Name: 난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 난소 조직에서 박테리아를 특성화하고 기능을 예측하는 방법을. 면역조직화학 염색과 16S rRNA 시퀀싱을 활용하여 암성과 비암성 조직의 박테리아를 구분하고 BugBase와 PICRUSt로 기능적 차이를 분석합니다.

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이 작품은 중국 시안자오퉁대학교 제1부속병원 임상연구상(XJTU1AF-2018-017, XJTU1AF-CRF-2019-002), 산시성 과학기술부 자연과학 의 주요 기초연구프로젝트(2018JM707, 2018JM707,7073)의 임상연구상을 수상했다. 2017ZDJC-11), 산시성 과학기술부(2017ZDXM-SF-068, 2019QYPY-138), 산시성 협력기술 혁신 프로젝트(2) 017XT-026, 2018XT-002) 및 시안 사회 개발 지도 계획 (2017117SF / YX011-3)의 의학 연구 프로젝트. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.
시안자오퉁대학교 제1부속병원의 산부인과 동료들에게 샘플 수집에 기여한 것에 대해 감사드립니다.

이 연구는 시안자오퉁 대학 제1부속병원의 의료기관윤리위원회에 의해 승인되었다(No. XJTUIAF2018LSK-139). 모든 등록 된 환자로부터 통보 된 동의를 얻었습니다.
1. 암 그룹 및 대조군 진입 기준
<ol><li>암 단을 위해, 주로 난소암으로 진단되는 환자를 등록하고, 복강경 후에, 그(것)들은 병리학적인 사실 인정에 의하여 장뇌 난소암이 있다는 것을 증명됩니다.</li>
	<li>대조군의 경우, 난소 질환을 제시하지 않고 자궁 근종 또는 자궁 아데노미증으로 주로 진단되고 자군 절제술과 살핀고-oophorectomy를 겪은 환자를 등록하십시오. 참고: 이 표준은 명확하지 않습니다. 자군 절제술과 살핀고-난소 절제술을 겪는 난소에 영향을 미치지 않는 질병 환자도 등록할 수 있습니다.</li>
	<li>다음 기준 중 하나 이상을 가진 환자를 제외합니다. 임신 또는 모유 수유 여성. 항생제를 복용 2 수술 전에 개월. 발열 또는 높은 염증 성 마커를 갖는. 어떤 종류의 염증이 있습니다. 신애자주반트 화학요법을 받은 후.</li>
</ol>2. 샘플 수집
<ol><li>수술 중, 절제된 난소를 멸균 관에 넣고 튜브를 액체 질소에 넣고 운반합니다. 전체 절차 전반에 걸쳐 다른 것을 만지지 마십시오.</li>
	<li>난소를 약 1cm 두께의 조직 샘플로 분리하여 라미나르 플로우 캐비닛 아래에 새로운 멸균 핀셋을 넣습니다. 분리 후 -80°C에서 샘플을 보존하십시오. 참고: 샘플을 수집하는 모든 절차는 난소를 분리하는 것을 포함하여 무균입니다.</li>
</ol>3. 16S rRNA 유전자 서열
<ol><li>DNA를 추출합니다.<ol>
<li>2mL 원심분리기 튜브에 EX 버퍼를 억제하는 1.2mL를 추가합니다. 그런 다음 180-220 mg의 샘플을 튜브에 추가합니다. 샘플을 완전히 섞어 보자 (70 °C 수조 5 분 동안 다음 15 s에 대한 소용돌이).</li>
		<li>600 x g에서 1 분 동안 튜브원심분리합니다.</li>
		<li>상피물의 550 μL을 새로운 1.5mL 튜브에 넣고 원심분리기를 600 x g에서 1분 동안 배치합니다.</li>
		<li>30 μL의 단백질Ae K로 상체의 400 μL을 다른 1.5 mL 튜브로 옮킨다.</li>
		<li>버퍼 AL 400 μL을 추가하고 15s에 대한 소용돌이 믹서를 사용합니다.</li>
		<li>70°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
		<li>96-100% 알코올의 400 μL을 추가합니다. 15s에 대한 소용돌이 믹서를 사용합니다.</li>
		<li>혼합물 600 μL을 흡수 열과 원심분리기로 1분 동안 13700g으로 옮긴다. 하부 튜브를 교환합니다. 이 단계를 11번 반복합니다.</li>
		<li>완충 AW1 500 μL, 원심분리기 는 13,700 x g에서 1분 동안 추가하고 하부 튜브를 변경합니다.</li>
		<li>완충 AW2 500 μL, 원심분리기는 13,700 x g로 3분 간 추가하고 하부 튜브를 변경합니다.</li>
		<li>원심 분리기는 13,700 x g에서 3 분 동안.</li>
		<li>혼합물을 새로운 1.5mL 튜브로 옮기고, 완충 ATE 200 μL을 추가하고, 실온에서 5분 동안 배양하고 원심분리기는 13,700 x g에서 1분 동안 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>품질 테스트. 1% 세파로즈 젤 전기전도를 사용하여 품질을 테스트하십시오. 샘플 400 ng, 120 V, 30분 추가 이상적인 결과: DNA 농도: ≥ 10 ng/μL, DNA 순도: A260/A280 = 1.8-2.0, 총 DNA: ≥ 300 ng.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 16S 메타게노믹 시퀀싱 키트를 사용하여 라이브러리를 준비합니다.<ol>
<li>PCR을 수행합니다. 간단히 말해서, 각 25 μL PCR 반응은 입력으로 샘플 DNA의 12.5 ng, 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix의 12.5 μL 및 1 μM에서 각 프라이머의 5 μL을 포함합니다.</li>
		<li>다음 프로토콜을 사용하여 PCR을 수행: 3 분 동안 95 °C에서 수행 된 초기 내성 단계는 25 주기의 데포화 (95 ° C, 30 s), 어닐링 (55 ° C, 30 s) 및 확장 (72 ° C, 30 s), 72 ° C에서 5 분의 최종 신장이 뒤따릅니다.</li>
		<li>제조업체의 지침을 사용하여 자기 구슬과 반응 믹스에서 PCR 제품을 정리합니다.</li>
		<li>3.3.1 및 3.3.2 단계를 반복합니다.</li>
		<li>품질 테스트. 3.2단계를 참조하십시오.</li>
		<li>3.3.3을 반복합니다.</li>
		<li>품질 테스트. 불순물을 테스트하기 위해 1% Sepharose 젤 전기포고증, 순도를 테스트하는 분광광계, 농도를 테스트하는 불소계, RNA 분석 키트를 사용하여 무결성을 테스트합니다. 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 라이브러리를 정규화하고 풀로 고정합니다. 그런 다음 600 사이클 V3 표준 유량 셀을 사용하여 서열(2 x 300 bp 페어링 엔드 읽기 설정)을 사용하여 약 100,000 쌍끝 2 x 300 베이스 읽기를 생성합니다. 참고: 전체 길이 프라이머 시퀀스: 16S 앰플리턴 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 포워드 프라이머: 5' TCGTCGGCAGCCAGGTGGTGGTGGTGG-[CCTACGGGG GNGGCWGCAG] 및 16S 앰플리턴 PCR 역 프라이머: 5' GTCTCGTGGGCTCGGGAGATGTG타타아가카카-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석 데이터 분석
<ol><li>소프트웨어 패키지 QIIME 2-201802 20으로 시퀀싱 품질을 기반으로 모든샘플의 원시 판독을 필터링합니다.<ol>
<li>세 개의 파일을 디렉토리에 복사합니다: 엠프 페어링 엔드 엔드-sequences_01 앞으로 시퀀스가 포함된 하나의 forward.fastq.gz 파일은 역시퀀스가 포함된 한 가지 역.fastq.gz 파일은 연결된 바코드가 포함된 하나의 바코드.fastq.gz 파일</li>
		<li>수행하다 키임 도구 가져오기 \ --유형 EMP짝끝시퀀스 \ --입력 경로 emp-페어링 엔드-sequences_01 \--출력 경로 emp-쌍 끝-sequences_02.qza</li>
	</ol>
</li>
	<li>프라이머와 어댑터 시퀀스를 제거합니다. 키이메 컷어댑트 트림 페어링 \ --i-de멀티플렉션 시퀀스 디멀티플록스-seqs_02.qza \ --p-프론트-f GCTACGGGGGG \ --p-프론트 R GCTACGGGGGG \ --p-오류 율 0 \ --품질 컷오프 25 \ --o-트리밍 시퀀스 트리밍-seqs_03.qza \ --자세한 내용</li>
	<li>단축 시퀀스는 두 쌍 끝 특성이 25보다 낮은 읽기입니다. 위의 참조 --품질 컷오프 25</li>
	<li>시퀀싱 데이터를 분석합니다.<ol>
<li>시퀀스를 수집하여 97%의 유사성 차단을 통해 운영 분류 장치(OtUs)를 형성합니다. 키이메 vsearch 복제 해제 시퀀스 \ --i-sequences 트리밍-seqs_03.qza \ --o-제거 테이블 table_04.qza \ --o-복제 시퀀스 rep-seqs_04.qza ​ 키이메 vsearch 클러스터 기능 닫기 참조 \ --i-테이블 table_04.qza \ --i-sequences rep-seqs_04.qza \ --i-참조 시퀀스 97_otus.qza \ --p-퍼크 아이덴티티 0.97 \ --o 클러스터테이블 테이블-cr-97.qza \ --o-클러스터 된 시퀀스 rep-seqs-cr-97.qza \ --타의 추종을 불허하는 시퀀스-cr-97.qza</li>
