Name: 행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 학습하세요 성인 Drosophila melanogaster의 행동 중 전체 두뇌 화상 진찰 준비 방법을. 이 기술은 자극 반응 시 신경 활동을 실시간으로 관찰하여 행동과 뇌 기능의 상관관계를 규명하는 데 활용됩니다.

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우리는 하이디 밀러 - Mommerskamp 기술적 인 도움과 원고에 대한 유용한 의견에 대한 이브 멜리사 과티본자 아레발로 감사합니다. 프로토콜의 초기 버전은 랄프 그린스펀의 실험실에서 개발되었다. 이 작품은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원되었다, 특히 IGK에 FOR2705 (TP3) 보조금을 통해, 사이먼재단 (에이몬 – 414701) 및 뇌와 마음카블리 연구소 (보조금 번호 #2017-954) SA에 의해 수신.

모든 단계는 스테레오 현미경으로 수행됩니다.
1. 홀더 준비
<ol><li>홀더 'FlyholderVJove.stl'(보충 자료참조)을 3D 프린터로 인쇄하거나 온라인 서비스를 사용하여 인쇄하십시오(그림1A). SLS(나일론 PA12) 및 멀티젯 융합(PA12)은 모두 적합합니다.</li>
	<li>헤드 슬롯을 만듭니다.<ol>
<li>평평한 표면에 직사각형으로 끈적 끈적한 테이프 조각을 놓습니다. 약 5mm x 1cm의 슬라이스를 자른다. 모든홀더(도 1B)에서동일한 폭을 보장하기 위해 고정 병렬 블레이드(두 개의 메스 블레이드가 함께 붙어 있음)를 사용하여 테이프의 긴 면 중간에 목 슬롯(~400 x 400 μm)을 잘라냅니다.</li>
		<li>테이프를 아래쪽 홀더의 구멍의 평평한 측면에 놓습니다(그림 1C 및 그림 1D참조). 테이프는 구멍 주위의 집게 ~500 μm로 아래로 밀어 변형 될 수있다; 이렇게 하면 나중에 비행 움직임을 방해하는 것을 최소화할 수 있습니다.</li>
		<li>테이프와 홀더를 상단의 홀더를 검은색 매니큐어로 덮어 버퍼가 누출되는 것을 방지합니다. 검은 매니큐어는 현미경의 흥분 빛으로부터 비행의 눈을 보호합니다. 매니큐어는 홀더를 사용하기 전에 적어도 한 시간 건조하게하십시오.</li>
		<li>매니큐어가 건조되면 접착제가 플라이 헤드의 뒤쪽을 젖지 않도록 하기 위해 압연 조직을 사용하여 머리 슬롯에 ~1 μL의 그리스를 추가합니다(그림2A). 접착제가 달라붙는 것을 방지하는 슬롯 외부에 기름을 넣지 않도록 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>본문 슬롯을만듭니다(그림 2B).<ol>
<li>선택적으로, 미리 플라이의 몸을 배치하는 데 사용되는 테이프를 준비 (아래 참조). 그림 2B(상단)에 표시된 디자인을 사용하여 ~ 2cm 너비 테이프를 2개로 자르고 폭 1.5mm를 자른다. 어깨와 몸의 슬롯이 0.3mm 나오자. 홀더에 맞는지 확인합니다. 참고: 플라이 크기(특히 성별, 연령, 유전자형 또는 종)의 가변성은 테이프 디자인을 조정해야 할 필요가 있습니다. 머리가 중심이 좋지 않은 경향이 있는 경우, 목슬롯(그림 3)에V자형 테이프를 일시적으로 추가하는 것이 도움이 될 수 있다. 또한 목 슬롯 내부와 V 자형 테이프에 약간의 그리스를 적용합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 플라이 배치
참고 : 1 ~ 4 일 된 여성 파리는 여성의 머리가 더 크고 따라서 남성 머리보다 해부하기 쉽기 때문에 이상적이며, 젊은 파리는 부드러운 큐티클을 가지고 있습니다. 걷기 실험을 위해, 포도당을 포함하는 식염수를 사용하여 더 높은 circadian 활성(ZT0 또는 ZT11)의 시간과 실험을 일치시킴으로써 비행의 활성을 증가시킬 수 있다(예: 103 mM NaCl), 3 mM KCl, 5 mM TES, 8 mM trehalose 2 H2O, 10 mM 포도당, 26 mM NaHCO3,1 mM NaH2PO4,2.5 mM CaCl2·2H 2 O, 4 mM MgCl2·6 H2O), 최대 24 시간까지 의 질비를 배후하여 24시간까지 의 환경만, C8°시. 날개를 하루 이상 미리 클리핑하면 비행 시도를 줄이고 따라서 걷기 시합7,29,30의빈도를 증가시키는 데 도움이됩니다.
<ol><li>페트리 접시 나 파이펫 팁 박스 뚜껑을 얼음으로 채우고, 얼음 위에 실험실 조직을 놓고 홀더를 거꾸로 놓습니다.</li>
	<li>유리병을 튜브로 빨고 얼음에 불어 마비시키기 위해 얼음 위를 날아다갑니다(얼음이 얼음이 녹지 않도록 하여 얼음이 날아다니지 않도록 하십시오).</li>
	<li>비행이 이동을 중지하면, 그림 4 (왼쪽)에서와 같이 슬롯 내부의 목을 가진 홀더로 밀어 무딘 집게를 사용합니다. 눈은 슬롯의 측면에 대하여 동일한 위치에 있어야합니다(그림 4,중간). 필요한 경우 머리 위에 1 μL 그리스를 추가하여 접착제가 머리 뒤쪽에 도달하지 못하도록 (다음 단계 참조)를 제거하고 나중에 제거하십시오.</li>
