.</li>
		<li>멸균 튜브 믹스 2.7 mL의 유리병 1과 300 μL 의 유리병 4 (알부민-ovomucoid 프로테아제 억제제). 바이알 3(DNase)의 150 μL과 30 μL의 APV를 추가합니다.</li>
		<li>표 1에제공된 바와 같이 신경분사-B27 배지(NB-B27)의 20mL를 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>CO2로질식하여 쥐를 희생하십시오.</li>
	<li>기요틴으로 참수하여 머리를 제거하십시오. 100mm 페트리 접시에 넣고 머리에 에탄올 70%로 스프레이한 후 라미나르 플로우 후드에 넣습니다.</li>
	<li>쥐의 수염을 가위로 잘라 서 눈 조작을 방해하지 않도록 합니다.</li>
	<li>메스로 눈을 가로질러 절개를 할 수 있을 만큼 안구를 꺼내서 포셉으로 시신경을 잡아냅니다.</li>
	<li>렌즈와 유리체 유머를 제거하고 망막 (오렌지 와 같은 조직)을 꺼내고 눈의 나머지 층은 내부에 머물러 있습니다 (안료 상피 층을 포함).</li>
	<li>3.1.1 단계에서 제조된 p60 세포 배양 접시에 망막을 놓습니다.</li>
	<li>3.1.2 단계에서 제조된 p60 세포 배양 접시에 망막을 옮기고 메스로 메스를 대략 적인 크기의 작은 조각으로 자르고 1mm.</li>
	<li>15mL 플라스틱 튜브로 옮김합니다.</li>
	<li>조직을 30분 동안 배양하고, 가습된 인큐베이터에서 5% CO2미만의 37°C에서, 10분마다 교반한다.</li>
	<li>유리 파스퇴르 파이펫으로 위아래로 피펫을 하여 세포 덩어리를 분리합니다.</li>
	<li>5 분 동안 200 x g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다.</li>
	<li>수퍼나탄을 버리고 파아픔을 비활성화하고, 3.1.3 단계에서 준비된 용액의 세포 펠릿을 재보중단한다. (2 눈에 1.5 mL).</li>
	<li>이 셀 서스펜션을 재구성된 바이알 4의 5mL로 조심스럽게 파이프화합니다.</li>
	<li>원심 분리기 200 x g에서 5 분 동안.</li>
	<li>원심분리하는 동안, OEG 24 웰 셀 플레이트(이전에 2단계에서 제조됨)에서 ME-10 배지를 완전히 제거하고 잘 당 NB-B27 배지의 500 μL로 대체한다.</li>
	<li>상체를 버리고 NB-B27 배지의 2mL에서 세포를 다시 중단한다.</li>
	<li>m24 플레이트의 웰당 망막 셀 서스펜션 100 μL을 PLL 처리 또는 OEG 단층 커버립에 플레이트.</li>
	<li>NB-B27 배지에서 96h에 대해 5%CO2로 37°C에서 배양을 유지한다.</li>
</ol>4. 면역 염색
<ol><li>96h 후, 배양 배지(600 μL)(PFA 최종 농도 2%)에 1x PBS에서 4%의 파라포름데히드(PFA)의 동일한 부피를 첨가하여 10분 동안 세포를 고정한다.</li>
	<li>24-멀티웰 플레이트에서 미디어와 PFA를 제거하고 다시 한 번 1배 PBS에 4% 파라포름알데히드(PFA)의 500 μL을 추가합니다. 10 분 동안 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>픽서를 버리고 1x PBS로 3번 5분 동안 세척하십시오.</li>
	<li>PBS(PBS-TS)에서 0.1% 트리톤 X-100/1% FBS를 30~40분 동안 차단합니다.</li>
	<li>다음과 같이 PBS-TS 완충제에서 1차 항체를 준비하십시오: SMI31 (MAP1B 및 NF-H 단백질에 대하여) 단클론 항체 (1:500). 514 (MAP2A 및 B 단백질인식) 토끼 폴리클론 항혈제 (1:400).</li>
	<li>1 차적인 항체를 균원에 추가하고 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
	<li>다음날, 항체를 버리고 커버립을 1x PBS로 3번, 5분 동안 씻는다.</li>
	<li>다음과 같이 PBS-TS 버퍼에서 이차 항체를 준비하십시오: SMI-31의 경우, 항 마우스 알렉사 플루어 488 (1:500). 514, 안티 토끼 알렉사-594 (1:500).</li>
	<li>1 h, RT에서, 어둠 속에서 대응하는 형광 이차 항체를 가진 세포를 배양한다.</li>
	<li>커버립을 1x PBS로 3회, 어둠 속에서 5분 동안 씻습니다.</li>
	<li>마지막으로, 장착 매체(재료의 표)와커버립을 마운트하고 4 ° C에서 유지합니다. 참고: 필요할 때마다 DAPI(4,6-디아미드노-2-페닐린돌)를 가진 형광 핵 염색이 수행될 수 있다. 장착하기 전에, DAPI (1x PBS에서 10 μg /mL)와 어둠 속에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 커버립을 1x PBS로 3번 세척하고 마지막으로 마운팅 매체로 커버립을 장착합니다.</li>
</ol>5. 축축한 재생 정량화
참고: 샘플은 상피 성화 현미경의 40배 목표에 따라 정량화됩니다. 최소 30장의 사진을 무작위 필드에서 촬영해야 하며, 적어도 200개의 뉴런이 있는 각 치료에 대해 정량화되어야 합니다. 각 실험은 최소 3회 반복되어야 합니다.
<ol><li>RGNs의 총 인구에 비해 축축 (SMI31 양성 중성염)을 가진 뉴런의 백분율을 정량화 (MAP2A/B 514 뉴런 바디및 원원수의 양성 면역 염색으로 확인).</li>
	<li>축 축 재생 지수 또는 평균 축 산 길이(μm/뉴런)를 정량화합니다. 이 매개변수는 모든 확인된 축축의 길이(μm)의 합으로 정의되며, 각축을 제시했는지 여부에 관계없이 계산된 뉴런의 총 수로 나뉜다. 축 사 길이 이미지 소프트웨어 ImageJ (NIH-미국)의 플러그인 NeuronJ를 사용 하 여 결정 됩니다.</li>
	<li>적절한 소프트웨어를 사용하여 평균, 표준 편차 및 통계적 유의를 계산합니다.</li>
</ol>

