인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포의 빠르게 발전하는 기술에 적합한 방식으로 세포 전기생리학의 고처리량 측정을 제공할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 기존의 패치 클램프 기술보다 덜 복잡하고 노동 집약적이지만 동일한 결과를 생성할 수 있다는 것입니다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포를 사용하는 대규모 독성 스크리닝 프로그램으로 확장될 수 있습니다.

예를 들어, 포괄적인 체외 proarrhythmia 분석이 있습니다. 실험을 위해 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포 배양을 준비하기 위해 24웰 플레이트의 각 웰 내에 150마이크로리터의 1:60 기저막 매트릭스로 개별 10mm 원형 유리 번호 0 커버 슬립을 먼저 코팅하고 섭씨 4도에서 4시간 동안 커버 슬립을 배양합니다. 배양이 끝나면 커버 슬립에서 여분의 매트릭스를 제거하고 각 커버 슬립에 적절한 양의 세포를 적용합니다.

섭씨 37도에서 1시간 후 각 웰에 도금 매체를 조심스럽게 채우고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 전압 민감성 염료 이미징을 준비하려면 도립 에피 형광 현미경에 40x 배율 고개구 렌즈를 장착하고 빠르게 전환되는 웜 화이트 LED를 투과 조명 포트에 연결합니다. 투과광 경로에 간단한 빨간색 660 나노미터 필터를 삽입하고 측광 기록을 위해 빠르게 전환되는 470 나노미터 LED 헤드를 장착합니다.

에피형광 포트에 470/40 여기 필터를 삽입하여 LED에서 생성된 빛을 제거하고, 현미경 내의 미러 유닛 캐러셀에 495나노미터 길이의 빔 스플리터가 포함된 현미경 큐브를 삽입합니다. 조정 가능한 자기장 다이어프램이 포함된 검출 암을 C 마운트 포트에 장착하여 관심 영역을 선택할 수 있도록 하고 PMT 검출기와 USB 카메라를 현미경에 연결합니다. 565 나노미터 길이의 통과 빔 스플리터와 535/50 방출 필터가 포함된 필터 큐브를 PMT 포트에 삽입하여 두 검출기 간에 방출광을 분할합니다.

PMT를 전원 공급 장치 및 PMT 증폭기에 연결하고 PMT 증폭기 출력을 데이터 수집 시스템의 아날로그 입력 핀에 연결합니다. 나이퀴스트(Nyquist) 기준을 충족하고 앨리어싱을 방지하려면 1킬로헤르츠 이상에서 PMT의 아날로그 데이터를 필터링하고, 아날로그 신호에 존재하는 가장 높은 주파수의 두 배 이상의 주파수로 데이터를 디지털화합니다. 전압에 민감한 염료로 셀을 로드하려면 5마이크로리터의 1000x FluoVolt와 50마이크로리터의 전력 부하 용액을 혼합하고 페트리 접시에 3마이크로리터의 데워진 Tyrode 용액에 3마이크로리터의 로딩 용액을 추가합니다.

단일 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 코팅 커버 슬립을 접시에 넣고 접시를 섭씨 37도에서 20분 동안 놓습니다. 가열된 라이브 셀 이미징 챔버를 현미경 스테이지에 장착하고 챔버에 500마이크로리터의 새로운 Tyrode 용액을 채웁니다. 그런 다음 섭씨 37도의 새 Tyrode 용액으로 커버 슬립을 씻고 가는 집게를 사용하여 커버 슬립을 예열된 목욕 챔버로 조심스럽게 옮깁니다.

세포 역학 및 실험 매개변수를 표준화하려면 5mm 간격으로 두 개의 백금 전극을 챔버에 삽입하고 전극을 외부 자극기에 연결합니다. 자극기를 0.5 헤르츠에서 5 밀리초 바이폴라 필드 펄스로 설정하고 세포가 수축하기 시작할 때까지 자극을 1볼트에서 증가시킵니다. 그런 다음 전압을 이 임계값보다 약 25% 높게 설정합니다.

광학 활동 전위를 획득하려면 투과광 경로와 USB 카메라를 사용하여 명시야 조건에서 근세포를 시각화합니다. 분리된 셀을 선택하고 필드 다이어프램을 사용하여 광학 경로를 촘촘하게 자르고 관심 셀의 빛만 모니터링되도록 합니다. PMT 증폭기를 활성화하고 PMT 공급을 750볼트로 설정합니다.

획득 소프트웨어와 함께 자극 프로토콜을 실행하는 동시에 470 나노미터 여기광을 활성화합니다. 10회 스윕을 기록하여 안정적인 활동 전위를 감지할 수 있습니다. 마지막 스윕 후 즉시 현미경 스테이지를 이동시켜 기록하는 동안 세포가 없는 영역에서 배경 신호를 잠시 획득하고 여기광을 끕니다.

활동전위 데이터를 분석하려면 적절한 분석 소프트웨어에서 저장된 기록을 열고 단일 세포에서 유도된 활동전위를 포함하는 평균 10회 스윕을 수행합니다. 평균 트레이스에서 형광 오프셋을 나타내는 기준선 신호의 평균을 뺀 다음, 공식을 사용하여 이완기 형광을 F0로 사용하여 형광의 변화를 계산합니다. 관심 있는 이완기 및 활동 전위 영역을 식별하고 50% 및 90% 재분극 기간을 포함하되 이에 국한되지 않는 원하는 심장 활동 전위 매개변수를 측정합니다. 그런 다음 이 단일 셀의 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보냅니다.

이 방법을 사용하면 재분극 역학을 빠르고 정확하게 정량화할 수 있으며, 이를 통해 세포 이온 이상에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 뚜렷한 1상 특징은 쥐 심근세포의 광학 신호에서 관찰될 수 있으며, 이는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포의 신호와 형태학적으로 구별됩니다. 또한, 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포는 L형 칼슘 채널 길항제로 알려진 니페디핀(nifedipine)의 약리학적 조작에 반응합니다.

지속적인 약물 적용 중 90% 재분극에서 활동 전위 지속 시간이 41.5% 감소하는 것이 관찰되었으며, 이는 전향적 고처리량 심장 약물 스크리닝 연구를 위한 플랫폼으로서 형광 전압 표시기 기반 이미징의 기능을 시사합니다. 이 연구에 사용된 전압 민감성 염료는 다른 염료보다 세포 독성이 적지만 여기광은 세포 생존력을 보존하기 위해 여전히 드물게 사용해야 한다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 변조 측광 장비는 매우 다재다능합니다.

예를 들어, 세포 내 칼슘과 같은 다른 전기 생리학적 매개변수를 동시에 측정하는 데 사용할 수 있습니다.