Name: in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 배우세요 미세유체 공동 배양 모델을 활용하여 2D 및 3D 종양-면역 세포 상호작용을 실시간으로 시각화하고 항암 치료 효과를 분석하는 방법을. 환자 유래 샘플에도 적용 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 공개 할 것이 없습니다. AS는 Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 # 18418) 및 Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273)의 지원을 받고 있습니다. GS 및 FM은 이탈리아 암 연구 협회(AIRC) 번호 21366에서 GS의 지원을 받습니다.

설명된 방법은 보다 관련성이 높은 시험관 내 모델의 채택으로 이점을 얻을 수 있는 종양 면역학 분야의 두 가지 중요한 측면을 조정 가능한 복잡성으로 요약하기 위한 일반적인 접근 방식을 설계하려고 합니다. 첫 번째는 종양 세포 집단 측면과 관련이 있으며, 단일 세포 특성을 다루면 치료에 대한 내성, 전이에 대한 성향, 줄기 세포 및 분화 등급을 포함하여 이질성과 상관관계가 있는 생물학적 및 임상적 중요성에 대한 더 나은 설명으로 이어질 수 있습니다. 이야기의 다른 측면은 질병의 특성과 치료63, 특히 면역 요법에 대한 개인의 반응을 심오하게 형성할 수 있는 비암성 구성 요소(면역 및 기질 세포, 혈관) 및 화학적/물리적 환경(ECM 구성 요소, 케모카인 및 기타 용해성 인자 방출)을 포함하는 TME로 대표됩니다. 설명된 접근 방식을 다른 연구 분야로 내보내려면 새로운 모델의 개발 및 채택으로 인한 한계와 과제에 대한 깊은 이해가 필요합니다.
<p class="jove_content...

실험 분야로서의 다양한 의학 분야의 진화는 통제된 조건 하에서 세포 집단과 장기 기능을 조작하는 능력에 달려 있다1. 이러한 능력은 우리 몸에서 일어나는 과정을 요약할 수 있는 측정 가능한 모델의 가용성에 뿌리를 두고 있습니다.
면역요법 및 단세포 게놈 프로파일링 2의 시대에, 암 생물학은 적절한 시공간적 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위해 새로운 시험관 내 및 전산 모델을 활용해야 합니다 2,3.
종양미세환경4(TME)는 암세포가 다른 세포(면역, 기질 및 내피 세포) 및 비세포(세포외 기질, ECM) 구성 요소와 지속적으로 상호 작용하고 동적으로 공동 진화하는 복잡한 조직입니다. 이 복잡한 환경의 역동적인 특성은 면역 세포가 악성 세포의 친구 역할을 하는지 아니면 적으로 작용하는지 여부를 결정하여 질병 진행과 치료에 대한 반응 모두에 큰 영향을 미칩니다. 오늘날, 종양 면역학자, 생물 정보학자 및 시스템 생물학 전문가들의 많은 노력이 공간(즉, 뚜렷한 종양 영역)과 시간(즉, 뚜렷한 종양 진행 단계)5,6에서 암 이질성5,6의 임상적 중요성을 다루고, 단일 세포 수준에서 암과 면역 세포 표현형과 기능을 특성화하기 위해 수렴되고 있습니다. 이러한 시너지 효과의 예로서, 진보된 컴퓨터 비전 기술은 이제 조직학적 샘플에서 면역 침윤물의 공간 매핑을 위해 일상적으로 사용된다 7,8.
실험 모델의 전면에서 동물 연구와 전통적인 체외 방법을 연결하는 미세 유체 공학 및 공동 배양 기술의 발전은 오가노이드, 미세 생리학적 시스템 9,10,11(MPS) 및 장기 칩12,13,14과 같은 다양한 종류의 미세 공학 세포 모델에 대한 액세스를 제공합니다 (OOC)입니다. 이들은 세포 생태계에 대한 '큰 그림'을 확대하고 미시 환경 요인을 제어하기 위해 체외 잠재력을 확장하는 동시에 고함량 현미경15 및 이미지 처리 접근 방식을 활용하는 공통된 특성을 공유합니다.