		<li>OtUs의 경우 각 샘플에서 상대적 풍부를 계산합니다. 풍부한 정보는 테이블 cr-97.qza에 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RDP 교육 세트(버전 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)를 목표로 하는 네이티브 베이지안 분류기를 사용하여 모든 시퀀스를 정렬합니다. 매핑된 분류 정보는 표-cr-97.qza에 있습니다.</li>
	<li>지정된 OTU 내에서, OtUs에 시퀀스의 주요 일관성을 반영하는 분류를 할당합니다. 그런 다음 OtUs를 정렬합니다. 테이블 cr-97.qza 및 담당자-seqs-cr-97.qza 보기</li>
	<li>샘플 그룹 정보를 기반으로 알파 다이버시티(차오 1, ACE, 섀넌, 심슨 및 Evenness 인덱스 포함)와 UniFrac 기반 주좌 분석(PCoA)을 수행합니다. 키임 도구 내보내기 \ --입력 경로 테이블-cr-97.qza \ --출력 경로 내보내기 피처 테이블 내보낸 피처 테이블 키임 다이버시티 알파 \ --i 테이블-cr-97.qza \ --p-미터량 observed_otus \ --o-알파 다이버시티 observed_otus_vector.qza 키임 다이버시티 베타 \ --i 테이블-cr-97.qza \ --p-미터 브레이커티스 \ --o-거리 매트릭스 unweighted_unifrac_distance_matrix.qza</li>
</ol>5. 세균 기능 예측
<ol><li>박테리아의 특성의 관련 표현을 예측하려면 BugBase21을사용하십시오. BugBase용 입력 OTU 테이블은 다음 명령을 사용하여 준비됩니다. 바이오엠 변환 -i otu_table.biom -o otu_table.txt -to-tsv 바이오M 변환 -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --테이블 형 ="OTU 테이블"--to-json 참고: 예측은 6가지 표현형 범주(워드 외. 미게시) (https://bugbase.cs.umn.edu/): 그램 염색, 산소 내성, 생물막을 형성하는 능력, 모바일 요소 함량, 병원성 및 산화 스트레스 허용 오차를 기반으로 합니다.</li>
	<li>PICRUSt에 의한 메타게놈의 기능적 조성물을 마커 유전자 데이터와 기준게놈(22)을포함하는 데이터베이스의 사용과 함께 예측한다. make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t/mnt/nas_bioinfo/심판/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom & normalize_by_copy_number.py-i otu_table.biom-o normalized_otus.biom predict_metagenomes.py-i normalized_otus.biom-o metagenome_predictions.biom categorize_by_function.py-i metagenome_predictions.biom-c "KEGG_Pathways"-l 1 -o picrust_L1.biom categorize_by_function.py -f-i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt</li>
	<li>STAMP23,24의도움으로 각 그룹 간의 기능 차이를 분석합니다. 소프트웨어를 작동하려면 인용을 참조하십시오.</li>
</ol>6. 데이터
<ol><li>통계 소프트웨어를 사용하여 결과의 중요성을 계산합니다. 통계적 유의의 표시는 P < 0.05로 설정되어야 합니다.</li>
	<li>학생의 t-테스트에 의해 나이와 패리티의 차이를 평가합니다. 치 스퀘어 테스트에 의해 갱년기 상태, 고혈압과 당뇨병의 역사에 차이를 평가합니다. Mann-Whitney U 시험에 의한 난소 세균성 택시 수의 차이를 평가합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Manfredo Vieira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li>
<li>Geller, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+of+intratumor+bacteria+in+mediating+tumor+resistance+to+the+chemotherapeutic+drug+gemcitabine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Potential role of intratumor bacteria in mediating tumor resistance to the chemotherapeutic drug gemcitabine.</a> Science. 357 (6356), 1156-1160 (2017).</li>
<li>Manfredo, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+gut+pathobiont+drives+autoimmunity+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translocation of a gut pathobiont drives autoimmunity in mice and humans.</a> Science. 359 (6380), 1156-1161 (2018).</li>
<li>Brunelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globular+structure+of+human+ovulatory+cervical+mucus%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Globular structure of human ovulatory cervical mucus.</a> FASEB J. 21 (14), 3872-3876 (2007).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiota+continuum+along+the+female+reproductive+tract+and+its+relation+to+uterine-related+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The microbiota continuum along the female reproductive tract and its relation to uterine-related diseases.</a> Nature Communications. 8 (1), 875(2017).</li>
<li>Zervomanolakis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+of+upward+transport+in+the+human+female+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Physiology of upward transport in the human female genital tract.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1101, 1-20 (2007).</li>
<li>Verstraelen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+uterine+microbiome+in+non-pregnant+women+through+deep+sequencing+of+the+V1-2+region+of+the+16S+rRNA+gene%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human uterine microbiome in non-pregnant women through deep sequencing of the V1-2 region of the 16S rRNA gene.</a> PeerJ. 4, 1602(2016).</li>
<li>Fang, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+sequencing+reveals+diverse+intrauterine+microbiomes+in+patients+suffering+with+endometrial+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Barcoded sequencing reveals diverse intrauterine microbiomes in patients suffering with endometrial polyps.</a> American Journal of Translational Research. 8 (3), 1581-1592 (2016).</li>
<li>Miles, S. M., Hardy, B. L., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+microbiota+of+the+reproductive+tract+in+women+undergoing+a+total+hysterectomy+and+bilateral+salpingo-oopherectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Investigation of the microbiota of the reproductive tract in women undergoing a total hysterectomy and bilateral salpingo-oopherectomy.</a> Fertil Steril. 107 (3), 813-820 (2017).</li>