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CNS 상해 부위에서 OEG 이식은 구성적인 프로 신경 재생특성7,8,9로인해 CNS 부상에 대한 유망한 치료법으로 간주됩니다. 그러나, 조직원에 따라 후각점막(OM-OEG)과 후각전(OB-OEG)-또는 기증자의 나이에 따라, 이러한 용량26,31,33,36에상당한 변화가 존재한다. 따라서 생체 내 연구를 시작하기 전에 주어진 OEG 샘플의 신경 재생 용량을 분석하기 위해 시험관 모델에서 쉽고 재현 가능한 것이 중요합니다. 이 프로토콜에서, 성인 쥐의 축축화 된 RGN은 분석하기 위하여 OEG의 단층상에 교배됩니다. 면역 형광에 의한 R...

성인 중추 신경계 (CNS) 뉴런은 부상이나 질병 후 재생 능력이 제한되어 있습니다. CNS 재생을 촉진하는 일반적인 전략은 줄기 세포, 슈완 세포, 성상세포 또는 후각 내성 신경교(OEG) 세포1,2,3,4,5와같은 축축성장을 유도하는 세포 유형의 부상부위에서이식된다.
OEG는 신경 문장6에서 파생되고 후각 점막과 후각 전구에서 찾습니다. 성인에서, 후각 감각 뉴런은 환경 노출의 결과로 정기적으로 죽고 새로 분화 된 뉴런으로 대체됩니다. OEG는 이러한 새로운 후각 축축을 둘러싸고 안내하여 후각 전구에 들어가 CNS7에서목표를 가진 새로운 시냅스를확립합니다. 이러한 생리적 특성으로 인해 OEG는 척수 나 시신경 손상과 같은 CNS 부상 의 모델에 사용되어 왔으며 신경 생성 및 신경 보호 특성은8,9,10,11로입증되었습니다. 세포외 매트릭스 프로테아제 생산 또는 신경영양 및 축삭 성장 인자12,13,14의분비를 포함한 이러한 세포의 재생 특성에 대한 여러 가지 요인으로 확인되었습니다.
1차 OEG 세포를 확장하는 기술적 한계를 감안할 때, 우리는 이전에 균일 한 OEG의 무제한 공급을 제공하는 가역 불멸의 인간 OEG (ihOEG) 클론 라인을 설립하고 특성화했습니다. 이러한 ihOEG 세포는 부검에서 얻은 후각 전구에서 제조된 1차 배양에서 유래한다. 그(것)들은 텔로머라아제 촉매 서브유닛 (TERT)과 종양균 Bmi-1의 전도에 의해 불멸되고 SV40 바이러스 큰 T 항원15,16,17,18로변형되었다. 이들 ihOEG 세포주 중 2개는 Ts14로, 이는 본래 배양과 Ts12의 재생 능력을 유지하며, 이러한 실험에서 낮은 재생 제어로 사용되는 낮은 재생성라인(18)이다.
신경 손상 후 축 하 재생을 육성 하는 OEG 용량을 평가 하기 위해, 여러 시험 관 모델이 구현 되었습니다. 이러한 모델에서, OEG는 서로 다른 뉴런 기원과 중성염 형성 및 신장의 배양에 적용되며, 이는 글리아교 공동 문화에 대한 반응으로 분석된다. 이러한 뉴런 소스의 예로는 신생아 쥐 피질뉴런(19)이있으며, 피질조직(20)에서쥐 배아 뉴런에 수행된 스크래치 상처, 쥐 망막 이병21,쥐 시상하또는 해마 산후 뉴런22,23,산후 쥐 등쪽 뿌리 신경절뉴런(24), 산후 마우스 코르티코피타피통뉴런(25,인간 NT2 뉴런26)또는 사후 뇌피질 뉴런이 반응성 성상세포 흉터와 같은 배양(27)을 한다.
그러나 이러한 모델에서는 재생 분석이 부상당한 성인 뉴런에 없는 본질적인 가소성을 가진 배아 또는 산후 뉴런에 의존합니다. 이러한 단점을 극복하기 위해, 우리는 원래 Wigley등28,29,30,31에 의해 개발된 것을 기반으로 성인 망막 신경절 뉴런(RGNs)과 OEG 라인의 공동 배양에서 성인 축축산 재생 모델을 제시하고 우리 그룹12,13,14, 15,15, 16,16, 17, 18, 18, 18, 18, 18, 17, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 15, 16, 18,18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 17, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 17, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 18, 17, 18, 18, 18, 18,1 간략하게, 망막 조직은 성인 쥐에서 추출하고 papain로 소화됩니다. 