Name: 클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 마우스 골수 이식의 세 가지 방법을 통해 클로날 조혈을 연구하는 기법을. 전신 조사, 차폐 조사, 무전처리 적응 이식법을 비교하여 심혈관 부작용을 최소화하고 실험 결과를 개선하는 프로토콜을 확인하세요.

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이 작품은 K. 월시 (HL131006, HL138014 및 HL132564), S. 사노 (HL152174), M. A. 에반스 (20POST35210098) 및 일본 심장 재단에 대한 미국 심장 보조금에 대한 미국 국립 보건 원에 의해 지원되었습니다.

동물 과목과 관련된 모든 절차는 버지니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
1. 사전 조정 하기 전에
<ol><li>수신자 마우스를 항생제 보충 수역(5m 설페스토사졸, 0.86 mM trimethoprim)에 배치하여 조사 전에 ~24시간. 이것은 감염을 방지하기 위하여 필요합니다, 면역 계통은 조사 다음 억압될 것이고, 조사 다음 2 주 동안 유지될 것이기 때문에. 이 시점에서, 먹이 를 장려 하 고 조사 후 체중 감량과 탈수 방지 하기 위해 영양/수분 젤으로 마우스를 보충.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61875/61875fig01.jpg"> 그림 1: 다양한 사전 컨디셔닝 설정을 보여주는 이미지입니다. (A)감마선(Cesium-137)을 이용한 파이케이지 총 신체 조사 설정): 방사선 빔은 y축 방향(수평 방사선)에서 조사자의 뒤쪽에서 나온다. (B)마우스 케이지 엑스레이를 이용한 마우스 케이지 총 신체 조사 설정: 마우스 케이지가 반사 챔버에 배치된다. 방사선 빔은 원뿔 (수직 방사선)의 모양으로 조사자의 상단에서 온다. 방사선 소스에서 케이지까지의 거리는 X선 조사기의 530mm.(C) 조절 가능한 트레이입니다: 이 설정은 X-ray를 사용하여 부분적으로 차폐된 조사에 사용됩니다. 방사선 빔은 원뿔 (수직 방사선)의 모양으로 조사자의 상단에서 온다. 방사선 소스에서 트레이까지의 거리는 373mm이고 반경은 250mm(D) 흉부 차폐: 마취마우스가 트레이위에 놓입니다. 마우스는 팔과 다리가 완전히 확장된 척추 위치에서 서로 반전됩니다. 리드 쉴드의 하부는 시피스테넘 뼈와 상단과 흉선과 정렬됩니다. (E)복부 차폐: 마취마우스는 탄문과 다이어프램 아래의 상부 엔드와 정렬된 납 쉴드의 하부 끝을 가진 흉부 차폐 셋업에서와 같이 배치된다. (F)감마선(세슘-137)을 이용한 헤드 차폐 조사 설정: 마취된 마우스의 앞발포진이 아래로 테이핑되고 마우스는 원추형 제지제에 배치됩니다. 검은 색 납 쉴드(표시된 표시)가 마우스의 머리와 귀를 덮습니다. 방사선 빔은 Y축(수평 방사선)의 방향으로 조사자의 뒤쪽에서 나온다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61875/61875fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 받는 쥐의 사전 조정 (선택 사항)
<ol><li>총 신체 조사
	<ol>
<li>수신자 마우스를 균일하게 얇게 썬 파이 케이지 또는 계산된 반경 내의 반사 챔버에 마우스 케이지를 배치하여 동일한 조사 용량을 받는 경우; 그러나, 파이 케이지 당 최대 8 마우스와 마우스 케이지 당 5 마우스는 균일 한 조사를 보장하는 것이 좋습니다(그림 1A, B).</li>
		<li>완전한 골수 절제술을 달성하기 위해, 수령마우스가 4-24 h 간격으로 분리된 2개의 5.5 Gy 분획에서 11Gy의 총 방사선 량을 수신하도록 합니다. 참고: 분수 사이의 4시간 간격을 구현하여 최적의 이식을 얻을 수 있지만, 이는 24h 간격으로 확장될 수 있으며, 이는 노동 및/또는 조사자가 사용할 수 없을 때 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>부분적으로 차폐된 조사
	<ol>
<li>케타민(80-100 mg/kg)과 자일라진(5-10 mg/kg)의 인계 주사로 받는 마우스를 마취시킵니다. 마우스 이동의 구속은 차폐 과정에서 표적 기관의 균일한 조사와 효과적인 보호를 보장하는 데 중요합니다.</li>
		<li>흉부 및 복부 차폐의 경우 X 선 조사자의 방사선 빔을 마우스로 수직으로 방향을 지정합니다(도1C).<ol>
<li>마취된 마우스를 평평한 접시에 배치하여 위에서 방사선 원을 중심으로 합니다. 마우스를 팔과 다리가 완전히 확장한 척추 위치에 서로 반전된 마우스를 놓습니다(그림1D, E). 참고: X선 조사시설(X선 조사시설)은 이 실험을 위해 한 번에 두 마리의 마우스를 균일한 조사를 허용하는 효과적인 반경 내에 배치할 수 있도록 합니다. 유효 반경은 방사선 원과 트레이 사이의 거리에 따라 계산되지만, 동시에 조사 할 수있는 동물의 수는 특정 조사에 따라 달라집니다.</li>
