Name: 빠른 검출 전략을 사용하여 시아노균 꽃과 관련 된 Cyanotoxins의 조기 발견 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 시아노박테리아 꽃과 관련된 cyanotoxins의 조기 검출을 위한 빠른 다학제 전략을. 원격 감지, 드론 샘플링, LCMS 분석을 통합하여 24시간 내에 수중 독소를 식별합니다.

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이 연구는 프로젝트의 프레임에서 "라 시큐어자 사니타리아 델 페스카토 (CRiSSaP)당 센트로 디 리페리멘토 지역"에 의해 투자되었다 "Attività pilota 디 Monitoraggio 디 Cianobatteri 넬라 fascia costiera 델라 지역 캄파니아", 이탈리아 캄파니아 지역 환경 보호국(ARPAC)과 협력하여 수행, "이스티투토 Zooprofilattico Sperimentale 델 메조조르노 / Osservatorio 지역 라 시큐어자 알리멘타레당 "(IZSM/ORSA), 나폴리 대학 "페데리코 II" - 수의학 및 동물 생산 학과, 아피오)

1. 원격 및 근위 감지: 데이터 수집 및 분석
참고: 이 경우 원격/근위 감지 데이터는 첫 번째 매크로 영역 조사에 사용되며 샘플링할 해안 지역의 특정 지점을 선택하는 데 사용됩니다. MuM3프레임워크(17) 체계에서 논리 흐름은 정보 계층이라는 여러 수준을 포함하는 계층 적 모니터링 모델을 기반으로 합니다. 각 레벨의 정보는 서로 다른 고도에 위치한 온보드 플랫폼을 수행하나 이상의 센서를 사용하여 획득한 데이터를 기반으로 합니다. 각 레벨은측정(19)의고도에 따라 공간 축척을 정의한다. 각 레벨에 여러 센서가 발생할 가능성이 있습니다. 몇 가지 예는 다음과 같습니다 : 위성, 항공기, 헬리콥터, UAV21 및 표면에 가시 근적외선 (VNIR) 및 열 적외선 (TIR) 이미징20; 물리적, 화학적, 생물학적 분석 등22. 표면과 이동식 실험실을 이용한 빠른 반응. 각 센서가 획득한 데이터는 다중 스펙트럼 지수(예: 정규화된 차이 식물 지수(NDVI), 정규화된 차이 수지수지수(NDWI), 엽록소색지수 등)을 계산하기 위해 처리및 결합되므로 원시 데이터는 보다 유용한 파라미터 및 형식(예: 주제 맵)으로 변환됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3.jpg"> 그림 2: 샘플링을 위한 원격/근위 감지 분석(1-2단계). 시아노균 꽃의 검출을 위한 다단계 및 다중 센서 접근법. 데이터 수집은위성(A),항공기(B),및/또는드론(C)에의해 수행됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig2v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol><li>원격 및 근근 감지 데이터 검색
	<ol>
<li>콘텐츠 기반 검색 및 장면 분류를 위해 특별히 생성된 다양한 공용 및 비공개 원격 감지 데이터 집합에서 데이터를 검색합니다. 이 단계에서 사용되는 일반적인 데이터 세트 소스는 다음과 같습니다 : 미국 지질 조사23에서제공하는 Landsat 제품, NASA24에서제공하는 센티넬 -2,3 제품, 코페르니쿠스 오픈 액세스 허브25,MODIS-Aqua26.</li>
		<li>특정 영역, 날짜 범위에 사용할 수 있는 제품을 식별하고 클라우드 커버에서 파생된 제한을 고려합니다. 정의: A) 그래픽 사용자 인터페이스 및 다각형 선택을 사용하여 관심 영역; B) 텍스트 쿼리 필터 필드를 사용하여 날짜 범위 및 클라우드 범위입니다. 참고: 많은 과학적 보고서에서 허용 가능한 클라우드 커버 값이 &lt;20%라고 지적하더라도 이러한 유형의 연구에서는 수면에만 실제 구름 덮개에주의를 기울이는 것이 중요하므로 이 지역의 효과 가치는 &lt;5%입니다.</li>
		<li>미션의 특정 요구에 가장 적합한 플랫폼에서 파생된 제품을 선택합니다. 위성 및 탑재하중 기술 사양의 각 조합에서, 제품의 여러 컬렉션을 얻을 수있다. 예를 들어 NASA EOSDIS24 데이터 제품은 레벨 0에서 레벨 4까지 다양한 수준에서 처리됩니다: 레벨 0 제품은 전체 계측기 해상도의 원시 데이터이며, 더 높은 수준에서 데이터는 더 유용한 매개 변수및 형식으로 변환됩니다. 일반적으로 레벨 0-1을 사용할 수 있으며, 레벨 2-4의 제품은 특정 연구 목표와 관련된 특정 처리가 필요하므로 가용성은 시간 제한이며 적용된 영역입니다.</li>
		<li>위성 관측의 선택한 데이터 집합을 다운로드합니다. 자세한 내용은 이전 작업의 결과 목록 중 하나를 선택하거나 전체 데이터 집합 제품(예: 지오 티프 파일 그룹, 각 밴드에 대한 파일, 정보 및 기타 메타데이터) 또는 특정 단일 밴드만 다운로드합니다. 참고: 1단계 절차에 포함된 각 기본 작업에 대한 구체적인 설명은 2020년27일휴안천 등도 참조하시기 바랍니다.</li>
	</ol></li>
	<li>분석 및 변환을 위한 데이터 사전 처리 및 처리가 보다 유용한 매개 변수 및 형식으로 전환되어 매크로 영역의 첫 번째 검사를 허용합니다. 참고: 다음 작업(1.2단계)은 낮은 수준에서 정보로 변환한 다음 유용한 정보(상위 수준)로 변환하기 위해 최종 된 데이터 처리에 전념합니다. 이 단계는 각 센서(예: 제품 레벨 0-1)의 원시 데이터를 처리하고 상위 수준 제품(예: 레벨 2-4)으로 변환하고, 그 후 정보 계층에서 보다 유용한 매개 변수 및 형식(예: 주제 맵)을 생성하는 것으로 구성됩니다.<ol>
<li>기하학적 및 방사선 보정을 포함하는 원시 데이터를 사전 처리합니다. 이 작업은 자동 또는 반자동 방식(감독되지 않거나 감독되지 않음)에서 래스터 처리를 위한 연결된 도구 세트를 제공하여 올바른 워크플로우를 존중하는 쉬운 분류를 수행하는 특정 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 참고 : 이 연구에서는 두 개의 무료 오픈 소스 도구가 사용됩니다 : Q-GIS 3.1428 반자동 분류 플러그인 (SCP)과 결합. SCP플러그인(29)은 원격 감지 이미지의 반자동 분류를 허용하여 무료 이미지 다운로드, 사전 처리, 후처리 및 래스터 계산을 위한 완벽한 도구 세트를 제공합니다.</li>
		<li>다중 스펙트럼 인덱스를 계산하는 보정된 데이터를 처리합니다. 일반적으로 이 작업은 래스터 계산기 도구를 사용하여 수행됩니다. 다중 스펙트럼 인덱스를 계산하면 GIS 플랫폼에서 관리할 수 있는 새 레이어가 생성되는 서로 다른 대역/레이어 간의 상관 관계를 정의합니다. 예를 들어, 센티넬 및 Landsat 운영 토지 이미저 센서(OLI)에서 시작하여 정규화된 차이 식물 지수(NDVI)와 같은 다중 스펙트럼 인덱스를 계산할 수 있습니다. 식물 지수는 엽록소 함량을 추정하는 데사용됩니다 30,31.</li>