	<li>이 단계와 다음 단계 동안 비행이 움직이지 않도록 조직과 얼음으로 몸을 덮으십시오(그림 4,오른쪽). 다리가 머리에 닿지 않도록 하는 또 다른 옵션은 머리 바로 아래에 테이프 조각을 사용하는 것입니다(그림 6참조).</li>
</ol>3. 머리 고정
<ol><li>헤드를 완전히 후방 뷰에서 ~20° 각도로 놓습니다(측면 축 주위, 그림 5A참조). 이것은 이미지에 깊이를 감소시키고 다른 쪽에서 앞다리를 자유롭게 움직이고 목의 스트레칭을 최소화하는 것 사이의 타협입니다.</li>
	<li>압연 조직(도5B)을사용하면 관심 있는 감각 영역(안테나, 프로보시스 및/또는 눈)을 더럽히는 것을 피하면서 머리에 UV 접착제를 넣습니다. 미각 실험을 위해 프로보시스를 꺼내 베이스에 접착제를 추가하여 움직임을 방지합니다. 미각 실험이 계획되지 않으면, 프로보시스는 머리로 밀착되어 움직임을 최소화하기 위해 접착제로 고정하는 것이 가장좋습니다(그림 6).</li>
	<li>5 s에 대 한 UV 빛으로 접착제를 치료. 머리 주변을 압연 조직으로 조심스럽게 청소하여 다리 및 / 또는 토양 감각 영역에 달라 붙을 수있는 남아있는 액체 접착제를 제거하십시오. 참고: 필요한 경우 접착제 접착력을 높이기 위해 사포로 테이프를 거칠게 할 수 있습니다.</li>
	<li>테이프의 얇은 스트립 또는 압연 조직을 사용하여 다리를 앞쪽으로 이동하십시오 (아직 없는 경우) 다음 단계로 손상되지 않습니다.</li>
</ol>4. 바디 위치 지정
참고: 이 단계는 신속하게 수행해야 합니다. 비행이 마취에서 회복하기 전에.
<ol><li>얼음 용기를 제거하고 홀더를 돌려보십시오. 티슈로 플라이 주위의 물을 제거합니다.</li>
	<li>바디 슬롯 테이프(1단계에서 생성됨)를 구멍 위에 놓고 플라이의 몸을 부드럽게 아래로 밀어 넣습니다(그림7). 목을 너무 많이 스트레칭하지 않도록주의하십시오.</li>
</ol>5. 구멍 밀봉
<ol><li>테이프로 남은 큰 구멍을 덮습니다.</li>
	<li>머리 뒤쪽과 목 부위에 ~1 μL의 그리스를 추가하여 접착제가 젖지 않도록 하십시오.</li>
	<li>압연 조직으로 테이프 의 주위에 와 흉부 (중추의 상부 등쪽 부분)에 UV 접착제를 페인트하여 고칠 수 있습니다. ~5s에 대한 UV 빛으로 접착제를 치료합니다. 참고: 비행의 건강에 큰 영향을 줄 수 있으므로 자외선 사용을 최소화하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>실험실 조직으로 조심스럽게 그리스와 치료되지 않은 접착제를 청소합니다.</li>
	<li>머리 위에 식염수 ~ 1 mL를 넣습니다. 집게로 기포를 밀어 넣습니다. 식염수 위에 덮개 슬립을 배치하고 홀더를 돌려 앞쪽에 식염수 에 대한 확인을 통해 누출을 찾습니다. 누출이 있는 경우 식염수를 제거하고 구멍을 수정합니다(접착제 를 더 넣거나 그리스를 더 추가하여). 참고: 필요한 경우 일시 중지하기에 좋은 시기가 될 수 있습니다. 플라이는 작은 티슈 또는 스티로폼 볼을 제공하여 도리깨를 방지하고 비행을 진정시킬 수 있습니다.</li>
</ol>6. 머리를 해부
참고: 다음 단계에 는 선명한 포셉을 사용합니다. 매우 미세한 집게는 무딘 집게가 머리 표피를 여는 것을 더 어렵게 만들고 비행의 머리 또는 두뇌에 추가 상해로 이끌어 낼 수 있기 때문에 중요합니다. 강한 배율은이 단계에서 도움이 될 수 있습니다. 이를 목표로 쌍안경 현미경의 안구를 30배 의 안구로 대체할 수 있습니다.
<ol><li>목 의 각 측면에 중앙 어두운 큐티큘러 삼각형의 기지에서 두 컷을 확인 (그림 8A에서십자가 참조).</li>
	<li>어두운 삼각형 주위를 잘라 큐티클의이 부분을 제거합니다.</li>
	<li>근육 16과 식도가 이동하는 뇌의 구멍은 이제 표시하고 리드미컬하게 움직여야합니다(비디오 1은 형광 근육이있는 비행에서이 리듬 움직임을 제공합니다). 조심스럽게 식도를 뚫지 않고 근육 16을 잘라이 지역의 상단을 꼬집습니다. 뇌의 리듬 운동이 멈춘 경우, 근육 16 가능성이 제거 되었다, 그러나, 운동은 때때로 일시 중지 하 고 나중에 다시 시작. 따라서 리듬 동작에주의를 기울이고 필요한 경우 이 단계를 다시 수행하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>나머지 표피를 작은 조각으로 자르고 조심스럽게 제거합니다. 큐티클을 너무 많이 당기지 않도록 하십시오. 대신 조직의 조각을 잘라 가위 한 쌍처럼 집게를 사용합니다. 하나는 어두운 삼각형이 전에 제거 된 내측 가장자리에서 시작하고 측면에 하나의 방법을 작동 할 수 있습니다. 참고 : 큐티클 조각이 존재하는 경우 지방 몸을 부드럽게 긁어 내는 데 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>집게로 잡아 서서히 꾸준히 당겨서 한 조각을 하나씩 제거합니다.</li>
</ol>