			<li>마우스의 발을 테이프를 사용하여 접시에 고정하여 마우스가 조사 절차 중에 고정되도록 합니다. 보호가 필요한 영역을 커버하도록 리드 차폐를 배치합니다.</li>
			<li>흉부 차폐의 경우 마우스의 xiphisternum 뼈에서 흉선까지의 길이를 측정하고 조사 소스로부터 충분한 보호를 제공하는 두께를 계산하여 납 보호막을 준비하십시오. 아래쪽 끝이 xiphisternum 골격과 정렬되도록 리드 차폐를 배치합니다. 리드 장벽의 상부 끝은 흉선(그림 1D)근처에 맞습니다.</li>
			<li>복부 차폐의 경우 마우스의 항문에서 다이어프램까지의 길이를 측정하고 조사 소스로부터 충분한 보호를 제공하는 두께를 계산하여 리드 쉴드를 준비합니다. 아래쪽 끝이 항문과 정렬되도록 리드 차폐를 배치합니다. 리드 쉴드의 상부 끝이 다이어프램(도1E)아래에 맞습니다. 참고: 코호트 들 사이에서 일관되는 납 방패를 국소화하는 것은 마우스의 크기에 관한 약간 변이를 감소시킬 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>헤드 차폐의 경우 세슘 세슘 세디에이터의 방사선 빔을 마우스로 수평으로 방향을 지정합니다.<ol>
<li>마취 된 마우스의 앞발을 복부에 조심스럽게 테이프로 테이프로 두습니다. 이것은 무기가 조사의 전체 복용량을 얻고 방패에 의해 커버되지 않습니다 보장합니다.</li>
			<li>헤드 차폐의 경우 마우스를 리드 쉴드 내부에 맞는 원내 억제제에 넣습니다. 마우스가 원물 억제제 내부에 있으면 구속제는 리드 쉴드 내의 슬롯에 밀어 넣습니다(도1F). 리드 쉴드는 마우스의 머리와 귀(~3.2cm)를 완전히 가려야 하며, 마우스의 나머지 시체는 조사를 위해 노출되어야 합니다. 방패 내부의 구속제의 위치는 방패 내부 또는 외부로 더 슬라이딩하여 다른 크기의 동물에 맞게 조정할 수 있습니다.</li>
			<li>조사를 위해 소스에 수직으로 마우스를 조사사 내부에 배치합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>4-24h 간격으로 분리된 조사(총 투여량 11Gy)에 마우스를 노출시한다.</li>
		<li>각 조사 분수 후, 저체온증을 방지하고 마취에서 회복에 도움이 되는 가열 된 매트 또는 붉은 열 램프 아래에 마취 마우스와 케이지를 배치합니다. 참고: 열을 피할 수 없기 때문에 램프를 사용할 때 마취 마우스를 과열하지 않도록 주의해야 합니다. 전술한 바와 같이, 동물의 위치와 납 방패의 두께는 조사자의 특정 특징(빔의 방사선 유형/방향 등)에 기초한 연구마다 다를 수 있다. 연구원은 그에 따라 그들의 실험을 조정 해야 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 뼈 격리
참고: 이상적으로, 기증자 마우스와 수령마우스는 나이에 유사해야 하고, 8-12 주 안에. 적어도 3개의 마우스를 기증자로 사용하는 것이 바람직하다(단일 기증자가 아닌) 이질성을 최소화하는 것이 바람직하다(동일한 유전자형을 가진 마우스를 사용하는 경우에도). 대략, 4천만 개의 분금되지 않은 골수 세포는 단일 마우스의 6개의 뼈 (2개의 대퇴골, 2개의 tibias 및 2개의 상완골)에서 얻을 수 있습니다. 각 수령마우스에 5백만 개의 골수 세포를 이식하면 전형적으로 이식을 보장합니다.
<ol><li>마취 없이 자궁 경부 탈구에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 각 마우스를 흡수 패드에 놓습니다.</li>
	<li>70% 에탄올 스프레이를 사용하여 피부를 소독합니다.</li>
	<li>흉곽 아래 피부에 작은 횡방향 컷을 만들고 절개 의 양쪽에 피부를 단단히 잡고 머리와 발을 향해 반대 방향으로 찢어. 모든 팔다리에서 피부를 벗겨냅니다.</li>
	<li>어깨와 팔꿈치 관절을 잘라, 상미를 얻기 위해 김스 와이프의 도움으로 부착 된 근육과 결합 조직을 제거합니다.</li>
	<li>대퇴골과 엉덩이 뼈 사이에 엉덩이 관절을 조심스럽게 탈바니다. 무딘 가위를 사용하여 대퇴골 머리를 따라 자르고 다리를 분리하십시오. 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 무릎 관절을 잘라 조심스럽게 대퇴골과 경골을 수확하는 김와이프의 도움으로 부착 된 근육과 결합 조직을 제거합니다. 참고: 이 단계에서 뼈 에피피시스를 그대로 유지하기 위해 특별한 주의를 기울이십시오. 불임의 손실로 인해 부러진 뼈를 버리십시오. 엉덩이 뼈와 척추 뼈는 대퇴골, 경골 및 상완골 이외에 수집 될 수 있습니다. 척추 뼈를 수집하기 위해 박격포와 유봉을 사용하여 뼈를 조각으로 분쇄하고 골수 세포를 수확할 수 있습니다.</li>
	<li>동일한 유전자형의 마우스로부터 분리된 뼈를 20mL 얼음-차가운 멸균 PBS를 포함하는 해당 50mL 원추형 튜브에 넣고 추가 사용이 이루어질 때까지 얼음 위에 보관하십시오. 일치하는 유전자형으로 뼈를 튜브에 올바르게 배치하려면 특별한주의를 기울이십시오.</li>
	<li>각 마우스 사이에 각 기증자 동물 변경 장갑에 대한 위의 단계를 반복합니다. 또한 각 마우스 사이에 70 %의 에탄올이있는 깨끗한 가위 및 기타 악기.</li>
</ol>4. 골수 세포 격리