		<li>거짓 색상 주제맵에서 와 같이 표현되는 엽록소 함량 지수의 추정에서 얻은 결과를 분석하고 엽록소 농도가 높은 임계 영역을 정의합니다. 이 연구에서엽록소-a 맵은 테라 및 아쿠아 위성 플랫폼에 장착된 MODIS센서(32)의데이터 집합을 사용하여 생성됩니다. 샘플링 스팟은 비정상적인 값이 등록된 위치에 국한됩니다. 참고: 철아 농도가 20 mg/L33을초과하면 조류 꽃 깃발(각 특정 지점을 정의하는)은 원격 감지 영역에서 발생합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 가이드 샘플링
참고: 샘플링 스팟의 선택은 넓은 해안 지역에서 반점을 선택할 수 있는 원격/근위 감지 층 분석에 의해 구동됩니다. 미세 한 키스틴의 독성으로 인해 샘플링이 운영자에게 위험 할 수 있다는 점을 고려하여 안전 샘플링 절차가 필요합니다. 특히 에어로졸 흡입 및 피부 접촉으로부터 작업자를 보호해야 합니다. 그런 다음 아래에 자세히 설명된 절차에 따라 샘플링을 수행합니다.
<ol><li>눈 보호를 위해 고글, 에어로졸 흡입을 방지하기 위한 FFP2 마스크, 피부 접촉을 방지하기 위한 안전 장갑을 착용하십시오.</li>
	<li>각 사이트에서 트리플리케이트로 0.5 L의 물을 수집합니다.</li>
	<li>각 샘플의 타당성을 측정하여 리프라도미터를 사용합니다. 리프라토미터에 시료 한 방울을 넣고 천 당 부품의 관점에서 살리니값 (ppt - ∞)을 읽습니다.</li>
	<li>샘플링의 끝에서, 먼저 손을 씻는다; 그런 다음 장갑, 마스크 및 고글을 제거하여 개인 보호 장비의 외부 표면을 만지지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>샘플을 실온에서 실험실로 운반합니다.</li>
</ol>3. 미세한 관찰 및 분류학적 식별에 의한 시아노박테리아 종 식별
<ol><li>원심분리기 각 샘플(≈0.5L)은 11,200 x g에서 5분 동안.</li>
	<li>다음과 같이 수퍼나츠를 추출: 각 시료에 부타놀 500mL를 붓고 깔때기를 사용하여, 분리 유입경로로 추출되는 혼합물을 전달한다. 두 레이어를 분리할 수 있도록 분리 깔때기를 링 클램프에 똑바로 세워 놓습니다. 수성 단계가 에를렌마이어 플라스크에서 배출하자. 이 단계를 세 번 반복합니다. 그런 다음 유기 상을 진공 상태에서 농축하고 무게를 측정합니다.</li>
	<li>3.1 단계에서 펠릿을 수집하고 현미경을 위한 18MP 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경으로 400x 및 1,000배율로 분석합니다. 블루 그린 색상, 세포 모양 및 크기는 다른 미생물 중 시아노박테리아를 인식 할 수 있습니다 : 자신의 형태적 특징에 기초하여 시아노 박테리아의 존재를 찾습니다.</li>
	<li>코마렉 등201434에 기술된 절차에 따라 현미경 관찰에 의한 분류학 분석을통해 종을 식별한다. 참고: 상보적인 16S 메타뇨 분석은 시아노균 세세서3을식별하기 위해 수행될 수 있다.</li>
	<li>염분에 따르면 10mL의 바닷물/담수 BG11 매체로 펠릿의 알리쿼트(aliquot)를 희석하여 재배를 위해 희석합니다.</li>
</ol>4. 시아노톡신 의 식별
<ol><li>유기 용매를 사용하여 시료 추출<ol>
<li>펠릿의 각 샘플을 플라스크에 넣고 얼음 목욕을 사용하여 5 분 동안 초음파 처리하십시오. 그런 다음 50mL의 신선한 MeOH를 넣고 부드럽게 흔들어 줍니다. 용지 필터를 사용하여 용액을 필터링하고 둥근 바닥 플라스크에서 여과물을 수집합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 이어서, 100% DCM(x2, 50mL)35를사용하여 MeOH/DCM의 50mL 혼합물을 2회(1:1, 50mL)로 첨가한 펠릿을 추출한다. 각 라운드 하단 플라스크를 "MeOH 추출물", "MeOH/DCM 추출물", "DCM 추출물"으로 각각 라벨을 지정하고 진공 상태에서 농축합니다.</li>
		<li>LC-HRMS/MS를 통해 각 유기 추출물(MeOH, MeOH/DCM, DCM)을 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LC-HRMS/MS 분석<ol>
<li>LC-HRMS 및 LC-HRMS/MS 샘플 준비: MeOH ≥ 99.9%를 사용하여 각 샘플을 용해하여 최종 농도를 10 mg/mL로 얻습니다.</li>
		<li>HPLC 시스템(LC-HRMS/MS 시스템)과 결합된 고해상도 ESI 질량 분광계를 사용하여 각 샘플을 분석합니다. 실온에서 5μm C18 컬럼(100 x 2.10mm)으로 HPLC에서 작업합니다. H2O(HCOOH 0.1% 보충) 및 MeOHat 200 μL min-1로그라데이션 용출을 사용합니다. 그라데이션 프로그램은 3분 동안 10%, 30분 동안 10% ~ 100% MeOH, 7분 동안 100% MeOH를 제어로 사용합니다.</li>
		<li>데이터 수집. 데이터 종속 획득 모드(DDA)에서 데이터를 수집: 전체 스캔 질량 스펙트럼의 10개의 가장 집중적인 이온은 고해상도 탠덤 질량 분석법(HRMS/MS) 분석을 받아야 합니다. CID 단편화, 격리 폭 2.0, 정규화된 충돌 에너지 35, 활성화 Q 0.250 및 활성화 시간 30ms를 사용하여 선택한 이온에 대한 HRMS/MS 스캔을 획득합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생물 정보 분석 및 분자 네트워킹<ol>
<li>MS 특정 소프트웨어를 사용하여 각 강렬한 이온에 대한 조각화 패턴을 분석합니다.</li>
		<li>MS-Cluster를 사용하여 데이터를 클러스터로 수집합니다(1.0 Da및 MS/MS 단편 이온 허용 오차 0.5Da의 상위 질량 허용 오차). 2미만의 스펙트럼을 포함하는 합의 스펙트럼이 제거됩니다.</li>
		<li>분자 네트워킹을 위해 GNPS(글로벌 천연 제품 소셜36)로MS/MS 데이터를 분석합니다.</li>
		<li>합의 스펙트럼과 GNPS-질량-Ive 라이브러리에 보고된 것과 쌍별비교합니다.</li>
		<li>획득된네트워크(37)를시각화한다. 참고: 분자 네트워킹의 경우 시그리스트 외 202038을참조하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3.jpg"> 그림 3: FDS 인랩 단계(3-4). 샘플링 후 실험실에서 수행되는 주요 활동의 시각적 표현(3단계 및 4단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig3v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