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<li>Andreoni, A., Davis, C. M. O., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+brain+chemistry+using+genetically+encoded+fluorescent+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Measuring brain chemistry using genetically encoded fluorescent sensors.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 12, 59-67 (2019).</li>
<li>Broxton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+optics+theory+and+3-D+deconvolution+for+the+light+field+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Wave optics theory and 3-D deconvolution for the light field microscope.</a> Optics Express. 21, 25418-25439 (2013).</li>
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Drosophila는 전체 두뇌가 복잡한 행동 도중 심상될 수 있는 희소한 성인 동물 의 한개입니다. 여기에서, 우리는 비행을 준비하고 진행중인 전체 뇌 활동을 이미지에 전체 뇌를 노출하는 방법을 제시한다. 몇 가지 중요한 점을 주목해야 합니다.
D. 멜라노가스터와 같은 작은 동물을 해부하는 것은 어려운 일입니다. 따라서 방법은 그것을 마스터하기 위해 많은 연습과 인내심이 필요합니다. 그러나, 훈련 후, 절차는 30 분 미만 소요 하 고 재현 가능한 결과 생산.
우리가 제시 한 방법에는 추가 제한이 있습니다. 첫째, 자연적인 위치에서 플라이 헤드를 기울이면 목이 스트레칭되어 결합 조직, 신경 또는 근육에 손상을 줄 수 있습니다. 둘째, 복부 식도 영역(SEZ)은 광학적으로 접근할 수 있지만 반투명 식도 아래에 있어 이 영역의 강도와 해상도가 감소합니다. 마지막으로, 홀더는 대부분의 방향으로 손이 닿지 않지만, 비행은 여전히 때때로 그 존재를 깨닫고 탈출을 시도하도록 밀어 넣습니다.
이러한 제한에도 불구하고, 자극에 대한 반응과 행동 및 반응 중 전체 뇌 이미징에서 얻은 포괄적인 데이터는 동물이 복잡하고 자연주의적 환경과 상호 작용하고 탐색할 때 전체 네트워크의 수준에서 뇌 기능을 해독할 수 있게 합니다.

다양한 기술을 사용하여 뇌 활동을 이미징하는 것은 뇌 기능에 대한 이해를 심화시켰습니다. 인간에서, 두뇌 화상 진찰 기술은 중요한 한계가 있습니다: 기능적인 자기 공명 화상 진찰 (fMRI)는 단 하나 신경 해상도의 훨씬 더 낮은 spatio 측두성 해상도를 제공하지만, 뇌전도 (EEG)와 같은 빠른 기술은 뇌1에간접적이고 부분적인 접근을 허용합니다. 설치류와 같은 충분히 큰 동물 모델에서는, 헤드 마운트 현미경을 사용하여 형광 활성 센서(예를 들어, GCaMP)의 기록은 동물이 그 환경에서 움직이는 동안 뇌 활동을 관찰할 수 있게 한다2. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 기술은 현재 뇌의 작은 부분에 만 액세스를 제공. 머리 고정 된 동물은 보다 포괄적으로 이미지 될 수 있지만, 커버리지는 여전히 부분 (예를 들어, 피질 표면3). 제브라피시 애벌레, C. 예르간과 드로소필라와 같은 작은 동물에서만 전체 뇌가 단일 뉴런4의수준에서 시간적 및 공간 해상도로 이미지화될 수 있다.
D. 멜라노가스터는 오랫동안 유전적 모델유기체5로 사용되어 왔으며 강력한 유전적 도구가6로개발되었기 때문에 특히 유망하다. 전자 현미경 검사법 7에서 파생된 새로운 대규모 해부학네트워크7에의해 보완된, 플라이는 대규모 네트워크8에서생성된 복잡한 뇌 역학을 연구할 수 있는 독특한 기회를 제공할 수 있었다. 큐티클은 투명하지 않고, 따라서 뇌를 이미지하기 위해 제거되어야하지만, 생체 내 기능 적 이미징은 2002 년 첫 번째 연구 이후 점점 더 일반적인 장소가되었다9 여러 프로토콜은 이미 출판되었습니다. 그러나, 이러한 방법은몸(10)으로부터플라이 헤드를 분리하고, 플라이의 움직임을심각하게 제한하고,자극(11,12,13,14,15)또는 뇌의 작은 부분만9,16, 26,26,27,17, 18,18,20,20, 20, 20, 20, 20, 20, 20, 20을포함한다. 이러한 강력한 접근 방식을 보완하기 위해, 우리는 최근에 다양한 자극(28)에대한 행동과 반응 중에 전체 뇌를 이미지화 할 준비를 개발했습니다.
여기서, 우리는 비행이 반 자연주의 행동 (즉, 걷기와 그루밍)을 수행하고 감각 자극에 반응하는 동안 전체 뇌를 이미지하기 위해 특별히 개발 된 방법을 제시하기 위해이 연구를 기반으로합니다. 이는 등쪽 후방 측에서 뇌 전체에 접근할 수 있도록 설계된 관찰 홀더를 사용하여 안테나와 프로보시스를 그대로 두고, 비행을 허용하여 다리를 걸을 수 있도록 허용(예: 공기 쿠션 볼). 헤드의 뒷면을 해부하는 단계는 속도, 재현성을 위해 정제되었으며, 비행의 생존력과 이동성에 미치는 영향을 최소화합니다.