참고: 생물 안전 클래스 II 캐비닛에서 다음 단계를 수행합니다.
<ol><li>튜브 세트 준비: 18G 바늘을 사용하여 멸균 0.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브의 바닥에 작은 구멍을 만들고 바닥에 100 μL의 얼음 냉멸 PBS를 포함하는 멸균 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브에 넣습니다. 참고: 6개의 뼈만이 0.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 들어갈 수 있으므로 모든 뼈를 동시에 처리하기에 충분한 튜브 세트를 준비하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>PBS를 흡인시키고 격리된 뼈를 멸균 100mm 세포 배양 접시에 옮기. 미세 한 집게를 사용하여 각 뼈를 잡고, 조심스럽게 오토 클레이브에서 살균 된 작은 가위를 사용하여 각 끝에서 표피를 잘라. 절단 된 뼈를 준비 된 튜브 세트에 놓습니다.</li>
	<li>4°C에서 35s의 경우 튜브를 10,000 x g로 원심분리합니다.</li>
	<li>원심 분리 후 골수가 뼈에서 성공적으로 제거되었는지 확인합니다. 뼈는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브의 바닥에 상대적으로 큰 빨간 펠릿흰색과 반투명하게 나타나야 한다. 0.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브를 폐기하십시오. 참고: 육안 검사가 1.5mL 튜브 의 바닥에서 골수를 감지하지 못하면 뼈를 다시 자르고 4.3 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>1mL의 얼음-감기 PBS에서 골수를 다시 중단한 다음 동일한 유전자형에서 일치하는 50mL 원추형 튜브로 세포 현탁액을 전달합니다.</li>
	<li>10mL 주사기10회로 18G 바늘을 통과하여 세포를 분리한다.</li>
	<li>70 μm 세포 여과기를 통해 단일 셀 서스펜션을 필터링합니다. 10mL의 최종 부피에 얼음 차가운 PBS를 추가하고 파이펫 보조제의 부드러운 사용을 통해 세포를 다시 중단합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 310 x g의 원심분리기.</li>
	<li>수퍼내티드를 흡인하고 10mL의 혈청 없는 RPMI 미디어로 셀 펠릿을 재보페한다. 셀 계수에 대한 이 물질의 30 μL을 예비하십시오.</li>
	<li>세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 결정하고 이식에 필요한 세포 현탁액의 양을 계산합니다. 100% BMT의 예를 들어, 각 받는 사람 마우스에 대해 5 x 106 골수 세포가 필요합니다. 참고: 경쟁 BMT의 경우, 기증자 세포의 혼합물(예를 들어, CD45.2+)및 경쟁 세포(예: CD45.1+)의혼합물을 포함하는 총 5 x 106 골수 세포를 준비한다. 여분의 골수 세포를 준비하는 것은 매우 좋습니다. 예를 들어, 실험 군당 10명의 수신자 마우스가 있는 경우, 우리는 전형적으로 12명의 수령인 마우스를 위한 충분한 세포를 준비합니다.</li>
	<li>계산된 셀 서스펜션의 볼륨을 새로운 50mL 원문 튜브로 옮기다. 4°C에서 10분 동안 310 x g의 원심분리기.</li>
	<li>상체를 흡인하고 적절한 세포 밀도 및 부피를 달성하기 위해 세럼이 없는 RPMI 배지의 계산된 양을 사용하여 세포를 재분리한다. 일반적으로, 200 μL은 레트로 궤도 주입을 위한 최적 부피이다.</li>
</ol>5. 조사 된 마우스에 골수 세포의 이식
<ol><li>5%의 이소플루란으로 받는 마우스를 마취시화합니다.</li>
	<li>마우스는 마취되는 동안, 인슐린 주사기를 가진 28-30 G 바늘을 사용하여 골수 세포의 200 μL을 레트로 궤도 정맥에 천천히 주입합니다.<ol>
<li>대안적으로, 꼬리 정맥 정맥 내 주입 및 대퇴정맥 주사에 의해 기증자 세포의 전달을 수행, 각각 0.2 mL 및 25 μL의 최대 부피와.</li>
	</ol>
</li>
	<li>일단 세포가 주입되면, 통증 완화를 위해 눈 표면에 프로파라카인 함유 안약방울한 방울을 놓습니다. 동물은 의식을 되찾을 수 있습니다.</li>
</ol>6. 골수 세포의 이식을 비조건 마우스로 이식
<ol><li>5%의 이소플루란을 흡입하여 받는 마우스를 마취시한다.</li>
	<li>28-30 G 인슐린 주사기를 가진 비 조사 받는 마우스로 유전자형 레트로 궤도에서 5 x 106 의 분별되지 않은 골수 세포를 주입하십시오.</li>
	<li>3일 연속 6.1 및 6.2를 반복하여, 수취인 마우스는 총 1.5 x 10 7골수세포로 이식된다. 참고: 사전 컨디셔닝 절차가 없는 입양 BMT는 3일 연속 골수 이식이 필요하기 때문에 각 주사에 대해 눈을 번갈아 가려고 시도해야 합니다.</li>
	<li>주사 후, 영향을받는 눈에 프로 파라카인 함유 점안액의 방울을 투여.</li>
</ol>