망막 세포 현탁액은 폴리리신 처리 커버립 또는 Ts14 및 Ts12 단층층상에 도금됩니다. 배양은 축산(MAP1B 및 NF-H 단백질)34 및 소마토덴드리틱(MAP2A 및 B)35마커를 고정하기 전에 96시간 동안 유지된다. 축사 재생은 축축을 가진 뉴런의 백분율로 정량화되며, RGNs및 축축 재생 지수의 총 인구에 대하여 뉴런당 평균 축축수 길이로 계산된다. 이 프로토콜은 ihOEG의 신경 재생 잠재력을 평가하는 데 유용할 뿐만 아니라 OEG 또는 다른 신경교 세포의 다른 소스로 확장 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>항체 514</td><td>Reference 34</td><td></td><td>MAP2A 및 B를 인식하는 Rabbit polyclonal antiserum.</td></tr><tr><td>항체 SMI-31</td><td>BioLegend</td><td>801601</td><td>MAP1B 및 NF-H 단백질에 대한 단클론 항체</td></tr><tr><td>안티 마우스 Alexa Fluor 488 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>안티 토끼 Alexa Fluor 594 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21207</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid</td><td>Sigma</td><td>283967</td><td>NMDA 수용체 억제제</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>핵 형광 염색</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 11573397</td><td></td><td>소 태아 혈청</td></tr><tr><td>FBS-Hyclone</td><td>Fisher Scientific</td><td>16291082</td><td>소 태아 혈청</td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health(NIH-USA)</td><td></td><td>이미지 소프트웨어</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Lonza</td><td>BE17-605F</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>신경 세포 배양 배지</td></tr><tr><td>Papain Dissociation System</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td>신경 세포 분리에 사용하기 위해</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Home made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-EDTA</td><td>Lonza</td><td>H3BE02-017F</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신/암포테리신 B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>정균 및 살균</td></tr><tr><td>뇌하수체 추출물</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>소 뇌하수체 추출물</td></tr><tr><td>폴리-L- 라이신(PLL)</td><td>Sigma</td><td>A-003-M</td><td></td></tr></tbody></table>

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

Coculture of Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia, as an In Vitro Model of Adult Axonal Regeneration