지난 몇 년 동안, 우리 팀은 수체와 바이밸브에서 시아노박테리아와 시아노톡신의 존재를 해명할 수 있는 몇 가지 다른 접근법을 테스트하고 검증했습니다. 새로운 개발 된 전략은 이러한 연구의 결과를 나타냅니다. 빠른 감지 범위에 맞는 최적의 기술과 기술은 각 단일 단계의 효과를 극대화하는 고유한 절차의 모자 아래에 수집됩니다. 대상 영역, 꽃 확장 및 성장 단계는 사용하기에 적합한 방법과 기술의 선택에 원동력입니다.
시아노박테리아와 시아노톡신이 빠른 검출을 우선순위인 경우, 전략은 총 수를 4단계로 줄이게 한다: (1) 첫 번째 조사를 위한 원격 및 동체 감지 및 데이터 분석, 사이트의 국소화 및 꽃 패턴 및 확장의 정의; (2) 가이드 샘플링; (3) 현미경 관찰 및 분류학 분석; (4) 물 시료의 복제 및 시아노톡신의 빠른 검출을 위한 LC-MS 데이터의 화학 분석 및 분자 네트워킹.
첫 번째 단계에서는 계층 적 모니터링 접근 방식의 모든 계층을 포괄하는 전체 플랫폼 체인에 의해 획득 된 데이터의 가용성이 분석 된 시나리오의 완전한 비전을 회복시키는 가장 좋은 솔루션이 되더라도 종종 하나의 정보 계층만이 지역 조사 작업을 유도하고 현장에서 샘플링 작업을 수행하기 위해 핫 스팟에 효과적으로 집중할 수 있습니다. 위성, 항공기, 헬리콥터, UAV를 사용하여 데이터를 획득한 보고된 경험에 따르면 빠른 탐지 전략에 필요한 요구와 완전히 일치하는 솔루션은 유일한 위성 제품을 사용하는 것입니다.
또한 위성(예: 항공기, 헬리콥터, UAV)보다 낮은 고도에서 비행하는 플랫폼에 의해 수행되는 임무에서 파생되는 정보 계층은 뛰어난 해상도로 정보를 제공합니다.
시료가 선택되면(2단계), 분석/생물정보학 분석(LC-MS 데이터의 분자 네트워킹)은 물 시료의 신속한 복제 및 원색소(3단계 및 4단계)의 신속한 검출을 위한 도구이다. 16S 메타게놈 분석은 적어도 2주의 작업이 소요됩니다. 더욱이, 일반적으로 유독한 시아노균 종이 확인되더라도, 그들의 독소 생성은 입증되지 않습니다. 같은 이유로, 현미경 관찰 자체는 독성 시아노 박테리아의 존재를 밝히기에 충분하지 않습니다. 물론 MS 분석 및 분자 네트워킹에는 몇 가지 제한이 있습니다. 그들은 관심의 화합물 경우 매우 효과적이다 (예를 들어, 독소) 그들은 검출 될 충분한 양에있는 경우, 적용 된 조건에서 잘 이온화되는 경우. 알려진 시아노균 독소 검출 및 모니터링을 위해 MS 기반 분자 네트워킹은 실제로 보다 견고하고 신뢰할 수 있는 기술 중 하나를 나타냅니다.
따라서, 이 접근법은 시아노박테리아및 관련 시아노톡신의 빠른 검출이 필요할 때 매우 유용하다는 것을 증명합니다; 또한 시아노균꽃과 독소의 정량화는 또한 큰 시아노균 독성 꽃에 의해 발생할 수 있는 건강 지역 사회의 문제를 방지하기 위하여 이 전략에 의해 가능합니다.