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클로날 조혈의 연구를 위해, 우리는 BMT의 세 가지 방법을 설명: 총 몸 조사와 BMT, 부분 차폐와 조사와 BMT, 그리고 더 사전 컨디셔닝을 포함 덜 일반적으로 사용되는 BMT 방법 (입양 BMT). 이 방법은 심혈관 질병에 대한 클로날 혈토포이의 영향을 평가하기 위해 사용되었습니다. 연구원은 그들의 연구 결과의 특정 목적에 맞게 이 방법을 그에 따라 수정할 수 있습니다.
클로날 조혈 모델 클로날 조혈은 돌연변이 조혈 세포가 야생 형 세포와 경쟁하고 시간이 지남에 따라 복제 우세를 얻는 현상입니다. 이 경쟁의 모형을 만들기 위하여는, 마우스는 유전적으로 다른 세포의 혼합물로 구성된 골수를 관리될 수 있습니다. 일반적으로, 이 혼합물은 형광 태그 또는 다른 범류 세포 마커 (즉, CD45.1 및 CD45.2)로 표지된 돌연변이 및 야생 형 세포를 포함할 것이다. 예를 들어 Tet2-매개CH를 모방한 모델을 만들 때, 우리는 ...

클로날 조혈(CH)은 노인 개인에서 자주 관찰되는 상태이며,유전돌연변이를운반하는 확장된 조혈 줄기 및 선조세포(HSPC) 클론의 결과로 발생한다. 그것은 50의 나이에 의해, 대부분의 개별은 각 HSPC2에있는 5개의 엑소닉 돌연변이의 평균을 취득할 것이라는 점을 건의되었습니다, 그러나 이 돌연변이의 대부분은 개별에 거의 또는 전혀 현상상 결과를 초래할 것입니다. 그러나, 우연히 이러한 돌연변이 중 하나가 HSPC에 경쟁 우위를 부여하는 경우-이러한 확산을 촉진 하 여, 자기 갱신, 생존, 또는 이들의 일부 조합-이 다른 HSPC에 비해 돌연변이 클론의 우대 확장으로 이어질 수 있습니다. 그 결과, 돌연변이는 돌연변이된 HSPC가 성숙한 혈액 세포를 초래하기 때문에 조혈 계통을 통해 점점 더 퍼질 것이고, 말초 혈액 내의 돌연변이 된 세포의 뚜렷한 인구로 이끌어 냅니다. 수십 개의 상이한 후보 운전자 유전자에서 돌연변이가 조혈 시스템 내의 클로날 이벤트와 연관되어 있지만, 이들 중 DNA 메틸트랜스퍼라제 3알파(DNMT3A)와1011개의 전좌2(TET2)의돌연변이가 가장 널리 퍼진3이다. 몇몇 역학 연구는 이 유전 돌연변이를 전송하는 개별이 심장 혈관 질병 (CVD), 치기 및 모든 인과 사망률3,4,5,6,7의현저하게 더 높은 리스크가 있다는 것을것을을 발견했습니다. 이 연구 결과는 CH와 CVD와 치기의 증가한 부각 사이 협회가 존재한다는 것을 확인했습니다, 우리는 이 관계가 인과 관계인지 또는 노화 과정과 공유 된 epi현상인지 모릅니다. 이 협회를 더 잘 이해하려면 CH의 인체 상태를 올바르게 재구성하는 적절한 동물 모델이 필요합니다.
몇몇 CH 동물 모형은 제브라피쉬, 마우스 및 비인간 영장류를사용하여 우리 그룹 및 그 외에 의해 설치되었습니다8,9,10, 11,12,13,14. 이 모형은 수시로 유전자 변형된 세포의 이식에 의하여 조혈 재구성 방법을, 때때로 Cre-lox 재조합 또는 CRISPR 시스템을 사용하여 이용합니다. 이 접근은 질병 발달에 기여하는 방법을 평가하기 위하여 조혈 세포에 있는 특정 유전자 돌연변이의 분석을 허용합니다. 또한, 이러한 모델은 종종 정상 또는 야생 형 세포에서 돌연변이 세포의 효과를 구별하기 위해 자생 또는 리포터 세포를 사용합니다. 많은 경우에, 사전 조절 식이요법은 성공적으로 기증자 조혈 줄기 세포를 이식하는 데 필요합니다.
현재, 수취인 마우스에 골수의 이식은 두 가지 주요 범주로 나눌 수 있습니다: 1) 골수 조절 및 2) 비조건 이식. 골수성 컨디셔닝은 두 가지 방법 중 하나에 의해 달성 될 수있다, 즉, 총 신체 조사 (TBI) 또는 화학 요법(15. TBI는 수신자에게 감마 또는 X선 조사의 치명적인 복용량을 복종하여 급속하게 분할하는 세포 내에서 DNA 나누기 또는 교차 링크를 생성하여 돌이킬 수 없는16을렌더링하여 수행됩니다. Busulfan과 사이클로포스파미드는 조혈 틈새 시장을 방해하고 유사하게 세포를 급속하게 분할하는 DNA 손상을 일으키는 두 개의 일반적으로 사용되는 화학요법 약물입니다. 골수성 사전 조절의 결과는 조혈 세포의 세포, 수령인의 조혈 시스템을 파괴. 이 전략은 기증자 HSPC의 성공적인 이식을 허용할 뿐만 아니라 수령인의 면역 체계를 억제하여 이식 거부를 방지할 수 있습니다. 그러나, 골수성 전조는 조직 및 장기 및 그들의 상주 면역 세포에 손상 과 같은 가혹한 부작용을 가지고 있고 토착 골수 틈새 시장17의파괴. 따라서, 이러한 바람직하지 않은 부작용을 극복하기 위해 대안 적 방법이 제안되었습니다, 특히 관심기관의 손상에 관한. 