후각 내시경 신경교 (OEG) 세포는 후각 점막에서 후각 전구의 후각 신경 층 (ONL)으로 모든 방법을 국소화된다. 성인 생활 내내, 그들은 새로 생성 된 후각 뉴런의 축 하 성장에 대 한 열쇠, 라미나 프로 프리 테리토리에서 ONL. 그들의 프로 재생 속성으로 인해, 이 세포는 척수 또는 시신경 상해 모형에 있는 축축재생을 육성하기 위하여 이용되었습니다.
우리는 신경 손상 후 OEG 신경 재생 용량을 분석하고 측정하기 위해 체외 모델을 제시합니다. 본 모델에서, 가역적으로 불멸의 인간 OEG(ihOEG)는 단층으로 배양되고, 망막은 성인 쥐로부터 추출되고 망막 신경절 뉴런(RGN)은 OEG 단층상에 공동 배양된다. 96h 후, RGNs의 축산 및 소종 절인 마커는 축축및 평균 축산 길이/뉴런을 가진 RG의 수에 의해 정량화된다.
이 프로토콜은 배아 또는 산후 뉴런에 의존하는 다른 체외 분석에 비해 장점이 있으며 성인 조직에서 OEG 신경 재생 특성을 평가합니다. 또한 ihOEG의 신경 재생 잠재력을 평가하는 데 유용할 뿐만 아니라 OEG 또는 다른 신경교 세포의 다른 소스로 확장 될 수 있습니다.

이 프로토콜에서, 우리는 신경 손상 후 OEG 신경 재생 용량을 분석하는 체외 모델을 제시한다. 도 1에도시된 바와 같이, OEG 소스는 부검15,17,18에서얻은 후각 전구로부터 제조된 1차 배양으로부터 유래한 가역불멸인간 OEG 클론 세포주-Ts12-이다. 망막 조직은 성인 쥐로부터 추출되고, 소화되고, 망막 신경절 뉴런(RGN) 현탁액은 PLL 처리커버립 또는 ihOEG 단층층, Ts14 또는 Ts12에 도금된다. 축 산 및 소종 호르몬 성 마커는 면역 형광및 축산 재생에 의해 정량화된다.
Ts14 OEG 정체성은 S100β(도 2A)및 바이멘틴(도<strong class="xfig" style="font-size: 14px;...

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

Olfactory ensheathing glia (OEG) cells are localized all the way from the olfactory mucosa to and into the olfactory nerve layer (ONL) of the olfactory ...

당사의 프로토콜은 성인 축삭 재생을 촉진하기 위해 후각 외피 능력을 평가하는 간단하고 재현 가능한 모델입니다 이것은 다른 신경교세포 유형으로도 확장될 수 있는 후각 외피 신경교 재생 능력을 평가할 수 있는 정량적 기술입니다. 이 기술은 생체 내 또는 임상 연구로 전환하기 전에 신경계 손상에서 세포 치료의 후보로 후각 외피 신경교세포를 연구하기 위한 첫 번째 단계입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 우리 연구실의 박사 과정 학생인 Maria Portela입니다.시작하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 필요한 모든 미디어를 준비합니다. 쥐를 희생 한 후 100 밀리리터 페트리 접시에 머리를 넣고 70 % 에탄올을 뿌린 후 층류 후드에 넣으십시오. 쥐의 수염을 가위로 잘라 눈 조작을 방해하지 않도록 합니다.겸자로 시신경을 잡고 메스로 눈을 절개할 수 있을 만큼 안구를 빼냅니다. 수정체와 유리체액을 제거하고 망막을 빼내고 안의 나머지 층은 내부에 유지합니다. 5ml의 차가운 EBSS가 함유된 미리 준비된 P60 세포 배양 접시에 망막을 넣은 다음 재구성된 파파인과 50마이크로리터의 APV, 250마이크로리터의 DNA와 5마이크로리터의 APV가 있는 P60 세포 배양 접시에 넣습니다.메스로 망막을 작은 조각으로 자릅니다. 조각을 15ml 플라스틱 튜브에 옮기고 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소에서 10분마다 교반하여 30분 동안 배양합니다. glass pasture pipette로 위아래로 피펫팅하여 세포 덩어리를 해리합니다.그런 다음 세포 현탁액을 200배 G에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 150마이크로리터의 DNA와 30마이크로리터의 APV가 있는 알부민 OVO 점액성 프로테아제 억제제의 세포 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 5ml의 알부민 OVO 점액성 프로테아제 억제제에 세포 현탁액을 조심스럽게 첨가하고 원심분리를 반복합니다.원심분리하는 동안 OEG 24 웰 플레이트에서 EMI 10 매체를 완전히 제거하고 웰당 500마이크로리터의 NBB 27 매체로 교체합니다. 상층액을 버리고 2밀리리터의 NB B27 배지에 세포를 다시 현탁시킵니다. 100마이크로리터의 망막 세포 현탁액을 M 24 플레이트의 각 웰에 PLL 처리 또는 OEG 단층 커버 슬립으로 플레이트합니다.NB B27 배지에서 96시간 동안 5% 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양을 유지합니다. 96시간 후, PBS에 동일한 부피의 4%P

coculture-axotomized-rat-retinal-ganglion-neurons-with-olfactory

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서는, 우리는 함께 축삭의 성장에 glial 세포 이질의 영향을 연구하는 새로운 방법을...