<table><tbody><tr><td>#5 겸</td>자 <td>FST by DUMONT</td><td>11252-30</td><td>스트레이트 팁 0.05 x 0.02 mm, Dumoxel, 길이 11 cm</td></tr><tr><td>#55 겸</td>자 <td>FST by DUMONT</td><td>11255-20</td><td>스트레이트 팁 0.05 x 0.02 mm, Inox, 길이 11 cm</td></tr>, <tr><td>30x 접안구</td><td>예그렌</td><td>WF30-9-30-H</td><td>WF30X/9 고안구 접안렌즈 광시야 광학 렌즈 실체 현미경 또는 생물 현미경 30X, 30mm 레티클</td></tr><tr><td>없음 AHOME/UV 손전등</td><td>Shenzhen Yijiawan Technology Co., Ltd</td><td>B07V2W9543 (ASIN)</td><td>365 nm</td></tr><tr><td>Fotoplast Gel/UV Glue</td><td>Dreve Otoplastik GmbH</td><td>44791</td><td>GHS07, GHS08</td></tr><tr><td>광택 마감 투명 테이프</td><td>3M 스카치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KIMTECH 과학/정밀 물티슈</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>7552</td><td>11 x 21 cm</td></tr><tr><td>KL 1500 LCD/현미경 광</td><td>Schott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 MS5 현미경</td><td>라이카</td><td></td><td>WF30X/9</td></tr><tr><td>네일 래커</td><td>Opi Products Inc., N. 할리우드</td><td>6306585338</td><td>블랙</td></tr><tr><td>식염수: Hepes NaH2PO4 NaHCO3 MgCl2 CaCl2 NaCl KCl 자당 스릴로스</td><td>시그마 Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td>Werner Dorsch GmbH</td><td>78 621; B07SXCXWFS(ASIN)</td><td>소프트 핸들</td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>다우 코닝</td><td>0020080 /100 gr</td><td>몰리 코트 111 복합 그리스 그리스 밸브 스탬프 100 g</td></tr></tbody></table>

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 drosophila melanogaster를 준비합니다

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

우리는 걷기와 같은 지속적인 행동 도중 Drosophila 두뇌 전체를 이미지하기 위하여 특별히 개발된 방법을 제시합니다. 헤드 고정 및 해부는 동작에 미치는 영향을 최소화하기 위해 최적화되어 있습니다. 이것은 먼저 이동 장애를 최소화하는 홀더를 사용하여 달성됩니다. 플라이 의 머리 의 뒷면은 산책, 신랑, 냄새, 맛과 볼 수있는 비행의 능력을 유지하면서 전체 뇌에 광학 액세스를 할 수있는 각도로이 홀더에 붙어있습니다. 머리의 뒷면은 머리 운동 유물을 담당하는 광학 경로 및 근육의 조직을 제거하기 위해 해부됩니다. 플라이 뇌는 칼슘 이나 전압 지표를 사용 하 여 뇌 활동을 기록 하기 위해 이후 이미지를 수 있습니다., 예를 들어 칼슘 또는 전압 지표를 사용 하 여, 걷기 또는 그루밍 등 특정 행동 하는 동안, 그리고 다른 자극에 대 한 응답. 상당한 연습을 필요로하는 도전적인 해부를 마스터한 후,이 기술은 행동과 자극 반응에 전체 뇌 활동과 관련된 풍부한 데이터 세트를 기록 할 수 있습니다.