오늘날 최첨단 MPS 및 OOC 시스템은 염증성 질환, 상처 치유, 점막 면역, 독소 또는 일상 식품에 대한 반응과 같은 다양한 과정을 탐색하고 측정하기 위해 기존 조직 및 공동 배양에 다양한 면역 세포 하위 유형을 통합하는 면역학적 측면을 포함하기 시작했습니다16. TME-on-a-chip 모델 10,11,12,13,14,15,16,17은 또한 관류 가능한 미세 혈관 18,19,20,21과 통합되어 세포 유형 의존적 상호 작용, 물리적 및 화학적 섭동 및 세포 독성 활성을 조사하기 위해 개발되었습니다. 침윤성 림프구22 및 임상적으로 관련된 면역조절제23.
여기에서는 칩에 세포를 로딩하는 것부터 이미지 처리 도구에 이르기까지 다양한 프로토콜을 제공하여 2D(섹션 1) 및 3D(섹션 2) 설정(16)에서 고급 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하며, 동적 다중 매개변수24 모니터링 및 세포 기능 시각화와 호환됩니다. 이는 샘플 관리 및 데이터 분석 모두에서 사용 용이성과 유연성을 유지하여 피지 프리웨어 소프트웨어와 해당 도구 상자25,26을 활용하여 달성됩니다.
섹션 1에 설명된 미세유체 장치는 부착성 암과 부유 면역 세포의 2D 공동 배양을 수행하도록 설계되었습니다. 이 플랫폼은 유전적 돌연변이27 및/ 또는 면역 결핍28의 존재 하에서 면역 세포 행동의 시험관 내 측정을 위해 검증되었다. 여기에서는 Trackmate(피지 소프트웨어에 구현된 플러그인)를 기반으로 하는 반자동 방법을 활용하여 타임랩스 명시야 이미지에서 면역 세포를 추적하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 면역원성 세포 사멸 유도제( 27 )로 치료되거나 치료되지 않은 표적 암세포에 대한 면역 이동(29) 및 반응(즉, 상호작용 시간)의 운동학적 설명자의 추출을 가능하게 한다.
중요한 것은 시계열 이미지에서 추출된 이러한 매개변수가 고급 수학 기계로 처리될 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 잠재력에 대한 예로서, 우리 그룹은 최근 확률 론적 과정과 통계 역학의 수학적 방법을 기반으로 한 분석을 발표하여 세포 네트워크 속성을 모델링하고 면역 세포 행동에 대한 매개 변수화 된 설명을 제공합니다 (즉, 편향되거나 상관 관계가 없는 랜덤 워크, 고도로 조정되거나 조정되지 않은 움직임30,31).
두 번째 섹션에서 제공되는 3D 설정은 공동 배양 프로토콜을 기반으로 하여 서로 다른 세포 유형과 약물 조합을 사용하여 두 개의 겔 영역에 내장된 보다 복잡한 면역 적격 TME를 경쟁력 있는 방식으로 재현합니다. 여기서, 이미지 처리 단계는, 상이한 시점에서, 마트리겔 내에서 배양된 인간 A375M 흑색종 세포에서 염색된 면역 세포의 침윤을 측정하여, 항종양제 조합을 평가하기 위한 것이다32. A375M 계통은, 고도의 전이성 표현형을 특징으로 하는 A375P 유래 세포주를 면역세포의 존재 하에서 이들의 전이능을 평가하기 위해 선택하였다32.
기술된 모델은 상이한 세포 공급원(쥐 및 인간 불멸화 또는 1차 세포주, 오가노이드, 이종이식 등)과 완전히 호환될 수 있다. 우리 연구실의 최근 연구에서, 고함량 비디오 현미경과 이미지 분석을 결합하여, 경쟁력 있는 3D 레이아웃을 적용하여 조사하였다: i) 항종양성(항체 의존성 세포 매개 세포독성, ADCC) 면역 반응 및 HER2+ 유방암 온칩 모델33에서 트라스투주맙 요법에 대한 내성에서 섬유아세포의 역할 해부; ii) 종양 회피 및 T 세포 모집 메커니즘에서 골수 세포(즉, 암 관련 대식세포)의 작용34; iii) 콜라겐 매트릭스에서 약물 처리된 결장암 세포로 배양된 인터페론-α 조절 수지상 세포(IFN-DC)를 기반으로 하는 면역요법 요법의 효능 및 효율적인 운동 및 후속 식균 작용 사건을 평가하기 위한35; iv) 골수 유래 호산구의 IL-33 처리 또는 처리되지 않은 흑색종 세포로의 화학주성 이동36.