새 Coculture 방법을 사용 액슨 성장에 대한 연구 Glial 세포 이질 영향

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

이 비디오는 쥐의 망막에서 망막 신경절 뉴런(RGN)을 분리하고 후각 외피 신경교세포(OEG) 세포와 공동 배양하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 손상 후 OEG의 신경 재생 잠재력을 연구할 수 있습니다.

망막 신경절 뉴런과 후각 외피 신경교세포의 공동 배양

이 비디오는 등쪽 뿌리 신경절 이식과 슈반 세포의 공동 배양 모델을 보여줍니다. 공동 배양 조건에서 아스코르브산은 슈반 세포가 수초화 형태로 분화되는 것을 촉진합니다. 슈반(Schwann) 세포는 축삭돌기를 여러 번 감싸 신경 기능에 필수적인 미엘린 수초(myelin sheath)를 만듭니다.

Neuron Myelination을 위한 Schwann Cells와 Dorsal Root Ganglion Explant의 공동 배양

출처: Cheah, M., et al. 등뿌리 신경절 주사(Dorsal Root Ganglion Injection)와 등뿌리 크러시 손상(Dorsal Root Crush Injury)은 감각 축삭 재생의 모델입니다. J. Vis. 특급 (2017). 이 비디오는 바이러스 현탁액을 배측근신경절(DRG)에 주입하고 마취된 쥐에서 등쪽 뿌리 분쇄를 통해 제어된 축삭 손상을 유도하는 단계별 절차를 보여줍니다. 이 프로토콜에는 DRG를 노출시키고, 축삭 재생을 촉진하기 위해 성장 촉진 바이러스 벡터를 전달하고, 감각 신경 손상 및 재생을 모델링하기 위해 척수에 대한 축삭 연결을 절단하는 것이 포함됩니다.

배근 신경절 주입 및 등뿌리 크러시 손상을 사용하여 쥐의 감각 축삭 재생 모델링

출처: Portela-Lomba, M., et. al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2020). 이 비디오는 불멸의 인간 후각 외피 신경교세포와 공동 배양된 축삭 절제술된 쥐 망막 신경절 뉴런(RGN)에서 축삭 재생의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. RGN은 붉은색 솜씨와 녹색 축삭돌기가 있는 면역 표지되어 있습니다. 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 캡처되었으며 축삭 및 축삭 재생 지수가 있는 뉴런의 비율은 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

후각 ensheathing 세포 (OECs)는 기본 후각 신경 세포의 성장을 허용 신경 능선 세포입니다. 이 특정 속성은 세포 이식에 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에서 후두 신경 손상 모델에서 OECs의 사용을 기반 셀룰러 이식 모델을 제시한다.

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

세포 배양 모델은 환경 조건 위에 상세한 제어를 제공하고, 따라서 신경 세포 생물학의 다양한 양상을 명료하게 강력한 플랫폼을 제공한다. 우리는 병아리 배아에서 감각 신경을 분리 해리, 문화 할 수있는 신속하고 저렴하고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 하층 준비 및 면역 세포의 세부 사항도 제공됩니다.

병아리 배아에서 분리 및 해리 감각 뉴런의 문화

이 프로토콜은 감각 축삭 재생을 연구하기 위한 모델로 성체 쥐에서 바이러스 벡터와 동시 등쪽 뿌리 압착 손상과 함께 등뿌리 신경절(DRG) 주사를 사용하는 것을 제시합니다. 이 모델은 감각 축삭 재생을 촉진하기 위한 유전자 요법의 사용을 조사하는 데 적합합니다.

등쪽 뿌리 신경절 사출 및 지느러미 루트 감각 축삭의 재생을위한 모델로 부상 크러시

후근 신경절과 슈반 세포의 공동 배양 시스템에서 말초 신경계의 수초화를 연구 할 수 있습니다. 이 모델은 말초 수초화를 관찰 및 정량화하고 미엘린 외피에 대한 관심 화합물의 효과를 연구할 수 있는 실험적 기회를 제공합니다.

쥐 등쪽 뿌리 신경절 외식편과 슈반 세포의 공동 배양에서 말초 축삭의 시험관 내 수초화

배우세요 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경절 세포의 공동 배양을 통한 축삭 재생 평가 방법을. 이 기술은 신경 손상 후 세포 치료 후보 물질로서의 재생 의학 적용 가능성을 밝히는 데 활용됩니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

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