상술한 제제는 고전적인 2 광자 또는 공초점 현미경검사와 같은 대규모 3D 이미징을 위한 현미경하에서 전체 뇌의 관찰을 허용하지만, 또한광시트(31)와 다른 구조화된 조명 현미경기술(32에서검토), 또는 경장 현미경검사법(28)과같은 더 빠른 기술도 있다.
행동을 관찰하고 기능성 감각 기관을 유지하면서 전체 뇌에 대한 액세스는 몇 가지 질문에 대답 할 수 있습니다.
첫째, 비행이 쉬고, 행동 중, 자극에 반응할 때 전반적인 뇌 활동은 무엇입니까? 예를 들어, 자극및 행동에 반응하는 동안 뇌 활성화를 보여주는 경장 현미경으로 얻은 데이터를 포함합니다. 예를 들어, 비디오 2에서,칼슘 프로브는 모든 뉴런(nsyb-GAL4 및 UAS-syt-GCaMP6s(왼쪽) 또는 UAS-GCaMP6M(오른쪽)으로 발현되었고 악취의 퍼프가 제시되었다. 준비는 자극에 반응하는 동안 뇌 활동의 개요를 얻을 수있는 방법을 주목한다. Drosophila에 있는 강력한 유전 공구는 특정 신경 특수형에 이 센서의 발현을 제한하는 것을 이용될 수 있습니다. 비디오 3에서,우리는 도파민및 혈청세포 뉴런 (TH-GAL4, DDC-GAL4 및 UAS-GCaMP6M)에 칼슘 센서의 발현을 제한했습니다. 행동 하는 동안 전체 뇌를 관찰 하 여 허용 하는 플라이 워킹과 밀접 하 게 상관 상관 뇌를 통해 강한 동기 활동을 주의. 칼슘 활성 이외에, 다른 물리적 또는 화학적 신호는 이미지화될 수 있다(예를 들어 전압28,33,신진 대사 제품34,35 또는 특정 신경 조절기36에대한 센서를 사용).
뇌 활동의 역할을 더 구체적으로 이해하기 위해, 우리는 어떤 행동이, 자극에 대한 반응 또는 활동의 자발적인 패턴에 관여하는 지구를 물어볼 수 있습니다. 데이터는 실제로 주 성분 분석 및 독립적인 구성 요소 분석과 같은 기술을 사용하여 기능 영역을 추출하는 편향되지 않은 화면으로 사용될 수 있습니다. 그림 9A는 다른 색상의 다른 기능 영역을 나타낸다. 기능 영역의 모양과 국소화를 통해 해부학적 템플릿에 매핑하여 뇌 영역과 경우에 따라 뉴런 유형을 식별할 수 있습니다. 더욱이, 일단 해부학적 템플릿에 정렬되면, 형광 값은 정량분석을 위해 해부학적 뇌 영역에서 평균될 수 있다(그림 9B참조). 예를 들어 그림 9B의 데이터에 적용된 계층 적 gaussian 모델은 방행 중에 영역이 더 활성화되어 있음을 보여 줍니다(ΔF/F 중앙값 0.029, 95% 신뢰할 수 있는 간격=[0.017 0.041])하지만 신랑 중에는 그렇지 않습니다(ΔF/F 중앙값 = -0.0049 95% 신뢰할 수 있는 간격[-0.01].05.01.01).
이해 깊이에 추가하면, 준비에 의해 허용되는 상이한 기능 영역의 동시 기록은 기능 네트워크의 동적 특성을 연구하는 데 사용될 수 있다. 이것은 중요 하기 때문에 지금까지 공부 하는 모든 두뇌에 두뇌 영역은 매우 되 면 상호 연결 하 고 점점 더 많은 연구 도 감각 영역 동물의 행동 상태에 응답 하는 것으로 나타났습니다. 동적 시스템에 맞을 수 있는 기능 그래프 특성(예: 모듈) 및 스파티오-측두패턴(예:8 참조)과 같은 여러 측면을 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig01.jpg"> 그림 1: 홀더 준비(1단계). A)홀더 디자인(상단에서 보기). B)목 슬롯 준비. 상단: 테이프 디자인, 하단: 목 슬롯을 절단하는 데 사용되는 병렬 블레이드. C)아래로부터 홀더의 보기. D) 목 슬롯 테이프를 추가할 위치를 나타내는 하단 뷰입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig02.jpg"> 그림 2: 추가 준비(1단계). A)머리 뒤쪽을 덮는 접착제를 방지하고 식염수 누출을 방지하기 위해 목 슬롯에 기름을 추가합니다. 스케일 바, 1mm. B)상단 : 몸을 아래로 밀어 하는 데 사용할 것 이다 테이프의 조각의 모양. 아래쪽: 테이프가 홀더에 맞는지 확인합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig03.jpg"> 그림 3: 중심을 돕기 위해 V자 형 테이프 조각을 배치합니다. (A)하단 뷰. (B)최고 보기. 스케일 바, 2mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig04.jpg"> 그림 4: 플라이(2단계)를 놓습니다. 왼쪽, 목이 목 슬롯에 있도록 몸을 배치하기 위해 두 개의 둔한 집게를 사용합니다. 중간, 머리를 정렬합니다. 눈은 슬롯 의 가장자리에 양쪽에 놓여 있습니다. 플라이의 머리는 똑바로. 오른쪽, 얼음으로 덮인 조직으로 비행을 감싸서 움직이지 못하게 하십시오. 