시아노균 꽃은 지난 15년 동안 전 세계적으로 환경문제로 떠올랐다1,2. 시아노균 꽃은 시아노박테리아라는 미생물의 자라난 때문입니다. 그들은 열대 지역과 매우 차가운 물을 포함한 다양한 환경에서 살기 위해 적응한 광합성 미생물의 눈에 띄는 그룹입니다. 그들은 특히 영양분의 대규모 농축에 대응하여 수면을 덮고 큰 꽃을 생산하는 것으로 알려져 있습니다, 소위 부영양화 과정3.
따라서, 시아노박테리아는 수질오염4,5,6의우수한 생체지표이다. 그들은 또한 흥미로운 약리학적 특성7,8천연 화합물의 넓은 배열을 생성 할 수있습니다. 시아노박테리아와 관련된 환경 문제는 꽃 자체입니다. 꽃은 수중 잔디에 햇빛을 차단 물고기 사살로 이어지는 물에 산소를 소비, 표면 쓰레기와 냄새를 생성하고, 유기체의 필터 먹이를 방해 할 수있습니다 9.
또한, 더욱 심각하게, 온도, 영양소(인 및 질소), 햇빛(광합성용), 및 물의 pH와 같은 요인의 특정 조합에서, 시아노균 꽃은 독소 생산을 유발한다; 따라서, 그들은 인간과 동물에 해로운된다. 시아노톡신의 가장 연구된 클래스는 제네라 마이크로사이클시스에 의해 생성됩니다. 이들은 미세 세포신 (MC)의 일반적인 이름으로 알려진 순환 펩티드입니다 : 미세 세포신 -LR은 가장 심한 간독성을 생성 할 수있는 것으로 연구되고10. 동물과 인간은 오염된 식수 또는 음식을 섭취하여 MC에 노출될 수 있습니다. 세계보건기구(WHO)는 가이드라인11로총 미세포-LR 값 0.001 mg/L을 제안했다. 그러나, 이것은 지금까지 고립된 100개 이상의 미세 세포에서 하나의 변이체(즉, MC-LR)와만 관련이 있다.
MALDI-TOF MS 분석12,13,14,15와원격 감지와 같은 이전에 보고된 결합 방법은 MC의 농도 검출에 초점을 맞추고 있다. 가장 최근의 방법은 넓은 개화 창공만 감지하는 데 효과적인 저해상도 센서를 사용합니다. 또한 표준을 사용할 수 있는 독소만 공개할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 절차의 대부분은 시간이 많이 소요되며, 시간 방지 하거나 안전 문제를 최소화 하는 꽃의 조기 감지에 대 한 극적인 요인. 여기에서 제안된 다학제 전략은 단지 24 h16후에, 시아노박테리아 꽃및 시아노톡신의 급속한 검출을 제공합니다.
MuM3라는 프로그램의 프레임에서, "3차원 (3D) 물리적 공간에서 다분야, 다중 규모 및 다중 파라메트릭 모니터링"17,18,고속 검출 전략 (FDS)은 여러 기술의 장점을 결합 : 1) 원격 감지꽃; 2) 시아노박테리아 종을 검출하는 현미경 관찰; 및 3) 분석/생물정보학 분석, 즉 LC-HRMS 기반 분자 네트워킹을 분석하여 시아노톡신을 검출합니다. 결과는 24 시간 이내에 얻어진다.
새로운 접근 방식은 짧은 시간에 넓은 해안 지역을 모니터링하고 수많은 샘플링 및 분석을 피하고 탐지 시간과 비용을 줄이는 데 유용합니다. 이 전략은 시아노박테리아와 독소의 모니터링에 대한 다양한 접근법의 연구 및 적용의 결과이며 각 의 장점을 결합합니다. 구체적으로, 상이한 플랫폼(위성, 항공기, 드론) 및 센서(MODIS, 열적외선)의 사용으로부터 오는 결과의 분석은, 시아노균 종(현미경, UV-Vis 분광법, 16S 분석) 및 독소(LC-MS 분석, 분자 네트워크)의 식별을 위한 다양한 방법론적 접근법과 같은 원격 감지 분석을 위한 다양한 방법론적 접근법과 같은, 대부분의 용도에 대한 선택과 적절한 용도의 선택을 허용하였다. 새로운 방법론은 캄파니아 환경 보호 기관 모니터링 프로그램의 프레임에서 캄파니아 해안 (이탈리아)에 대한 후속 모니터링 캠페인에서 실험및 검증되었습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3.jpg"> 그림 1: FDS 전략. 시아노박테리아및 시아노톡신을 위한 빠른 검출 전략의 개요. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig1v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>10X 비타민 믹스</td><td></td><td></td><td>니코틴산 100 mg/100 mL; PABA 10 mg/100 mL; 비오틴 1 mg/100 mL; 티아민 200 mg/100 mL; B12 1 mg/100 mL; 엽산 1 mg / 100 mL; 이노시톨 1mg/100mL; Ca- 판토텐산 염 100 mg / 100 mL</td></tr>, <tr><td>1-BuOH</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>33065.2.5L-R</td><td></td></tr><tr><td>BG11 원액</td><td></td><td></td><td>Na2EDTA 20 mg / L; 구연산 철 암모늄 120 mg / L; 구연산 &middot; 1H2O 120 mg/L; CaCl2&middot; 2H2O 700 mg/L, MgSO4&middot; 7H2O 1.5 g/L, K2HPO4&middot; 3H2O 800 mg/L, NiSO4(NH4)2SO4&middot; 6H2O(0.1mM 재고) 5mL; Na2SeO4 (0.1 mM 재고) 2 mL, Nitsch's Solution 20 mL</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Hermle</td><td>Z36HK</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Honeywell</td><td>32211.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877.2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Kinetex C18 cloumn</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U3000 HPLC 시스템</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Honeywell</td><td>32213.2.5L</td><td></td></tr> 현미경에 결합된 LTQ Orbitrap XL 고해상도 ESI 질량분석기는 <tr><td>OMAX 18 MP CMOS 카메라가 장착되어 있습니다.</td><td>Optech</td><td>Biostar B3</td><td></td></tr><tr><td>멀티밴드 카메라</td><td>Intergraph DMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitsch의 솔루션</td><td></td><td></td><td>H3BO3 0.5 g/L MnSO4&middot; H2O 2.28 g/L ZnSO4&middot; 7H2O 0.5 g/L CuSO4&middot; 5H2O 0.025 g/L COCl2&middot; 6H2O 0.135 g/L Na2MoO4&middot; 2H2O 0.025 g/L</td></tr><tr><td>굴절계, mr 100 ATC</td><td>AQL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SWBG11 매체</td><td></td><td></td><td>BG11 원액 50 mL/L; 인스턴트 오션 33g/L; 물 950 mL / L 10X; 비타민 믹스 100 &마이크로; L/L</td></tr></tbody></table>