<li>Banerjee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ovarian+cancer+oncobiome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The ovarian cancer oncobiome.</a> Oncotarget. 8 (22), 36225-36245 (2017).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+differential+distribution+of+bacteria+between+cancerous+and+noncancerous+ovarian+tissues+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">The differential distribution of bacteria between cancerous and noncancerous ovarian tissues in situ.</a> Journal of Ovarian Research. 13 (1), 8(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+overgrowth+and+diversification+of+microbiota+in+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Bacterial overgrowth and diversification of microbiota in gastric cancer.</a> European Journal of Gastroenterology & Hepatology. 28 (3), 261-266 (2016).</li>
<li>Hosgood, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+role+of+lung+microbiota+in+lung+cancer+attributed+to+household+coal+burning+exposures%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+and+Molecular+Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">The potential role of lung microbiota in lung cancer attributed to household coal burning exposures.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 55 (8), 643-651 (2014).</li>
<li>Kwon, M., Seo, S. S., Kim, M. K., Lee, D. O., Lim, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compositional+and+Functional+Differences+between+Microbiota+and+Cervical+Carcinogenesis+as+Identified+by+Shotgun+Metagenomic+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Compositional and Functional Differences between Microbiota and Cervical Carcinogenesis as Identified by Shotgun Metagenomic Sequencing.</a> Cancers. 11 (3), 309(2019).</li>
<li>Urbaniak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Microbiota+of+Breast+Tissue+and+Its+Association+with+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Microbiota of Breast Tissue and Its Association with Breast Cancer.</a> Applied and Environmental Microbiology. 82 (16), 5039-5048 (2016).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+metatranscriptomic+analysis+of+human+prostate+microbiota+from+patients+with+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and metatranscriptomic analysis of human prostate microbiota from patients with prostate cancer.</a> BMC Genomics. 20 (1), 146(2019).</li>
<li>Walsh, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmenopause+as+a+key+factor+in+the+composition+of+the+Endometrial+Cancer+Microbiome+%28ECbiome%29%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Postmenopause as a key factor in the composition of the Endometrial Cancer Microbiome (ECbiome).</a> Scientific Reports. 9 (1), 19213(2019).</li>
<li>Walther-Antonio, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+contribution+of+the+uterine+microbiome+in+the+development+of+endometrial+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Potential contribution of the uterine microbiome in the development of endometrial cancer.</a> Genome Medicine. 8 (1), 122(2016).</li>
<li>Poore, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiome+analyses+of+blood+and+tissues+suggest+cancer+diagnostic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microbiome analyses of blood and tissues suggest cancer diagnostic approach.</a> Nature. 579 (7800), 567-574 (2020).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Ward, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BugBase+predicts+organism-level+microbiome+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">BugBase predicts organism-level microbiome phenotypes.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Langille, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).</li>
<li>Langille, M. G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+functional+profiling+of+microbial+communities+using+16S+rRNA+marker+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences.</a> Nature Biotechnology. 31 (9), 814(2013).</li>
<li>Parks, D. H., Tyson, G. W., Hugenholtz, P., Beiko, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAMP%3A+statistical+analysis+of+taxonomic+and+functional+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAMP: statistical analysis of taxonomic and functional profiles.</a> Bioinformatics. 30 (21), 3123(2014).</li>
<li>Leranth, C., Hamori, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BDark%26%2334%3B+Purkinje+cells+of+the+cerebellar+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biologica+Hungarica%22%5BJournal%5D)">34;Dark&#34; Purkinje cells of the cerebellar cortex.</a> Acta Biologica Hungarica. 21 (4), 405-419 (1970).</li>
</ol>