스케일 바, 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig05.jpg"> 그림 5: 머리를 고정합니다(3단계). A) 머리의 이상적인 각도. B)관심있는 감각 영역을 피하고 머리 주위에 UV 접착제를 추가합니다. 스케일 바, 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig06.jpg"> 그림 6: 프로보스시스의 팁과 안테나는 접착제(3단계)로부터 자유롭게 보관할 수 있다. 흰색 원은 UV 접착제가 적용된 영역을 나타냅니다. 화살표는 후각 및 돌풍 실험에 대한 접착제에서 무료로 남아있는 부품을 보여줍니다. 다리가 접착제 영역에 닿지 않도록 하는 선택적 테이프를 참고하십시오. 스케일 바, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig07.jpg"> 그림 7: 후면 테이프(4.2단계)를 놓습니다. 1단계에서 생성된 테이프(그림 2,왼쪽 참조)는 본문을 배치하고 홀더의 큰 구멍을 덮는 데 사용됩니다. 스케일 바, 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2.jpg"> 그림 8: 해부 단계(6단계). A-B) 어두운 삼각형의 기저부(십자가)의 기저부에서 각 면을 잘라내어 큐티클 C의이 부분을 제거합니다. D)및 E)근육 16을 제거합니다. 그런 다음 큐티클 F의나머지 부분, 공기 자루 G)및 근육을 부드럽게 제거합니다. H)머리를 해부. 스케일 바, 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig08v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61876/61876fig09.jpg"> 그림 9: 대표 결과. A)기능영역(PCA및 ICA를 사용하여 추출)을 발현하는 GCaMP6 팬뉴뉴니어를 경전지 현미경으로 이미지화(25x, NA=0.95와 일치하는 f/12 마이크로 렌즈 어레이). 스케일 바, 100 μm. B)자극 및 행동에 대한 응답 중 큰 뇌 영역에서평균 칼슘활성(28에서재현). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61876/61876fig09large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 1: 근육 16 운동 (단계 6.3). GFP는 근육에서 발현되었다. 기관 바로 위의 구멍에서 나오는 펌핑 움직임을 유의하십시오. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Muscle16_Movie.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 2: 두 가지 다른 준비를 위한 냄새에 반응 하는 동안 팬 신경 칼슘 활동. 발사믹 식초는 즉석에서 부풀어 오른 다. 범뉴알 칼슘 활성(nsyb-GAL4 드라이버, UAS-syt-GCaMP6s 왼쪽 및 UAS-GCaMP6M 오른쪽)은 경야 현미경(25x, NA=0.95)으로 이미지화되었다(25x, NA=0.95와 일치하는 f/12 마이크로렌즈 어레이). 그런 다음 경야 이미지는 심판28,37에설명된 대로 재구성되었다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/B9_B10CombinedStacks.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
비디오 3: 행동 중 뉴런 유형 하위 집합의 칼슘 활동. GCaMP6는 도파민및 세로토니르기크 뉴런(TH-GAL4 및 DDC-GAL4)에서 발현되었다. 플라이 유전 도구와 함께, 준비는 걷는 동안 많은 지역에서 활동의 강한 증가를 관찰 할 수 있습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/Video3.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 재료. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61876/FlyHolderVJove.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 행동 도중 그리고 자극에 응하여 성인 Drosophila의 전체 두뇌를 이미지하기 위하여 특별히 조정된 방법을 제시합니다. 머리는 전체 뇌에 광학 액세스를 허용하기 위해 배치되며, 비행은 다리와 안테나, 프로보시스의 끝을 움직일 수 있으며 눈은 감각 자극을받을 수 있습니다.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