빠른 검출 전략을 사용하여 시아노균 꽃과 관련 된 cyanotoxins의 조기 발견

Early Detection of Cyanobacterial Blooms and Associated Cyanotoxins using Fast Detection Strategy

청색균과 시아노톡신의 빠른 검출은 빠른 검출 전략(FDS)을 사용하여 달성된다. 물 샘플및 바이밸브 추출물과 같은 유기 매트릭스에서 시아노박테리아 및 관련 시아노톡신의 존재를 해명하기 위해서는 24시간만 필요합니다. FDS는 원격/근위 감지 기술과 분석/생물정보학 분석을 결합합니다. 샘플링 스팟은 원격 감지를 포함한 3차원 물리적 공간에서 다분야, 다중 규모 및 다중 파라메트릭 모니터링을 통해 선택됩니다. 시료의 현미경 관찰 및 분류학 분석은 시아노균 종의 식별을 허용하는 실험실 환경에서 수행됩니다. 샘플은 유기 용매로 추출하고 MS/MS에 의해 얻어진 LC-MS/MS. 데이터로 가공되어 온라인 플랫폼 글로벌 천연제품 사회(GNPS)를 사용하여 분자 네트워크를 생성하여 생물정보학적 접근법을 사용하여 분석된다. 이러한 네트워크는 질량 분석법에서 얻은 단편화 스펙트럼의 데이터를 GNPS 라이브러리와 비교하여 독소를 감지하고 식별하도록 분석됩니다. 이를 통해 동일한 분자 네트워크에서 나타나는 알려진 독소 및 알려지지 않은 유사체를 검출할 수 있습니다.