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난소암은 여성의 불임25에주목할 만한 영향을 미칩니다. 대부분의 난소암 환자는 후기 단계에서 진단되고, 5년 생존율은 30%18미만입니다. 간, 췌장 및 비장을 포함한 복부 고체 내장에서 박테리아의 확인이 발표되었습니다. 상부 생식기관에서 박테리아의 존재는자궁경부가2,3,4,5로동봉되지 않기 때문에 발생한다. 그러나 복부 고체 내장인 난소가 멸균인지 여부는 아직 결정되지 않았습니다. 또한 난소의 박테리아가 난소암과 관련이 있는지 여부도 중요한 질문입니다.
우리가 발견 한 박테리아의 중요한 차이는 다른 그룹 사이에서 비교되었습니다. 위에서 언급 한 모든 절차는 기기, 시...

최근에는 신장, 비장, 간 및 난소1,2와같은 복부 고체 내장에서 박테리아의 존재를 증명하는 기사가 증가하고 있습니다. 겔러 외. 췌장 종양에서 박테리아를 발견 하 고, 이러한 박테리아는 gemcitabine에 저항 했다, 화학 요법 약물2. S. 만프레도 비에이라 외. 엔테로 코커스 갈리나룸은 림프절, 간 및 비장에 이식하고, 자가 면역3을구동 할 수 있다는 결론을 내렸다.
자궁 경부는 수비수역할을하기 때문에 자궁, 나팔관 및 난소를 포함하는 상부 여성 생식 기관의 박테리아는 최소한으로 연구되었습니다. 그러나 최근 몇 년 동안 몇 가지 새로운 이론이 확립되었습니다. 박테리아는 mucins4,5의변화로 인해 생리 주기 동안 자궁 구멍에 접근할 수 있다. 또한, Zervomanolakis 외. 자궁, 나팔관과 함께, 난소의 내분비 시스템에 의해 제어 되는 연동 성 펌프, 이러한 배열은 박테리아가 내분비, 나팔관 및 난소6에들어갈 수 있도록.
상부 생식관은 더 이상 세균 검출 방법의 발달 덕분에 더 이상 신비가 아닙니다. Verstraelen 외는 16S RNA 유전자7의V1-2 하이퍼변수 영역을 대상으로 하 여 자궁 박테리아를 발견하기 위해 바코드 페어링-엔드 시퀀싱 방법을 사용했다. 팡 등은 자궁내막 폴립 환자에서 바코드 시퀀싱을 사용하였으며 다양한 자궁 내 세균8의존재를 밝혔다. 또한, 16S RNA 유전자를 이용하여, 마일즈 외 및 첸 외. 살핀고-oophorectomy 및 자군 절제술을 겪은 여성의 생식기 시스템에서 박테리아를 각각5,9.
종양 조직에 있는 박테리아는 최근 몇 년 동안에 있는 증가 관심을 얻고 있습니다. Banerjee 외. 미생물군유전체 시그니처가 난소암 환자와대조군 10사이에서 다르다는 것을 발견했다. noxynatronum sibiricum 종양 단계와 연관 되었다, 그리고 메타노 사르키나 vacuolata 난소암 진단 하는 데 사용할 수 있습니다11. 난소암 이외에, 위암, 폐, 전립선, 유방, 자궁경부 및 자궁내막과 같은 다른 암은 박테리아12,13,14,15,16,17,18과연관되는 것으로 입증되었다. Poore 외. 초기 단계 암 검진을 예견하는 미생물 기지를 둔 종양학 진단의 새로운 클래스를제안했습니다 19. 이 프로토콜에서, 우리는 이 두 조직에 있는 박테리아의 조성 그리고 기능을 비교해서 암과 일반적인 난소 조직 사이 다름을 조사했습니다.
면역히스토화학 염색 및 16S rRNA 유전자 염기서열분석은 난소에서 박테리아의 존재를 확인하기 위해 수행되었다. 암과 비암 난소 조직에서 난소 박테리아의 차이와 예측 된 기능을 연구하였다. 결과는 난소 조직에 있는 박테리아의 존재를 보여주었습니다. 안옥시나트로눔시비리쿰과 메타노사르시나 바쿠올라타는 각각 난소암의 단계와 진단과 관련이 있었다. 두 그룹에서 존재했던 46개의 상당히 다른 KEGG 통로를 비교했습니다.