이러한 방법은 비조건마우스9,17에받는 마우스와 입양 BMT의 차폐 조사를 포함한다. 납 장벽의 배치에 의해 조사에서 흉부, 복강, 머리 또는 다른 영역을 차폐하는 것은 조사의 손상 효과로부터 보호 관심의 조직을 유지하고 거주 면역 세포 인구를 유지합니다. 한편, 비조건 마우스에 대한 HSPC의 BMT는 토착 조혈 틈새 시장을 보존하기 때문에 추가적인 이점이 있다. 이 원고에서, 우리는 마우스에 있는 몇몇 이식 식이요법 후에 HSPC 이식의 프로토콜 그리고 결과를 기술합니다, 특히 TBI 마우스에 HSPC의 납품, 방사선으로부터 부분적으로 차폐된 마우스에, 및 비 조건화마우스에. 전반적인 목표는 연구원이 CH와 심장 혈관 질병의 설정에 있는 실험 결과에 어떻게 영향을 미치는지 뿐만 아니라 각 방법의 다른 생리적인 효력을 이해하는 것을 돕는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.5ml 마이크로 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>1.5ml 마이크로 원심분리기</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>1/2cc LO-DOSE INSULIN SYRINGE</td><td>EXELINT</td><td>26028</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 prfof)</td><td>Fisher chemical</td><td>200559</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BD 1mL 투베르쿨린 주사기 25G 5/8 인치 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide Needle 18G (1.22mm X 25mm)</td><td>Becton Dickinson</td><td>395195</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Cesium-137 Irradiator</td><td>J. L. Shepherd&nbsp;</td><td>Mark IV</td><td>장비</td></tr><tr><td>DietGel 76A</td><td>Clear H2O</td><td>70-01-5022</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Falcon 100mm TC 처리 세포 배양 접시</td><td>생명 과학</td><td>353003</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL 원추형 원심 분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Fisherbrand 멸균 세포 여과기, 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>경화 정밀 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>Isothesia (Isoflurane) 용액</td><td>Henry Schein</td><td>29404</td><td>용액</td></tr><tr><td></td><td>Ketamine Zoetis</td><td>043-304</td><td>주입</td></tr><tr><td>Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼</td><td>Kimtech Science</td><td>KCC34155</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>PBS pH7.4 (1X)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>솔루션</td></tr><tr><td>RadDisk &ndash; 설치류 조사기 디스크</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td>일반 공급</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Sulfamethoxazole 및 Trimethoprim</td><td>TEVA</td><td>0703-9526-01</td><td>주입</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Akorn</td><td>139-236</td><td>주입</td></tr><tr><td>X선 조사기</td><td>Rad source</td><td>RS-2000</td><td>장비</td></tr></tbody></table>