첫 번째 연구에서3,SW 이탈리아의 캄파니아 해안을 따라 4 개의 인위적으로 영향을 받은 사이트는 위성 Landsat 8 및 2015 년 여름 동안 항공기를 사용하여 관찰되었습니다. Landsat 8 운영 토지 이미저 센서 (OLI)와 항공기 다중 스펙트럼 카메라는 지역에 대한 정규화 된 차이 물 지수 (NDWI) 이미지를 생성 할 수 있도록, 따라서, 시아노 박테리아 지역 사회의 존재를 공개. 시아노균 지역 사회 조성물은 시아노균 색소 피코시아닌(PC)의 검출을 위한 분광측정 분석을 통해 결정되었다. 이어서, 상보적인 16S 메타뇨 분석이 시안균 과세를 식별할 수 있게 되었다. 메라지노믹 분석과 함께 위성/공중 플랫폼을 통한 단순화된 다중 스펙트럼 이미지 인덱싱 및 분류는 강한 부영양 조건(예: 렙톨립비아 스프,Pseudooscillatoria sp.) 와 관련된 제네라에 속하는 시아노박테리아의 존재를 검출하는 데 효과적이었다. 
두 번째 연구에서14,FDS 접근은 봄 / 여름 동안 테스트되었다 2017. 위성 데이터는 유일한 원격 감지 수준으로 사용되었습니다. 자세히, 테라와 아쿠아 위성 플랫폼에 장착 된 MODerate 이미지 분광기미터 (MODIS) 센서에 의해 획득 된 데이터는 캄파니아 해안을 따라 수역에서 엽록소 (Chl-a)의 정량화를 허용하고 10 개의 샘플링 스팟을 선택했습니다. 샘플은 현미경 관찰 및 분류학적 식별에 의해 실험실에서 처리된 다음 유기 용매로 추출하였다. 유기 추출물은 LC-MS-MS 분석에 의해 처리되었습니다. MS-MS에 의해 얻은 데이터는 분자의 네트워크를 만들기 위하여 GNPS 플랫폼을 사용하여 생물정보학적 접근을 사용하여 분석되었습니다. 네트워크는 질량 분석법에서 얻은 단편화 스펙트럼의 데이터를 GNPS 라이브러리와 비교하는 독소를 감지하고 식별하도록 분석되었다. 이것은 동일한 분자 네트워크에서 관련있는 나타날 알려진 독소 및 알려지지 않은 유사체를 검출할 수 있었습니다. 구체적으로, Lyngbyatoxin A, 리포메이터성 피부색, 모든 물 샘플 및 바이밸브의 샘플에서 검출되었다; Lyngbyatoxin A 분자 클러스터에서, lyngbyatoxins 가족의 어떤 알려진된 화합물과 관련되지 않은 노드도 존재했다, 알 수없는 lyngbyatoxin 유사체의 존재를 제안. 샘플에서는 미세 포스틴 및 기타 독소가 발견되지 않았습니다. 모든 결과는 24 시간 이내에 얻어졌다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3.jpg"> 그림 4: FDS 대표 결과. 캄파니아 해안 (이탈리아)에 FDS 전략의 응용 프로그램의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61889/61889fig4v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

시아노균 꽃과 관련 시아노톡신의 조기 발견을 위한 빠른 종합 전략은 여기에서 기술된다. 그것은 24 시간에서 물 샘플 및 바이밸브 샘플과 같은 유기 매트릭스에서 시아노박테리아 및 관련 시아노톡신의 검출을 허용합니다.

빠른 검출 전략을 사용하여 시아노균 꽃과 관련 된 Cyanotoxins의 조기 발견

Fast detection of cyanobacteria and cyanotoxins is achieved using a Fast Detection Strategy (FDS). Only 24 h are needed to unravel the presence of ...