<table><tbody><tr><td>2200 TapeStation Software</td><td>Agilgent 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AmpliSeq for Illumina 라이브러리 준비, 색인 및 액세서리</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image-pro plus 7</td><td>Media Cybernetics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP 300S</td><td>Leica Biosystems Division of Leica Microsystems</td> Leica EG 1150 Leica Biosystems Division of Leica Biosystems Division of Leica Microsystems <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 라이카 마이크로시스템즈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이카 RM2235</td><td>라이카 바이오시스템즈 라이카 마이크로시스템</td><td></td><td></td>즈</tr><tr><td>사업부 LPS 코어 단클론 항체, 클론 WN1 222-5</td><td>Hycult Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind RxnPure Plus 마그네틱 비드</td><td>Omega Biotek</td><td>M1386-00</td><td></td></tr><tr><td>Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit</td><td>Omega Biotek</td><td>M4029-01</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>Silva 데이터베이스</td><td>, Max Planck Institute for Marine Microbiology 및 Jacobs University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, QuantiFluor dsDNA 시스템</td>, <td>Promega</td><td>E2670</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic</td><td>Bj&ouml; rn Usadel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZytoChem Plus(HRP) Anti-Rabbit(DAB) 키트</td><td>Zytomed 시스템</td><td>HRP008DAB-RB</td><td></td></tr></tbody></table>