이러한 고급 모델은 암 전이 및 내성 메커니즘에서 면역 조직 구성의 역할을 이해하기 위한 관찰 창 역할을 할 수 있지만, 연구 결과를 임상으로 변환하여 기초 연구와의 격차를 좁히기 위한 노력이 필요합니다37.
새로운 시나리오로서, 보다 생리학적으로 관련성이 높은 마이크로시스템의 사용과 결합된 자동화된 고함량 현미경의 기능을 활용하는 것은 단일 실험 캠페인에서 생성할 수 있는 수백, 수천 기가바이트의 다중 매개변수 데이터를 처리, 처리 및 해석하는 데 있어 새로운 잠재적 과제를 제시하고 있습니다. 이는 OOC 실험과 인공 지능 38,39,40,41,42 (AI) 기반 알고리즘 모두의 직접적인 연결을 의미하며, 고급 자동화 분석 및 암-면역 상호작용의 인실리코 모델(in silico model)을 차례로 공급할 수 있는 특징의 생성(43)과 예측 약물 스크리닝 분석(predictive drug screening assay)44의 개발과 같은 흥미진진한 새로운 응용 분야가 지평선에 있습니다.
끊임없이 확장되는 노력의 흐름은 단일 세포 다중 오믹스 판독을 통해 대규모 섭동 스크리닝을 구현하기 위한 전략의 최적화와 함께 질병 모델의 설계에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 의심할 여지 없이 면역 장애 및 암 전파 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 체계적인 onco-immunology-on-a-chip 접근 방식의 적절한 수준의 방법 표준화와 함께 임상 구현에 도움이 될 것입니다.

<table><tbody><tr><td><강>세포 배양 재료&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL 튜브</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>CLS430828</td><td>원심분리 튜브</td></tr><tr><td>5-aza-2'-deoxycytidine DAC</td><td>Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>A3656</td><td>DNA-하이포메틸화제</td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO</td><td>CLS3506</td><td>배양 접시</td></tr><tr><td>75cm2 세포 배양 처리 플라스크</td><td>Corning, New York, NY</td><td>430641U</td><td>배양 플라스크</td></tr><tr><td>A365M</td><td>American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA</td><<td>br/> CVCL_B222</td><td>인간 흑색종 세포주</td></tr><tr><td>독소루비신 염산염</td><td>Millipore-Sigma; 세인트루이스, MO</td><td>D1515</td><td>안트라사이클린 항생제&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM</td><td>EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아</td><td>ECM0728L</td><td>SK-MEL-28&nbsp; 세포용 배양 배지</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium</td><td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td><td>ECB4004L</td><td>Saline Buffer solution</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td><td></td><td>ECS0180L 세포 배양</td></tr><tr><td>보조 Ficoll</td><td>GE-Heathcare</td><td>17-1440-02</td><td>인간 혈액에서 단핵 세포 분리.&nbsp;</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Neubauer</td><td></td><td>세포 계수</td></tr>기 <tr><td>Heparinized 바이알</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>정맥혈 채취</td></tr><tr><td>용 바이알 인터페론 알파 -2b</td><td>Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리</td><td>SRP4595</td><td>재조합 인간 사이토 카인</td></tr><tr><td>L-Glutamine 100X</td><td>EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아</td><td>ECB3000D</td><td>세포 배양 보조</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>림프폴라이트 세포 분리 매체</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, Canada</td><td></td><td>밀도 구배 원심분리에 의한 림프구 분리</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning, New York, NY</td><td>354230</td><td>성장 인자 감소 기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>MDA-MB-231&nbsp;</td><td>American Type Culture Collection(ATCC), 버지니아주 매너서스</td><td>&nbsp; HTB-26</td><td>인간 유방암 세포주</td></tr><tr><td>페니실린/ 스트렙토마이신 100X&nbsp; &nbsp;</td><td>EuroClone Spa, Milan, Italy</td><td>ECB3001D</td><td>세포 배양 보조</td></tr><tr><td>피펫 