빠른 검출 전략을 통해 조개 물고기 및 기타 어산물과 같은 유기 매트릭스에서 물 샘플에서 시아노박테리아 꽃과 관련 시아노톡신을 조기에 검출할 수 있습니다. 시아노박테리아꽃은 모든 종류의 환경에서 살 수 있는 시아노박테리아의 자라난 때문입니다. 그리고 그들은 지난 15 년 동안 전 세계적으로 환경 문제로 부상했습니다.지난 몇 년 동안 유해한 시아노박테리아의 개화 수가 증가함에 따라, 개화와 독성 확산을 해결하기 위한 핵심인 조기 발견의 필요성이 더욱 절실해지고 있습니다. 우리의 첫 번째 방향 전략은 원격 및 근위 감지 기술 기술과 실험실 화학 및 생물 정보 분석과 결합하여 워크플로우를 통합한 고유한 통합된 워크플로우에 통합되어 있습니다. 전체 프로세스는 안전합니다.샘플링 및 실험실 분석 중 에어로졸 흡입 및 피부 접촉을 방지하기 위해 적절한 안전 조치를 취합니다. 데이터 검색의 경우 먼저 글로벌 세계 맵에서 대상 영역을 찾아 수집 날짜에 대한 다양한 공용 및 비공개 원격 감지 데이터 집합에서 데이터를 검색합니다. 검색 후 원시 데이터를 처리하고 다중 스펙트럼 인덱스를 계산하고 결과 정보를 분류합니다.그런 다음 생성된 테마 맵에서 샘플링 사이트를 정의합니다. 샘플 수집의 경우 장비를 모바일 랩의 선택한 샘플링 사이트로 전송하고 매크로 영역 조사를 수행하기 위한 드론 비행 경로를 계획합니다. 현장에서는 다른 페이로드가 장착된 여러 드론을 사용하여 비행 임무를 수행합니다.또한 드론이 획득한 영상을 사용하여 꽃의 존재와 확장을 검증하고 정확한 샘플링 포인트를 식별합니다. 확인된 샘플링 지점에서 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 각 사이트에서 500 밀리리터 물 샘플 3개를 수집합니다. 공기 와 수온 및 사이트 pH 및 염분과 같은 여러 환경 매개 변수를 측정합니다.그런 다음 수집된 샘플을 모바일 랩에 저장하여 대학 실험실로 이동합니다. 슬라이드를 준비하고 디지털 카메라가 장착된 모바일 실험실 현미경으로 샘플을 선별하여 청록색, 세포 모양 및 크기 펠릿을 기준으로 샘플 내에 존재하는 종의 현미경 분류학적 분석 및 식별을 허용합니다. 일단 견본 내에서 집합된 시아노박테리아의 종은 확인되면, 대학 실험실에서, 원심분리하고 견본 펠릿을 방해하지 않고 새로운 콘테이로 각 상류체를 전송합니다.각 샘플 상수에 500 밀리리터의 부타놀을 추가하고 각 솔루션을 분리 깔때기로 추출하도록 전송합니다. 각 링 클램프에 깔때기를 흔들고 똑바로 놓은 후 수중 단계가 개별 Erlenmeyer 플라스크로 배출되도록 합니다. 층 분리를 세 번 반복한 후, 유기상을 진공 아래에 농축하고 무게를 측정합니다.유기 용매를 사용하여 샘플 추출을 위해 각 샘플 펠릿에 50 밀리리터의 신선한 메탄올을 추가하고 얼음 욕조에서 샘플을 초음파 처리합니다. 5분 후, 각 샘플에 50밀리리터의 신선한 메탄올을 넣고 플라스크를 부드럽게 흔들어 필터 용지의 개별 조각을 통해 솔루션을 필터링하고 둥근 바닥 플라스크에서 여과물을 수집합니다. 각 샘플을 두 번 더 필터링한 후, 방금 설명한 바와 같이 표준 프로토콜에 따라 액체 크로마토그래피 및 고해상도 탠덤 질량 분광법에 의해 샘플 추출물을 분석합니다.그런 다음 글로벌 천연 제품 소셜 플랫폼을 사용하여 분자 네트워크를 생성하고 적절한 도구를 사용하여 결과 네트워크를 분석하고 질량 분석 데이터를 결합하여 수집된 샘플 내에 존재하는 것으로 판단되는 독소를 식별합니다. 제안된 전략은 2015년부터 2021년까지 이탈리아 남부 캄파니아 지역에서 활동하는 해안 모니터링 프로그램에서 얻은 결과에 의해 검증되었습니다. 기술을 생성된 결과와 연결하는 시각적 워크플로우가 생성되었습니다.후속 모니터링 캠페인 중에 각 단계는 빠른 감지를 목표로 최적화되었습니다. 원격 감지 워크플로우를 최적화하면 생성된 제품 수준을 개선하는 동시에 플랫폼 및 임무 수를 줄일 수 있었습니다. 예를 들어, 이 빠른 탐지 전략은 여러 개의 다른 공중 플랫폼 사용에서 위성 및 드론 플랫폼으로의 전환을 용이하게 합니다.그리고 여러 가지 다중 스펙트럼 전문 인덱스의 사용에서보다 유익한 엽록소 및 정규화 된 차이 식물 지수 주제맵에. 이와 동시에, 16S 메토게놈 분석을 요구하여 시아노균 공동체를 결정하기 위한 현미경 관찰을 사용하는 것으로 워크플로우가 감소되었다. 또한 새로운 화학 워크플로우는 LCMS 기반 분자 네트워킹을 활용하여 빠르고 정확한 시아노톡신 검출을 합니다.이 전략은 오염의 생물 지표로 시아노박테리아의 연구를 허용, 특히 꽃의 존재가 부영양화 과정과 관련이 인류학적 압력에 의해 사용되는 영역 내에서. 이 다분야 전략은 성공적인 구현을 위해 고유한 워크플로우에서 다양한 기술, 기술 및 전문 지식을 결합해야 합니다. 빠른 검출 전략은 유해한 시아노박테리아 꽃으로 인한 건강 공동체 문제를 방지하고 짧은 시간에 넓은 지역을 모니터링하는 데 유용합니다.

early-detection-cyanobacterial-blooms-associated-cyanotoxins-using

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

출처: Chapman, I. J., et al., 유세포 분석을 사용하여 광합성 유기체(Microcystis aeruginosa)의 세포 사망률을 결정하기 위한 분자 프로브 최적화. J. Vis. 경험. (2016년)이 비디오는 형광 프로브 표지와 피코시아닌 자가형광 및 프로브 신호의 유세포 분석을 결합하여 살아있는 세포와 죽은 녹농미세낭 충 세포를 구별하는 방법을 보여줍니다.