난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

"멸균"여성 상부 생식 기관의 이론은 세균 검출의 발전으로 인해 증가 반대가 발생하고있다. 그러나 난소에 박테리아가 포함되어 있는지 여부는 아직 확인되지 않았습니다. 본명, 난소 조직에서 박테리아를 검출하는 실험이 도입되었다. 우리는 대조군에 있는 암 단에 있는 난소암 환자 및 비암 환자를 선택했습니다. 16S rRNA 유전자 염기서열 분석은 암 및 대조군으로부터 난소 조직에서 박테리아를 분화시키는 데 사용되었다. 또한, 우리는 BugBase및 PICRUSt를 사용하여 확인된 박테리아의 기능적 조성을 예측했습니다. 이 방법은 또한 많은 장기가 최근 몇 년 동안 박테리아를 항구 입증되었기 때문에 다른 내장 및 조직에서 사용될 수 있습니다. 내장과 조직에 박테리아의 존재는 과학자가 암과 일반적인 조직을 평가하는 것을 도울 수 있고 암의 처리에 있는 원조일 지도 모릅니다.

환자 총 16명의 자격을 갖춘 환자가 연구 결과에 포함되었습니다. 대조군은 양성 자궁 종양진단을 받은 여성 10명이 포함되었다(그 중 3명의 환자는 자궁 근종으로 진단되었고, 7명의 환자는 자궁 아데노마이증으로 진단되었다). 한편, 암 그룹은 장뇌 난소암 진단을 받은 6명의 여성을 포함시켰다(그 중 2명의 환자는 단계 II로 진단되었고, 그 중 2명은 단계 III로 진단되었다). 다음 특성은 대조군과 암군에서 환자 들 사이에 차이가 없음을 보였다: 나이, 갱년기 상태, 패리티, 고혈압의 역사, 당뇨병의 역사(표 1).
표 1: 환자 통계는 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61878/Table1.xlsx" target="_blank">여기를 클릭하여 이 표를 다운로드하십시오.</a>
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면역조직화학 염색 및 16S 리보소말 RNA 유전자(16S rRNA 유전자) 시퀀싱은 시투에서 암 및 비암 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 구별하기 위해 수행되었다. 박테리아의 구성 및 기능적 차이는 관찰되지 않은 국가의 재건에 의해 지역 사회의 BugBase 및 Phylogenetic 조사를 사용하여 예측되었다 (PICRUSt).

