클로날 조혈을 연구하기 위해 마우스에 있는 골수 이식 절차

우리의 프로토콜은 연구원이 3개의 다른 골수 이식 방법의 생리적인 효력 및 복제 조혈 조정에 있는 실험 결과에 어떻게 영향을 미치는지 이해하는 것을 도울 것입니다. 총 신체 방사선 골수 이식은 심혈관 장기에 부정적인 영향을 미치고 질병 병인을 변화시킬 수 있습니다. 따라서, 우리의 실험실 최소화 하거나 가능한 부작용을 방지 하기 위해 두 가지 다른 방법을 개발 했다.

절차를 시연하는 것은 대학원생 은비 파크와 박사 후 동료인 메건 에반스(Megan Evans)가 내 실험실에서 흉부와 복부 차폐를 위해 조정 가능한 트레이와 엑스레이 조사기를 올바른 거리에 배치하여 균일한 조사를 달성합니다. 그리고 마취된 마우스를 평평한 led 플레이트에 놓고, 양봉포 위치에 서로 반전한다. 테이프로 플레이트에 발을 고정하고, 아래쪽 끝이 시피스테넘 뼈와 정렬되도록 led 차폐를 배치하고 리드 쉴드의 상단은 흉선 근처에 앉아 있다.

차폐 후, 마우스를 조사관에 넣고 동물을 4~24시간 간격으로 분리한 조사의 2개, 5.5회색 분획에 노출시한다. 머리 차폐의 경우 마우스의 네 발을 복부에 조심스럽게 테이프로 테이프로 두세요. 마우스를 원상 억제제에 넣고 제지기를 리드 쉴드 내슬롯에 밀어 넣어 마우스의 머리와 귀가 완전히 덮어 마우스의 나머지 신체가 방사선에 노출되도록 합니다.

차폐 후 마우스를 세디에이터에 넣고 동물을 노출시키고, 4~24시간 간격으로 분리된 방사선의 5.5 회색 분획에 노출한다. 각 방사선 처리 후에, 완전히 복구될 때까지 감시와 가열된 매트에 마취한 마우스를 두는. 뼈를 분리하려면 기증자 마우스의 피부를 70%에탄올로 소독하고 갈비뼈 아래에 작은 횡방향 피부 절개를 만듭니다.

절개 의 양쪽에 피부를 단단히 잡고, 머리와 발을 향해 반대 방향으로 찢어 모든 사지에서 피부를 껍질. 어깨와 팔꿈치 관절을 잘라, 그리고 상미에서 부착 된 근육과 결합 조직을 제거하기 위해 실험실 닦아를 사용합니다. 대퇴골과 엉덩이 뼈 사이에 관절을 조심스럽게 탈바니다.

그리고 무딘 가위를 사용하여 대퇴머리를 따라 다리를 분리합니다. 대퇴골과 경골을 분리하기 위해 무릎 관절을 잘라냅니다. 그리고 실험실 와이프를 사용하여 부착 된 근육과 뼈에서 결합 조직을 조심스럽게 제거하십시오.

그런 다음 동일한 유전자형의 마우스에서 뼈를 얼음에 얼음 냉멸 균 PBS 20 밀리리터를 포함하는 개별 50 밀리리터 원추형 튜브로 끌어당깁니다. 골수 세포를 바이오 안전 클래스 2개의 캐비닛에 분리하려면 18 게이지 바늘을 사용하여 멸균 500 마이크로리터 마이크로 튜브의 바닥에 작은 구멍을 만듭니다. 그리고 튜브를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 100 마이크로리터의 얼음 냉멸 균 PBS를 함유한다.

모든 튜브가 준비되면, 분리된 뼈를 포함하는 튜브에서 PBS를 제거하고 뼈를 멸균 100mm 세포 배양 접시에 옮기십시오. 미세 한 집게와 작은 가위를 사용하여 각 뼈의 끝에서 epiphysis를 조심스럽게 제거하고 각 500 마이크로 리터 튜브에 최대 6 개의 뼈를 배치하십시오. 모든 뼈가 절단되면 골수 세포를 원심분리로 추출합니다.

모든 골수 내용이 제거된 경우, 뼈는 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브의 바닥에 상대적으로 큰 빨간 펠릿으로 흰색과 반투명으로 나타나야 한다. 골수 세포 이식의 경우, 혈청 이없는 RPMI 매체에서 격리된 골수 세포를 희석시키고, 세포 현탁액의 200마이크로리터를 마우스당 0.5 밀리리터 인슐린 주사기1개에 적재하여 주입한다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 천천히 각 마취 받는 사람의 복고풍 궤도 정맥에 세포의 전체 볼륨을 주입한다.

그런 다음 통증 완화를 위해 프로파라카인 한 방울을 눈에 놓습니다. 그리고 모니터링되는 동안 마우스가 의식을 회복 할 수 있습니다. 기증자 세포 이식에 대한 세 가지 BMT 사전 조절 방법의 효과를 비교합니다.

말초 혈액 및 심장 조직에 있는 기증자 세포의 분획은 BMT 포스트 1 달에 혈류 세포측정에 의해 분석되었습니다. 본 대표적인 분석에서, 총 체내 조사를 받은 수신자 마우스의 말초 혈액에서, 단핵구, 호중구 및 B 세포는 기증자 골수 유래 세포의 자손에 의해 크게 절단되고 대체되었다. 또한, 상주 수혜자 심장 단세포 및 호중구 인구는 거의 완전히 기증자 유래 세포에 의해 대체되었다.

부분적으로 차폐된 조사 단에서, 기증자 유래 심장 면역 세포 교체는 겸손했습니다. 수용자 마우스 골수 세포는 총 신체 조사를 받은 마우스에 비해 말초 혈액 재구성의 낮은 수준에 기여할 가능성이 있다. BMT 사전 조절이 없는 그룹에서, 기증자 유래 세포는 BMT 이후 4주 동안 수신자 마우스의 말초 혈액및 심혼에서 검출되었다.

또한, Tet2 결핍 기증자 세포는 시간이 지남에 따라 점차 확장. 비교에서, 야생 형 기증자 세포로 이식 된 받는 사람 마우스는 기증자 세포의 최소한의 복제 확장을 보였다. 이러한 실험 모델의 최적화는 심장 대사 질환및 암과 같은 모든 원인에 기여하는 클론 조혈 드라이버 유전자의 보다 엄격한 연구를 가능하게 할 것입니다.

우리는 우리의 프로토콜이 연구원이 심혈관 질병 및 그밖 질병 국가에 어떻게 기여하는지 조사하기 위하여 클로날 혈토포이스를 공부하는 것을 허용할 것이라는 점을 희망합니다.