유세포 분석을 이용한 Microcystis aeruginosa 의 생존율 분석

이 비디오는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 환경 샘플에서 시아노박테리아 균주를 검출하는 방법을 보여줍니다. 다양한 박테리아를 운반하는 샘플은 인쇄된 항체와 상호 작용하며, 형광단으로 표지된 항시아노박테리아 균주 항체로 면역염색하면 뚜렷한 반점에서 형광을 통해 특정 시아노박테리아 균주의 존재를 확인할 수 있습니다.

항체 마이크로어레이 칩을 이용하여 시아노박테리아 균주를 검출하는 기술

급속한 균 검출 용 라벨없는 광 바이오 센서가 도입된다. 바이오 센서의 표면에 직접 표적 균 세포를 포착하기 위해 디자인 된 나노 다공성 실리콘에 기반하고있다. 우리는 포획 프로브로서, 다공질 변환기에 고정화 된 모노클로 날 항체를 사용한다. 우리의 연구는 (같은 세포 용해와 같은) 더 이전의 샘플 처리와 분 이내에 낮은 세균 농도의 검출에 대해 이러한 바이오 센서의 적용 가능성을 보여줍니다.

의 광학 검출 E. 대장균 박테리아

많은 양의 농업용수에서 식품 매개 병원체의 통합 농도, 농축 및 종말점 비색 검출과 관련된 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.  물은 선택적 또는 비선택성 매체로 농축된 MMS(Modified Moore Swabs)를 통해 여과되며, 검출은 박테리아 표시 비색 기판이 내장된 종이 기반 분석 장치(μPAD)를 사용하여 수행됩니다.

색도계 탐지의 종이 기반의<em&gt; 대장균</em&gt;<em&gt; 살모넬라</em&gt; SPP., 그리고<em&gt; 리스테리아</em&gt; 농업 다량의 물에서

미생물 인구는 전체 동작을 지시 할 수있는 실질적인 세포 이질성가 포함되어 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 분자 프로브 분석 그러나 그것의 응용 프로그램이 종 사이에서 변화, 세포의 생리 학적 상태를 확인할 수 있습니다. 이 연구는 과소 평가하거나 거짓 긍정적 인 결과를 기록하지 않고, 정확하게 cyanobacterium 인구 내에서 세포 사망을 결정하는 프로토콜을 제공합니다.

분자 프로브 최적화 (광합성 생물의 세포 사망을 확인하는 방법<em&gt; Microcystis aeruginosa의</em&gt;) 유동 세포 계측법을 사용하여

사람이 소비하는 담수 저장고에 시아노박테리아 독소가 존재하는 것은 물 관리 당국의 주요 관심사입니다. 수질 오염의 위험을 평가하기 위해 이 문서에서는 항체 마이크로어레이 칩을 사용하여 액체 및 고체 샘플에서 시아노박테리아 균주를 현장에서 검출하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

검출 실험 프로토콜 시아 노 박테리아 항체 마이크로 어레이 칩과 액체 및 고체 시료에

이 프로토콜의 전반적인 목표는 비용 효율적인, 노트북에 대 한 기능 nanosensors을 합성 하 고의 급속 한 탐지는 자석 및 형광 방출 modalities의 결합을 통해 병원 성 박테리아에 특히 표적으로.

E. 콜라이 O157:H7의 Foodborne 병원 체 검사를 사용 하 여 자기 형광 Nanosensor: 신속한 감지

브리 parahaemolyticus 감지 polylactic 산 안정, 금 나노 입자 수정, 모티브로 탄소 전극으로 구성 된 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

Foodborne 병원 체를 검출 하는 전기 화학 DNA 바이오 센서의 개발

MZmine으로 구현 된 진단 조각화 필터링은 알려지거나 알려지지 않은 천연 제품의 전체 클래스에 대 한 LC-MS/MS 데이터 집합을 화면에 제공 하는 우아한, 사후 획득 방식입니다. 이 도구는 분석가가 전체 화합물 클래스에 대 한 진단으로 정의 된 제품 이온 및/또는 중립 손실에 대 한 MS/MS 스펙트럼을 검색 합니다.

LC-MS/MS 진단 조각화 필터링을 통한 천연물 발견: Microcystin 분석을 위한 응용

이 프로토콜은 해수 샘플에서 유해한 조류 꽃과 관련 미생물군유전체를 모니터링하기 위해 16S rRNA 및 18S rRNA 유전자를 대상으로 메타바코딩 분석 단계를 소개합니다. 그것은 강력한 분자 기반 도구이지만 시각적으로 단계별로 여기에 설명되는 몇 가지 절차가 필요합니다.

메타바코딩 분석을 통해 칠레의 유해한 조류 꽃을 모니터링하기 위한 표준화된 절차

학습하세요 시아노박테리아 꽃과 관련된 cyanotoxins의 조기 검출을 위한 빠른 다학제 전략을. 원격 감지, 드론 샘플링, LCMS 분석을 통합하여 24시간 내에 수중 독소를 식별합니다.

빠른 검출 전략을 사용하여 시아노균 꽃과 관련 된 Cyanotoxins의 조기 발견

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