in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

이 프로토콜은 종양-면역 세포 누화를 시각화 및 모니터링하고 항암 치료의 효과를 분석하기 위해 마이크로 장치에서 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 수행하는 실험 설정을 제공합니다. 이 기술은 면역 세포 모집 및 상호 작용에 대한 실시간의 쉬운 시각화를 제공하며 인간 및 환자 유래 샘플에 사용할 수 있습니다. 대부분의 최첨단 현미경과 호환됩니다.

이 절차를 시연하는 것은 종양학 및 분자 의학과의 박사 과정 학생인 Francesco Noto, Istituto Superiore di Sanita, Universita Cattolica del Sacro Cuore의 박사 과정 학생인 Nicoleta Manduca 및 Esther Maccafeo, 중개 의학 및 외과 부서입니다. 칩은 이전에 클린룸의 플라즈마 클리너 또는 반응성 철 에칭 기계에서 플라즈마 활성화되었습니다. 쥐-비장 세포 및 종양 세포주는 텍스트에 설명된 프로토콜을 모방하기 위해 여기에서 사용됩니다.

셀 현탁액을 적재하기 전에 6개의 저장소 모두에서 배지를 빼냅니다. 그런 다음 1 x 10을 왼쪽 상단 저장소 및 하부 우물에서 10 내지 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 5번째 종양 세포에 천천히 로딩합니다. 오른쪽에, 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 6번째 부유 면역 세포를 1 x 10 2개의 웰로 부드럽게 피펫팅한다.

모든 세포가 추가되면 각 칩의 6개 저장소를 모두 최대 100-150마이크로리터의 성장 배지로 채우고 세포가 각 배양 구획 내에 올바르게 분포되었는지 확인합니다. 타임랩스 기록 전에 시스템이 안정화될 수 있도록 칩을 1시간 동안 배양합니다. 생세포 이미징의 경우 현미경 스테이지의 칩 플레이트에 종양 면역을 장착합니다.

Incucyte Live-Cell Analysis Software와 같은 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 획득 워크플로우 설정을 사용자 정의할 수 있습니다. 관찰 기간, 최적의 프레임 속도 및 지속 시간을 실험에 적합한 매개변수 및 연구 중인 세포 유형에 따라 선택합니다. 적절한 실험 기간 동안 세포를 이미지화합니다.

콜드 팁을 사용하여 두 가지 실험 조건에 대해 약물 또는 약물 조합을 포함하는 배지로 희석된 마트리겔 2개의 분취량을 준비합니다. 부드럽게 피펫 라이브 호환 형광 염료 염색 종양 세포를 얼음 위의 매트릭스 용액에 현탁하여 세포의 균질한 분포를 얻습니다. 칩 플레이트를 냉각 블록 또는 얼음이 담긴 바구니에 놓고 차가운 10마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 약물 처리된 종양 세포 매트릭스 용액을 왼쪽 및 오른쪽 겔 포트에 천천히 주입합니다.

부드러운 압력을 가하여 매트릭스 용액을 채널의 한쪽에서 다른 쪽으로 밀어 넣습니다. 모든 종양 세포가 로드되면 장치를 30분 동안 똑바로 세운 상태로 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 매트릭스 겔화가 완료되면 6개 저장소 모두의 배지 채널을 50마이크로리터의 배양 배지로 채웁니다.

중합된 겔 무결성 및 종양 세포 분포를 현미경으로 확인합니다. 그런 다음 면역 세포 준비가 완료 될 때까지 칩을 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, 각 웰로부터 배지를 흡인한다.

중간 중간 중간 채널의 입구 근처에 팁을 놓고 적당한 압력을 사용하여 대조 형광 염료로 표지된 6번째 면역 세포에 10마이크로리터의 10을 부드럽게 주입합니다. 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 4개의 측면 채널 웰 각각에 주입하고, 40 내지 90 마이크로리터의 배지를 상부 중앙 웰에, 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 하부 중앙 웰에 주입한다. 모든 웰이 로드되면 현미경을 사용하여 면역 세포 분포가 중앙 챔버에 국한된 상태로 유지되었는지 확인합니다.

그런 다음 이미징될 때까지 세포 배양 인큐베이터의 평평한 표면에 장치를 조심스럽게 놓습니다. 종양 구획에 침투하는 형광 염색 살아있는 면역 세포의 정도를 계산하려면 형광 현미경으로 특정 관심 지점에서 장치를 이미지화하고 Nikon NIS-Elements와 같은 현미경 이미징 소프트웨어에서 적절한 카메라 매개변수를 설정합니다. 또한 표지 된 면역 세포에 대한 매개 변수를 설정하십시오.

미세유체 플랫폼에 적절하게 구축된 마이크로채널 브리지를 통한 백혈구의 표적 세포 이동은 비디오 현미경으로 추적할 수 있습니다. 이 추적 분석에서 개별 PBMC는 죽어가는 독소루비신 치료 또는 살아있는 PBS 처리 암세포로 인해 챌린지되었습니다. 관련 화학주성 값 및 이동 플롯이 자동으로 생성되었으며, 독소루비신 또는 PBS에 노출된 유방암 세포와 함께 로드될 때 면역 세포에 대한 다른 이동 프로파일이 관찰되었습니다.

PBMC가 세포 사멸 암세포와 마주했을 때, 그들은 죽어가는 세포와 죽은 세포를 향해 마이크로 채널을 건넜지만 처리되지 않은 살아있는 세포로 교차하지는 않았습니다. 24 내지 48 시간에 걸쳐 밀도가 증가한 백혈구의 분획은 독소 처리 된 암세포와 장기간 접촉을 나타냈다. 이 분석에서는 후성유전학적 약물의 항암 조합에 대한 반응으로 면역 세포의 모집을 정량화하기 위해 새로운 3D 면역적격 종양 모델을 사용했습니다.

이어서, 적색 염료 표지된 PBMC를 중앙 유체 챔버 내로 균질하게 분배하였다. 그런 다음 PBMC를 유인하는 두 종양 덩어리의 능력을 비교했으며, 이 실험에서 PBMC를 오른쪽 마이크로채널로 강력하게 모집했습니다. 3D 모델의 경우 용액을 하이드로겔 및 얼음 위의 세포와 혼합하여 기포와 사전 중합을 방지합니다.

과도한 압력없이 천천히 주입하십시오. 사용된 매트릭스에 따라 중합 단계를 조정합니다. 상층액에서 생/사멸 세포 분석 및 사이토카인 분비 프로파일링을 구현할 수 있습니다.

컨포칼 이미징을 위한 면역형광은 면역 아형을 분류하고 활성화 및 고갈 성숙의 발현 마커에 대해 수행할 수 있습니다.