클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

클론 조혈은 조혈 줄기 및 선조 세포 (HSPC)에서 체세포 돌연변이의 축적에서 유래 널리 퍼지는 연령 관련 상태입니다. 드라이버 유전자에 있는 돌연변이, 그 세포 적합성을 부여하는, 점점 체세포 돌연변이를 품고 자손 백혈구를 초래하는 HSPC 클론확장의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 클로날 조혈은 심장 질환, 뇌졸중 및 사망률과 관련이 있기 때문에 이러한 프로세스를 모델링하는 실험 시스템의 개발은 이 새로운 위험 요소의 밑에 있는 메커니즘을 이해하는 데 핵심적입니다. 총 신체 조사 (TBI)와 같은 마우스에서 골수 이식 과 관련된 골수 이식 절차는 일반적으로 심혈관 질환에서 면역 세포의 역할을 연구하기 위해 사용됩니다. 그러나, 골수 틈새 시장 및 관심의 다른 사이트에 동시 손상, 심장과 두뇌 등, 이러한 절차와 피할 수. 따라서, 우리의 실험실은 TBI에 기인한 가능한 부작용을 최소화하거나 피하기 위하여 2개의 다른 방법을 개발했습니다: 1) 조사 차폐를 가진 골수 이식 및 2) 비 조건화 마우스에 입양 BMT. 보호 된 기관에서, 지역 환경은 상주 면역 세포의 기능이 흔들리지 않는 동안 클로날 혈종의 분석을 허용 보존된다. 대조적으로, 비조건 마우스에 대한 채택 BMT는 장기와 조혈 틈새 시장이 모두 보존된다는 추가적인 이점이 있다. 여기에서, 우리는 3개의 다른 조혈 세포 재구성 접근을 비교하고 심장 혈관 질병에 있는 클론 조혈의 연구 결과를 위한 그들의 강점 그리고 한계를 토론합니다.

기증자 세포 이식에 대한 3개의 BMT/사전 컨디셔닝 방법의 효력을 비교하기 위하여는, 말초 혈액 및 심장 조직에 있는 기증자 세포의 분획은 BMT 후 1 달에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었습니다. 분리된 세포는 백혈구의 상이한 하위 집합을 확인하기 위해 특정 백혈구 마커를 위해 염색하였다. 이러한 실험에서,야생형(WT) C57BL/6(CD45.2) 기증자 골수 세포는 WT B6로 전달되었다. SJL-Ptprc는 수신자의세포로부터 기증자 세포를 구별하기 위해 Prpcb/BoyJ(CD45.1) 받는 마우스를 구별한다. 사용된 유동 세포측정제 게이팅 전략은 이전에 왕외9에 의해 설명되어 있다.
총 신체 조사(TBI) 처리군은 총 치명적인 방사선량 11Gy의 총 치명적인 방사선...

우리는 골수 이식의 세 가지 방법을 설명 (BMT): 총 몸 조사와 BMT, 차폐 조사와 BMT, 그리고 마우스 모델에서 클로날 조혈의 연구를위한 사전 컨디셔닝 (입양 BMT)와 BMT 방법.

