막 단백질을 표적으로 하는 기능 분석 및 항체 개발을 위한 프로테올리포좀의 무세포 생산

모든 막 단백질은 신약 개발의 중요한 표적입니다. 멤브레인 단백질의 대규모 생산은 생화학적, 생물물리학적, 구조적 멤브레인 단백질 연구를 수행하는 데 병목 현상으로 남아 있습니다. 이 방법은 시험관 내에서 막 단백질을 효율적으로 합성하고 높은 성공률로 단시간에 정제된 프로테오리포좀을 준비하는 데 사용할 수 있습니다.

무세포 발현 플라스미드를 포함한 적절한 시약을 첨가하여 전사 반응 혼합물을 생성한 후, 부드러운 반전 또는 두드림으로 튜브 내용물을 혼합하고 마이크로 원심분리기에서 빠르게 회전합니다. 스핀 후, 전사 반응 혼합물을 섭씨 37도에서 6시간 동안 배양한 후 혼합 및 스핀 다운 단계를 수행합니다. 번역 버퍼를 준비하려면 신선한 초순수로 원액을 희석합니다.

소규모 번역의 경우, 초순수로 세척한 100마이크로리터 투석 컵을 사용하여 투석막에서 글리세롤을 제거합니다. 새 1.5ml 튜브에 초순수 1ml를 넣고 튜브에 작은 스케일 투석 컵을 삽입합니다. 그런 다음 컵에 500마이크로리터의 초순수를 첨가하여 실온에서 30분 동안 배양합니다.

리포좀을 준비하려면 50mg의 지질이 포함된 지질 용액을 증발 플라스크로 옮깁니다. 플라스크를 회전 증발기에 넣어 용매를 증발시킵니다. 플라스크 바닥 표면에 얇고 고르게 퍼진 지질 층이 생성되면 플라스크를 하룻밤 동안 음압 하의 진공 건조기로 옮겨 용매를 완전히 제거합니다.

다음날 아침, 건조제에서 플라스크를 제거하고 지질의 박막을 확인하십시오. 플라스크에 1ml의 번역 버퍼를 추가하고 플라스크를 회전시켜 얇은 지질 필름 위에 버퍼를 펴 바릅니다. 5분 후 플라스크를 초음파 처리하여 용액이 전체 지질 필름 표면에 닿을 수 있도록 때때로 각도를 변경합니다.

플라스크에서 지질이 완전히 제거되고 리포좀 현탁액이 균일해지면 초음파 처리를 중지합니다. 그런 다음 리포좀 현탁액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 체외 단백질 번역을 수행하기 전에 영하 80도의 물에 실온에서 몇 분 동안 보관된 밀 배아 추출물 튜브를 띄워 재료를 빠르게 해동합니다.

추출물을 해동하면 즉시 부드러운 반전으로 튜브 내용물을 혼합합니다. 그런 다음 스핀을 다운하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 밀 배아 추출물 mRNA와 리포좀을 첨가하여 번역 반응 혼합물을 생성합니다.

부드럽게 반전하거나 두드려 튜브 내용물을 혼합하고 마이크로 원심분리기에서 빠르게 회전합니다. 소규모 체외 단백질 번역을 수행하려면 소규모 투석 컵과 튜브에서 수분을 제거하고 튜브에 1ml의 번역 버퍼를 추가하고 컵에 300마이크로리터를 추가합니다. 60마이크로리터의 번역 반응 혼합물을 취합니다.

피펫 팁을 투석 컵의 번역 버퍼에 삽입합니다. 그런 다음 혼합물을 천천히 부드럽게 주입하십시오. 더 높은 밀도의 반응 혼합물은 자발적으로 컵 바닥으로 가라 앉아 층을 형성합니다.

증발을 방지하기 위해 컵을 뚜껑으로 덮으십시오. 대규모 번역을 수행하려면 25ml 튜브에 22ml의 번역 버퍼를 추가하고 2ml 투석 컵을 튜브에 넣습니다. 투석컵에 2ml의 번역 버퍼를 추가합니다.

번역 반응 혼합물 500마이크로리터를 취하여 혼합물을 컵의 번역 버퍼에 천천히 부드럽게 주입합니다. 섭씨 15도에서 24시간 동안 반응을 배양합니다. 다음 날, 피펫팅을 통해 투석 컵의 반응을 철저히 혼합하고 조잡한 프로테오리포좀 현탁액을 새 튜브로 옮깁니다.

proteoliposomes를 정제하려면 centrification에 의해 proteoliposome을 조잡한 현탁액에 침전시킵니다. 그런 다음 적절한 양의 얼음처럼 차가운 PBS 완충액에 3회 재현탁하여 프로테오리포솜을 세척합니다. 세척 후 프로테오리포좀 펠릿을 소량의 PBS에 철저히 재현탁하고 마이크로피펫을 사용하여 현탁액을 측정합니다.

그런 다음 PBS를 추가하여 서스펜션의 볼륨을 조정합니다. 각 현탁액을 새 마이크로 튜브로 옮깁니다. SDS 페이지 분석을 설정하려면 70마이크로리터의 물과 40마이크로리터의 3시간 농축 SDS 페이지 샘플 버퍼를 각 프로테오리포좀 현탁액 10마이크로리터에 추가합니다.

전기영동 챔버에 5-20% gradient SDS page gel을 설정합니다. 각 프로테오리포솜 샘플의 단백질 크기 마커 3, 6 및 12 마이크로리터의 2 마이크로리터와 10 마이크로리터의 소 혈청 알부민 표준물질을 겔에 로드합니다. 샘플을 로딩한 후 전기영동을 실행한 다음 Coomassie Brilliant Blue 염료로 겔을 염색합니다.

마지막으로 뜨거운 물에 젤을 부드럽게 흔들어 탈색하고 젤 이미지를 스캔합니다. 입증된 바와 같이 이 프로토콜을 사용하면 3개 이상의 막관통 나선을 가진 다양한 막 단백질을 단시간에 프로테오리포좀으로 쉽게 생산할 수 있습니다. 이 이중층 투석 방법에서는 장기간에 걸쳐 반응 혼합물의 상단과 하단 모두에서 기질의 지속적인 공급과 부산물 제거를 효율적으로 수행할 수 있어 탁월한 번역 효능을 얻을 수 있습니다.

이중층 투석 방법은 이중층 또는 투석 방법만 사용하는 것에 비해 생산성이 4배에서 10배 증가합니다. centrification에 의하여 synthesized proteoliposomes를 모으고 세척 완충액을 가진 부분적으로 정화는 매우 막 단백질의 정화 과정을 단축합니다. 이 cell-free 시스템은 조작이 쉽고 확장성이 뛰어납니다.

또한 다른 방법으로는 발현하기 어려운 기억 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법은 antimembrane 단백질, 항체 생산, SPR, Elisa 및 AlphaScreen과 같은 막 단백질을 사용하거나 표적으로 하는 조사 및 실험에 매우 유용합니다.