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

이 프로토콜은 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 그들의 기능을 예측하도록 설계되었습니다. 면역조직화학 염색 및 16S rRNA 염기서열분석은, 암 및 비암 난소 조직에서 박테리아를 발견하고 구별하기 위해 사용하였다. 박테리아의 보상 및 기능적 차이는 관찰되지 않은 일의 재건에 의해 지역 사회의 BoPs 및 세포 유전 조사를 사용하여 예측됩니다.우리의 프로토콜은 현장에서 난소 조직에서 박테리아를 추출하는 것을 목표로합니다. 그것은 또한 어떤 종류의 종양에 박테리아를 발견 하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 프로토콜의 주요 장점은 거의 모든 실험실에서 실현 될 수 있다는 것이 쉽고 편리하다는 것입니다.또한 결과를 얻는 것도 빠를 것입니다. 프로토콜에서 연습 하는 동안, 어떤 박테리아 오프 사이트 종양 조직을 제외 하는 것이 중요. 따라서 이 프로토콜의 모든 절차는 멸균되어야 합니다.수술 중, 새로운 멸균 핀셋한 쌍으로 대략 1센티미터 두꺼운 조직 견본으로 분리된 난소를 분리합니다. 전체 절차 중에 다른 것을 만지지 마십시오. 분리 후, 샘플을 멸균 튜브로 제거하고 전송을 위해 액체 질소에 넣습니다.영하 80도에서 샘플을 보존하십시오. 포르말린에 의해 조직을 수정한 다음 파라핀으로 포함시면 됩니다. 이 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.조직은 더 이상 보존을 위해 실온에서 보관할 수 있습니다. 추가 단계를 작동하려면 5마이크로미터 직렬 섹션에서 샘플을 잘라냅니다. 그런 다음 샘플을 건조시.샘플에 파라핀을 제거하고 수분을 보충하십시오. 항원을 회수하려면 EDTA 버퍼에서 10 분 마이크로 파 처리가 필요합니다. 0.3%의 수소를 함유한 PBS의 샘플을 찍어보세요.내인성 과산화증 활동을 중지하기 위해 20 분 동안 과산화하십시오. LPS 코어에서 항체 EMA를 수행, 1 이상 300의 농도. 그리고 섭씨 4도에서 하룻밤을 유지하십시오.박테리아를 발견하기 위해, HRP의 존재를 감지하기 위해 DAP 기판 키트를 사용합니다. 제조업체의 지침을 기반으로 HRP 폴리머, 토끼 방지 항체를 사용합니다. 테이블 농축기를 사용하여 항체가 완전히 결합될 수 있도록 하십시오.PBS를 사용하여 결합되지 않은 항체를 제거하십시오. 제조업체의 지시에 따라 화학 물질 염색을 한 다음 물 속의 샘플을 플러시하십시오. 시료에 탈수 작업을 수행합니다.서명하여 샘플을 다수 매치합니다. 그리고 제조업체의 프로토콜에 따라 이미징 Pro Plus 준비 라이브러리를 사용하여 샘플로 입력합니다. 유전자 특이적 서열및 일루미나 어댑터 오버행 뉴클레오티드 서열로 구성된 프라이머 패턴을 연습한다.rRNA 유전자 서열에 대한 세균 16s의 V4 부위의 출생률을 증폭시키기 위해, 앰플리톤 PCR을 사용하여 DNA 샘플 입력으로부터 템플릿을 증폭시한다. 매그 바인드 RxNPure Plus 마그네틱 비즈를 사용하여 PCR 제품에서 반응 믹스를 제거합니다. 인덱싱된 PCR 증폭을 두 번째로 수행합니다.애질런트 2200 TapeStation을 사용하여 라이브러리를 확인합니다. 정량성기 dsDNA 시스템을 사용하여 라이브러리를 정량화합니다. 600 사이클로 v3 표준 유량 셀은 약 100, 000 쌍의 끝을 생성합니다.2회 300베이스 3. 라이브러리는 정규화, 풀풀 및 시퀀스됩니다. 모든 샘플의 원시 속도는 Trimmomatic에 의한 시퀀싱 품질을 기준으로 여과됩니다.프라이머와 어댑터 시퀀스는 모두 제거해야 합니다. 시퀀스는 쌍으로 읽으며 25미만의 자질을 모두 줄여야 합니다. 소프트웨어 패키지 QIIME에 의해 16s rRNA를 분석합니다.OtUs의 경우 유사성 컷오프가 있는 OtUs를 형성하기 위해 서열을 수집하면 각 샘플에서 상대적 풍부를 계산해야 합니다. 모든 시퀀스를 정렬하기 위해 RDP 교육 세트에 있는 Bayesian 분류기를 사용합니다. 주어진 OTU를 사용하면 시퀀스의 주요 일관성을 갖는 분류가 OtUs에 할당됩니다.OtUs는 샘플 그룹 정보를 기반으로 실바 데이터베이스에 정렬됩니다. 알파 다이버시티 및 UniFrac 기반 주좌 분석을 수행합니다. 박테리아의 특성의 관련 프리젠 테이션을 예측하려면 BugBase를 사용합니다.PICRUSt에서 대사유전체의 기능적 조성을 예측한다. 