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

우리의 프로토콜은 연구원이 3개의 다른 골수 이식 방법의 생리적인 효력 및 복제 조혈 조정에 있는 실험 결과에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것을 도울 것입니다. 총 신체 방사선 골수 이식은 심혈관 장기에 부정적인 영향을 미치고 질병 병인을 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 우리의 실험실 최소화 하거나 가능한 부작용을 방지 하기 위해 두 가지 다른 방법을 개발 했다.절차를 시연하는 것은 대학원생 은비 파크와 박사 후 동료인 메건 에반스(Megan Evans)가 내 실험실에서 흉부와 복부 차폐를 위해 조정 가능한 트레이와 엑스레이 조사기를 올바른 거리에 배치하여 균일한 조사를 달성합니다. 그리고 마취된 마우스를 평평한 led 플레이트에 놓고, 양봉포 위치에 서로 반전한다. 테이프로 플레이트에 발을 고정하고, 아래쪽 끝이 시피스테넘 뼈와 정렬되도록 led 차폐를 배치하고 리드 쉴드의 상단은 흉선 근처에 앉아 있다.차폐 후, 마우스를 조사관에 넣고 동물을 4~24시간 간격으로 분리한 조사의 2개, 5.5회색 분획에 노출시한다. 머리 차폐의 경우 마우스의 네 발을 복부에 조심스럽게 테이프로 테이프로 두세요. 마우스를 원상 억제제에 넣고 제지기를 리드 쉴드 내슬롯에 밀어 넣어 마우스의 머리와 귀가 완전히 덮어 마우스의 나머지 신체가 방사선에 노출되도록 합니다.차폐 후 마우스를 세디에이터에 넣고 동물을 노출시키고, 4~24시간 간격으로 분리된 방사선의 5.5 회색 분획에 노출한다. 각 방사선 처리 후에, 완전히 복구될 때까지 감시와 가열된 매트에 마취한 마우스를 두는. 뼈를 분리하려면 기증자 마우스의 피부를 70%에탄올로 소독하고 갈비뼈 아래에 작은 횡방향 피부 절개를 만듭니다.절개 의 양쪽에 피부를 단단히 잡고, 머리와 발을 향해 반대 방향으로 찢어 모든 사지에서 피부를 껍질. 어깨와 팔꿈치 관절을 잘라, 그리고 상미에서 부착 된 근육과 결합 조직을 제거하기 위해 실험실 닦아를 사용합니다. 대퇴골과 엉덩이 뼈 사이에 관절을 조심스럽게 탈바니다.그리고 무딘 가위를 사용하여 대퇴머리를 따라 다리를 분리합니다. 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 무릎 관절을 잘라냅니다. 그리고 실험실 와이프를 사용하여 부착 된 근육과 뼈에서 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오.그런 다음 동일한 유전자형의 마우스에서 뼈를 얼음에 얼음 냉멸 균 PBS 20 밀리리터를 포함하는 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 끌어당깁니다. 골수 세포를 바이오 안전 클래스 2개의 캐비닛에 분리하려면 18 게이지 바늘을 사용하여 멸균 500 마이크로리터 마이크로 튜브의 바닥에 작은 구멍을 만듭니다. 그리고 튜브를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 100 마이크로리터의 얼음 냉멸 균 PBS를 함유한다.모든 튜브가 준비되면, 분리된 뼈를 포함하는 튜브에서 PBS를 제거하고 뼈를 멸균 100mm 세포 배양 접시에 옮기십시오. 미세 한 집게와 작은 가위를 사용하여 각 뼈의 끝에서 epiphysis를 조심스럽게 제거하고 각 500 마이크로 리터 튜브에 최대 6 개의 뼈를 배치하십시오. 모든 뼈가 절단되면 골수 세포를 원심분리로 추출합니다.모든 골수 내용이 제거된 경우, 뼈는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 상대적으로 큰 빨간 펠릿으로 흰색과 반투명으로 나타나야 한다. 골수 세포 이식의 경우, 혈청 이없는 RPMI 매체에서 격리된 골수 세포를 희석시키고, 세포 현탁액의 200마이크로리터를 마우스당 0.5 밀리리터 인슐린 주사기1개에 적재하여 주입한다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 천천히 각 마취 받는 사람의 복고풍 궤도 정맥에 세포의 전체 볼륨을 주입한다.그런 다음 통증 완화를 위해 프로파라카인 한 방울을 눈에 놓습니다. 그리고 모니터링되는 동안 마우스가 의식을 회복 할 수 있습니다. 기증자 세포 이식에 대한 세 가지 BMT 사전 조절 방법의 효과를 비교합니다.말초 혈액 및 심장 조직에 있는 기증자 세포의 분획은 BMT 포스트 1 달에 혈류 세포측정에 의해 분석되었습니다. 본 대표적인 분석에서, 총 체내 조사를 받은 수신자 마우스의 말초 혈액에서, 단핵구, 호중구 및 B 세포는 기증자 골수 유래 세포의 자손에 의해 크게 절단되고 대체되었다. 또한, 상주 수혜자 심장 단세포 및 호중구 인구는 거의 완전히 기증자 유래 세포에 의해 대체되었다.부분적으로 차폐된 조사 단에서, 기증자 유래 심장 면역 세포 교체는 겸손했습니다. 수용자 마우스 골수 세포는 총 신체 조사를 받은 마우스에 비해 말초 혈액 재구성의 낮은 수준에 기여할 가능성이 있다. BMT 사전 조절이 없는 그룹에서, 기증자 유래 세포는 BMT 이후 4주 동안 수신자 마우스의 말초 혈액및 심혼에서 검출되었다.또한, Tet2 결핍 기증자 세포는 시간이 지남에 따라 점차 확장. 비교에서, 야생 형 기증자 세포로 이식 된 받는 사람 마우스는 기증자 세포의 최소한의 복제 확장을 보였다. 이러한 실험 모델의 최적화는 심장 대사 질환및 암과 같은 모든 원인에 기여하는 클론 조혈 드라이버 유전자의 보다 엄격한 연구를 가능하게 할 것입니다.우리는 우리의 프로토콜이 연구원이 심혈관 질병 및 그밖 질병 국가에 어떻게 기여하는지 조사하기 위하여 클로날 혈토포이스를 공부하는 것을 허용할 것이라는 점을 희망합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

클론 조혈을 연구하기 위한 생쥐의 골수 이식 절차

이 비디오는 동종 조혈모세포와 GvHD 유도 비장 동종성 T 림프구를 사용하여 치사량에 방사선 조사를 받은 마우스에서 장 이식편대숙주병(GvHD)의 유도를 보여줍니다. 이 프로토콜은 중증 급성 장 GvHD 모델을 확립하여 질병의 메커니즘을 이해하고 혁신적인 치료 옵션을 개발하는 데 도움이 됩니다.