우리의 프로토콜은 행동 도중 전체 비행 두뇌의 화상 진찰을 허용합니다, 다른 두뇌 지역에 있는 뉴런이 모양을 형성하는 방법을 이해하는 것을 중요합니다. 다른 출판 프로토콜과는 달리, 이것은 비행이 냄새, 맛 또는 시각적 자극에 의해 행동하고 감지하는 동안 전체 뇌에 액세스하기 위해 특별히 개발되었다. 머리 슬롯을 만들 수 있습니다.3D 프린터로 홀더를 인쇄한 후 스테레오 현미경 아래 평평한 표면에 직사각형으로 끈적끈적한 테이프 조각을 놓습니다. 그리고 약 5 밀리미터를 1센티미터 단위로 자른다. 테이프의 긴 측면의 중간에 400 ~ 400 마이크로 미터 다음 슬롯을 잘라, 홀더의 하단에 구멍의 아첨 측면에 테이프를 배치하기 위해 병렬로 고정 두 개의 메스를 사용합니다.집게를 사용하여 테이프를 구멍 주위약 500 마이크로미터를 밀어 넣습니다. 그리고 테이프와 홀더의 상단을 커버검은 매니큐어를 사용합니다. 매니큐어를 적어도 한 시간 동안 건조하게 한 후 압연 조직을 사용하여 머리 슬롯에 약 1 마이크로 리터의 그리스를 추가하십시오.바디 슬롯을 준비하려면 약 2센티미터의 와이드 테이프를 두 조각으로 자르고 1.5mm 너비의 슬라이스를 잘라냅니다. 그런 다음 0.3밀리미터 깊이의 어깨와 바디 슬롯을 잘라 테이프가 홀더에 맞는지 확인합니다. 홀더로 비행을 고정하려면 먼저 해부 현미경 아래에 얼음이있는 얕은 용기를 배치하고 홀더를 얼음 위에 놓은 실험실 조직에 거꾸로 놓습니다.1~4일 된 암컷 과일이 사악한 곳에서 날아와 녹지 않은 얼음에 날아다닌다. 비행이 멈추면 Dell 집게를 사용하여 날개 의 기지에서 비행을 파악하고 슬롯 내부의 목을 가진 홀더로 날아갑니다. 눈은 슬롯의 양쪽에 동일하게 배치되어야 합니다.필요한 경우 접착제가 머리 뒤쪽에 도달하지 못하도록 머리 위에 기름 을 하나 더 넣습니다. 그런 다음 몸과 얼음으로 몸을 덮어 비행이 움직이지 않도록하십시오. 머리를 고정하려면 완전히 후방 뷰에서 약 20도 각도로 배치합니다.그리고 관심있는 감각 영역을 더럽혀지 않도록하면서 머리 주위에 UV 접착제를 적용하기 위해 압연 조직을 사용합니다. 미각 실험을 위해, 포셉을 사용하여 프로보시스를 꺼내프로보스시스 베이스에 접착제를 추가하여 움직임을 방지합니다. 미각 실험이 계획되지 않으면 프로보시스를 머리에 밀어 붙입니다.5 초 동안 UV 빛으로 접착제를 치료하고, 조심스럽게 다리와 문 토양, 감각 영역에 충실 할 수있는 남아있는 액체 접착제를 제거하기 위해, 머리 주변 영역을 청소하기 위해 압연 조직을 사용합니다. 그런 다음 테이프 또는 조직의 얇은 스트립을 사용하여 필요에 따라 다리를 앞쪽으로 이동시하십시오. 몸을 배치하려면 얼음 용기를 제거하고 홀더를 돌립니다.비행 주위의 물을 제거하고 마취에서 비행이 회복되기 전에 신속하게 행동하여 바디 슬롯 테이프를 구멍 위에 놓고 부드럽게 플라이의 몸을 밀어 목을 과도하게 늘리지 않도록주의하십시오. 테이프로 남아있는 큰 구멍을 덮고 머리 뒤쪽에 약 1 마이크로 리터의 그리스를 추가하여 접착제가 해당 위치에 달라붙지 않도록하십시오. 압연 조직을 사용하여 흉부 주위와 테이프와 흉부 위에 UV 접착제를 페인트하고 약 5 초 동안 UV 빛으로 접착제를 치료하십시오.조심스럽게 실험실 조직으로 그리스와 치료되지 않은 접착제를 제거하고 머리 의 상단에 식염수 의 약 1 밀리리터를 추가합니다. 집게를 사용하여 기포를 옆으로 밀어 내고 식염수 위에 덮개 슬립을 배치하고 홀더를 돌려 앞쪽에 식염수 에 대한 확인을 하여 누출을 확인하십시오. 식염수가 관찰되면 식염수제거를 제거하고 더 많은 접착제 또는 더 많은 그리스로 구멍을 고정합니다.머리를 해부하려면 가장 높은 배율을 선택하고 날카로운 매우 미세한 집게를 사용하여 목의 양쪽에 있는 중앙 어두운 표절 삼각형의 기저에 두 개의 컷을 만듭니다. 어두운 삼각형 주위를 잘라, 큐티클의이 부분을 제거합니다. 근육 16 과 식도는이 구멍을 통해 볼 수 있어야하 고 리드미컬하게 움직여야 합니다.매우 미세한 집게를 사용하여 식도에 구멍을 뚫지 않고 근육 16을 끊기 위해이 영역의 상단을 조심스럽게 꼬집습니다. 리듬 운동이 근육을 중지하는 경우 16 가능성이 제거되었다. 근육이 어두운 삼각형 영역의 내측 가장자리에서 시작하여 절제된 경우, 한 쌍의 가위처럼 집게를 사용하여 작은 조각으로 나머지 표피를 조심스럽게 자르고 제거하십시오.그런 다음 집게를 사용하여 한 번에 하나의 공기 주머니를 잡고 천천히 꾸준히 당깁니다. 이 비디오에서 칼슘 프로브는 이 두 과일 플라이 뇌의 모든 뉴런에서 발현되었습니다. 그리고 냄새의 퍼프가 제시되었다.이 실험에서 칼슘 센서 발현은 도파민및 세로토너기세포 뉴런으로 제한되었다. 뇌를 통해 강한 동기 활동과 전체 뇌가 특정 행동 중에 관찰 할 수있는 방법을 설명하는 행동을 걷는 파리 사이의 엄격한 상관 관계를 주목하십시오. 원리 성분 분석 및 독립적인 구성 요소 분석을 사용하여 서로 다른 색상으로 강조 표시된 상이한 기능 영역을 추출할 수 있다.기능 영역의 모양과 지역화를 통해 영역을 해부학 적 템플릿에 매핑할 수 있습니다. 뇌 영역을 식별 하 고 어떤 경우에, 신경 유형. 일단 적절한 해부학 적 템플릿 형광 값에 정렬되면 정량 적 분석을 위한 특정 해부학 적 뇌 영역 내에서 평균될 수 있다.예를 들어, 이 분석에서는 모든 영역이 그루밍 중에보다 걷기 중에 더 활성화되어 있음을 관찰할 수 있습니다. 인내심을 가져야 합니다. 이 심장 해부 기술을 배우는 것은 어렵습니다.내 실험실에서 사람들은 그것을 마스터하고 첫 번째 유용한 준비를하기 전에 평균 3 ~ 4 개월이 필요합니다. 이 프로토콜에 따라 우리는 형광 현미경을 사용하여 대규모 뇌 활동을 기록 할 수 있습니다. 경전현미경과 같은 빠른 방법은 특히 지적된다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 표준 전체 세포 기술을 사용하여 하나의 뉴런에서 레코딩을위한 준비 성인 Drosophila의 전체 머리를 분리하는 절차를 보여줍니다. 그것은 녹음하는 동안 많이 GFP 라벨 세포와 뉴런의 이미지가 포함되어 있습니다.