모니터링 데이터와 참조 게놈을 포함하는 데이터베이스를 사용하여 STAMP 소프트웨어의 도움으로 각 그룹 간의 다양한 기능을 분석합니다. 하나의 통계 소프트웨어를 사용하여 결과를 계산합니다.통계적 유의의 표시는 0.05 미만의 p로 설정해야 합니다. 학생의 t-시험에 의해 연령과 패리티를 포함하는 혼란스러운 요인을 계산합니다. 치스퀘어 검사를 통해 갱년기 상태, 고혈압 및 당뇨병의 병력을 계산합니다.Mann-Whitney U 테스트에 의해 난소 박테리아 택시의 수를 계산합니다. 16명의 환자는 이 연구 결과에 등록되었습니다. BugBase는 예측된 대사유전체의 분석을 연습하기 위하여 이용되었습니다.항균 LPS 항체를 사용하여 난소의 잠재적으로 병리유전학 및 면역 조직 화학. 이 그림은 암과 대조군의 세균풍 풍부함과 다양성을 보여줍니다. 16S rRNA 시퀀싱에 의해 공개.수치는 관찰된 종 지수입니다. 차오1 지수, ACE 지수, 섀넌 지수, 어벤니스 지수, 심슨 지수. 필라의 상대적 풍부와 난소 샘플에서 가장 풍부한 12 개의 가장 풍부한 박테리아 종은이 그림에 표시됩니다.도 A, B, C 및 D.는 대조군 및 난소암 군내 환자의 난소에서 패널의 상대적 풍부를 의미한다. 대조군 환자와 난소암 그룹의 난소에서 가장 풍부한 12 종의 상대적 풍부. 이것은 일반적인, PCoA와 Anoxynatronum sibiricum와 메타노 사르키나 vacuolata의 상대적인 풍부를 사용하여 클러스터.그림 A는 PCoA를 사용하여 클러스터된 일반적인 것을 보여줍니다. PC1및 PC2는 x와 y축에 플롯됩니다. 적색 블록은 난소암 그룹의 샘플과 동일하다.파란색 원은 대조군의 샘플과 같습니다. 난소암 군으로부터의 샘플은 대조군내 다른 샘플로부터 분리될 수 있다. 그림 B는 PCoA를 사용하여 클러스터된 일반적인 것을 보여줍니다.PC1 및 PC2는 x 및 y 축에 플롯됩니다. 빨간 블록은 난소암 그룹의 샘플과 동일하다. 파란색 고체 원은 자궁 근종을 가진 환자로부터의 샘플과 같습니다.그리고 파란색 중공 원은 자궁 아데노미증을 가진 환자의 샘플과 같습니다. 도면 C는 안옥시나트로눔시비리쿰의 상대적 풍요로움을 나타낸다. 그림 D는 메타노사르시나 바쿠올라타입니다.이 수치는 예측 된 메나게노믹스의 BugBase 분석입니다. 암 군내 난소의 잠재적으로 병리유전학적 및 산화 스트레스 내성 표현형은 대조군보다 강했다. 이 수치는 PICRUSt 분석에 의한 암과 대조군 사이의 KEGG 경로 공간이 현저히 다르다.시료를 받으면 새로운 멸균 핀셋이 필요합니다. 시료에 대한 잠재적 오염에 주의를 기울이십시오. 그 박테리아 오프 사이트 종양 조직 크게 해결에 영향을 미칠 수 있습니다.제어 그룹을 모든 단계로 설정하는 것이 좋습니다. 잠재적 인 오염의 효과를 줄이기 위해.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

3 차원 Heterotypic<em&gt; 체외에서</em난소 암 개시 및 진행하는 동안 Stromal - 상피 조직의 상호 작용&gt; 모델링

이 비디오에서는 난소 이식 내 난소암 집락화를 연구하기 위해 GFP 발현 난소암 세포와 겹쳐진 생체 외 난소 장기 배양을 확립합니다. 이 프로토콜은 전이를 촉진하는 유백색 반점(milky spot)으로 알려진 망막 내의 면역 세포 구조를 분석합니다.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An ex vivo method to establish Milky spot colonization of fluorescently labeled ovarian cancer cells in murine omentum explants(오멘텀의 난소암 세포 집락화 모델링: 쥐 오멘텀 외식에서 형광 표지된 난소암 세포의 밀키 스폿 집락화를 확립하기 위한 생체 외 방법)

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난소 조직 문화 여 포 개발, 배 란, 그리고 여 포가 폐쇄 증의 모델로 사용할 수 있습니다 하 고 동적 난소 프로세스의 규제 메커니즘을 나타냅니다.

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난소 미세환경 탐구: 마우스 난소 체세포의 분리, 2D 배양 및 오가노이드 배양 방법

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난소 조직에서 박테리아의 특성화 및 기능적 예측

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