동종 골수 및 비장 세포 이식을 통한 마우스 모델에서 이식편 대 숙주 질환 유도

이 프로토콜은 마우스를 희생하지 않고 대퇴골수(BM)를 연속적으로 샘플링하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 시간 경과에 따른 마우스의 BM 구성에 대한 종단 연구를 용이하게 하고 생체 외 및 이식 연구를 위해 BM 내 세포에 대한 직렬 액세스를 제공합니다.

라이브 쥐의 대퇴부 골수 흡인

조혈 줄기 및 전구 세포의 표시 조합 5 형광 단백질은 재생 중에 골수 조혈 아키텍처에 대한 통찰력을 제공하는 공 초점과 두 광자 현미경을 통해 생체 클론 추적에 있습니다. 이 방법은 이식 다음 시간의 광범위한 기간에 대한 손상 조직의 스펙트럼으로 구분 HSPCs 유래 세포의 비 침습적 운명 매핑 할 수 있습니다.

공 초점 및 다중 광자 현미경을 사용하여 다섯 형광 단백질에 의해 표시됨 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 클론 추적에서

우리는 busulfan conditioning을 통해 방사선 조사가 없는 상태에서 녹색 형광 단백질을 유비쿼터스하게 발현하는 기증자 마우스의 골수 세포로 대체하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 중추 신경계의 골수 세포 축적을 연구하는 데 유용합니다.

마우스에서의 높은 수준의 안정적인 골수 키메라를 생성하기위한 에이전트로서 골수 억제 술판

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)는 calvarium의 유도 및 조 혈 모 세포의 골 수 (BM) 틈새로 engraftment 연구 유전 동물 모델에 적용 됩니다.

Intravital 형광 현미경 검사 법 (IVFM)를 결합 하 여 유전자 모델 골 틈새에 조 혈 모 세포의 Engraftment 역학을 공부 하

이 프로토콜은 세포 분류에 의한 줄기세포의 사전 정제 없이 조혈 줄기세포/전구 세포 기능을 연구하기 위해 경쟁력 있는 마우스 골수 이식 실험을 설정하기 위한 단계별 지침을 제공합니다.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

이 원고는 형질도입-이식 마우스 모델을 확립하는 데 사용되는 방법론에 대한 설명을 제공합니다. 골수 이식을 수행할 때 피해야 할 기술적 오류에 대한 자세한 설명이 제공됩니다. 높은 바이러스 역가, transfection/transduction 및 방사선 조사의 중요성에 대한 명확한 이해를 얻어야 합니다.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

여기 우리 murine 배아 개발 하는 동안 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석을 위한 방법론을 제시. 우리는 내 피 세포 공동 문화 및 phenotypic 속성 및 단일 조 혈 일어나 engraftment 잠재력 하 이식 배아 대동맥-생식-mesonephros 지역에서 단일 셀의 인덱스 정렬 결합.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

우리는 유전자 조작된 조 혈 모 세포의 악성 잠재력을 평가 하기 위해 조 혈 모 세포 이식 (HSCT)의 사용을 설명 합니다. HSCT 소설 치료를 평가 하 형성 증후군 (MDS) 또는 백혈병 생쥐의 대형 코 호트 생성 뿐만 아니라 다양 한 악성 조 혈 모 세포에 vivo에서 평가 대 한 유용 합니다.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

이식편 대 숙주 질병은 동종 골수 이식 후에 중요한 합병증입니다. 수지상 세포는 이식편 대 숙주 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. 현재 논문은 이식편 대 숙주 질환및 이식편 대 백혈병 효과의 발달에 있는 수지상 세포의 역할을 조사하기 위하여 새로운 골수 이식 플랫폼을 기술합니다.

이식대 숙주 질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하는 골수 이식 플랫폼

이 프로토콜은 쥐 이종 이식 모델에서 유전자 편집 세포를 포함한 몇 가지 조혈 또는 백혈병 줄기 세포의 대퇴 내 주사를 설명하며, 이를 통해 세포의 빠르고 안전한 이식뿐만 아니라 골수의 연속 분석도 가능합니다.

살아있는 마우스를 사용한 간소화된 대퇴강 주사로 지속적인 골수 분석 가능

학습하세요 마우스 골수 이식의 세 가지 방법을 통해 클로날 조혈을 연구하는 기법을. 전신 조사, 차폐 조사, 무전처리 적응 이식법을 비교하여 심혈관 부작용을 최소화하고 실험 결과를 개선하는 프로토콜을 확인하세요.

클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

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