성인 Drosophila의 머리에서 전체 셀 레코딩

개발 및 성인의 준비 Drosophila 두뇌와 라이브 영상을위한 Retinae

이 비디오는 성체 파리의 온전한 뇌를 다리 슬라이드 아래에 장착하는 방법을 설명하고 형광 현미경 검사를 위해 면역 염색된 뇌에 수행되는 프로토콜을 보여줍니다.

성인 초파리 뇌 장착: 컨포칼 이미징을 위한 슬라이드를 준비하는 방법

이 비디오는 성체 초파리의 뇌를 해부하고 분리하는 방법을 설명하며, 이는 큐티클, 눈 및 기관 조직에 의해 가려진 장기를 시각화하는 데 필요한 절차입니다. 예시 프로토콜은 초파리 신경생물학의 면역염색 및 이미징 방법에 사용할 수 있는 고품질 제제를 산출하는 상세한 시연을 보여줍니다.

초파리 성인 뇌 해부: 파리 신경생물학의 방법

이 비디오는 신경교세포의 단세포 이미징을 위한 형질전환 초파리 뇌의 면역형광 염색을 보여줍니다. 뇌는 신경교세포 특이적 재조합효소 시스템의 제어 하에 항원 항원결정기의 다양한 조합과 융합된 막 표적 단백질을 발현합니다. 분리되고 고정된 뇌는 항원 항원결정기에 특이적인 1차 항체로 염색된 후 형광단 접합 2차 항체로 염색됩니다. 이 라벨링을 통해 다양한 뇌 영역에 걸쳐 서로 다른 신경교세포 하위 집단을 동시에 이미징할 수 있습니다.

신경교세포의 단세포 이미징을 위한 초파리 뇌의 면역형광 염색

출처: Ishimoto, H. et. al., 초파리의 내분비 신호에 대한 뇌 반응을 시각화하기 위한 생체 외 칼슘 이미징. J. vis. Exp. (2018) 이 비디오는 연구를 위한 칼슘 이미징을 보여줍니다.초파리 뉴로펩티드에 대한 뇌 반응. 형광 칼슘 지표를 발현하는 뉴런은 세포 내 칼슘 역학과 신호 분자에 대한 기능적 반응을 나타냅니다.

뉴로펩티드에 대한 초파리 뇌 반응을 연구하기 위한 Ex vivo 칼슘 이미징

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 종이 초파리 뇌의 칼슘 이미징 비보 전 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서는, 천연 또는 합성 화합물은 뇌의 특정 신경 세포를 활성화 하는 능력을 테스트 하는 버퍼에 적용할 수 있습니다.

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

마이크로컴퓨터 단층 촬영을 사용하여 개발 단계에서 온전한 드로소필라 멜라노가스터를 시각화할 수 있는 프로토콜이 제시된다.

마이크로 컴퓨팅 단층 촬영을 사용하여 드로소필라 멜라노가스터의 전체 동물 이미징

학습 및 기억과 같은 인지 과정 중 세포 활동을 연구하는 데 있어 중요한 장벽은 생체 내 이미징 준비를 위해 마취제를 사용하는 것입니다. 마취는 초파리(Drosophila)를 포함한 여러 모델에서 단기 기억과 인지를 손상시킵니다.이 연구는 마취 없이 생체 내 이미징을 위해 성인 초파리를 준비하는 독특한 방법을 제시합니다.

생체 내 마취되지 않은 초파리 성충의 신경 활동 이미징

학습하세요 성인 Drosophila melanogaster의 행동 중 전체 두뇌 화상 진찰 준비 방법을. 이 기술은 자극 반응 시 신경 활동을 실시간으로 관찰하여 행동과 뇌 기능의 상관관계를 규명하는 데 활용됩니다.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

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