에이드</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>4-000-201</td><td>액체 처리</td></tr><tr><td>PKH26 적색 형광 세포 링커</td><td>Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리</td><td>PKH26GL</td><td>녹색 형광 세포</td></tr><tr><td>염료 PKH67 녹색 형광 세포 링커</td><td>Millipore-Sigma; 세인트루이스, 미주리</td><td>PKH67GL</td><td>녹색 형광 세포 염료</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>EuroClone Spa, 밀라노, 이탈리아</td><td>ECM2001L</td><td>MDA-MB-231 세포</td></tr> 혈청학적 피펫용 배양 배지<tr><td>(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis,</td><td>MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490</td><td>액체 취급</td></tr><tr><td>멸균 팁 (1-10 &mu; L, 10-20 &mu; L, 20-200 &mu; L, 1000 &뮤; L)</td><td>EuroClone Spa, 이탈리아 밀라노</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td>마이크로피펫</td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr>를 위한 ECTD01005 팁 <tr><td>Trypan Blue 솔루션</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., 매사추세츠주 월섬</td><td>15250061세포</td><td>생존율 평가를 위한 세포 염색</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>EuroClone Spa, 이탈리아 밀라노</td><td>ECM0920D</td><td>부착 세포</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>용 해리 시약<tr><td><강력>세포 배양 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOS-FL 형광 현미경</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td></td><td>살아있는 세포용 형광 현미경</td></tr><tr><td>Humified cell culture incubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA</td><td>311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230</td><td>37 &deg에서 세포 배양의 배양; C, 5% CO2</td></tr><tr><td>Juli 현미경</td><td>Nanoentek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 냉장고 (4 &deg; C)</td> <td>FDM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실험실 안전 캐비닛 (클래스 II)</td> <td>멸균 VBH 72 MP</td><td></td><td>층류 후드</td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 가능한 원심 분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 수조</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>< 강>미세 가공 재료&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3648</td><td>실란화 제제는 PDMS를 플라스틱 커버슬립에 접착하기 위한 것입니다</td></tr>. <tr><td>크롬 석영 마스크 / 4"x4", HRC / AZ 없음&nbsp;</td><td>MB 승& 에이,&nbsp; 독일</td><td></td><td>포토리소그래피용 광학 마스크</td></tr><tr><td>유리 커버슬립, D 263 M Schott 유리,&nbsp; (170 &plusmn; 5 &마이크로; m)</td><td>Ibidi, Germany</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>수소 과산화물 용액 30%</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>412081</td><td>피라냐 용액용 시약</td></tr><tr><td>메틸 이소부틸 케톤</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>461945</td><td>PMMA 전자 빔 레지스트 개발자</td></tr><tr><td>현미경 유리 슬라이드 (50개 슬라이드 팩) 76.2 mm x 25.4 mm&nbsp;</td><td>Sail Brand</td><td>7101</td><td>칩 본딩용 기판</td></tr><tr><td>플런저가 있는 Miltex 생검 펀치, 칩 저장소용 ID 1.0mm</td><td>Tedpella</td><td></td><td>피부 생검 펀치</td></tr><tr><td>PMMA&nbsp; 950 kDa</td><td>Allresist, Germany</td><td>AR-P. 679.04</td><td>광학 마스크 패터닝을 위한 포지티브 전자 레지스트</td></tr><tr><td>폴리머 처리되지 않은 커버슬립</td><td>Ibidi, Germany</td><td>10813</td><td>칩 본딩용 기판</td></tr><tr><td>프라임 CZ-Si Wafer,&nbsp; 4", (100), Boron Doped</td><td>Gambetti Xenologia Srl, Italy</td><td>30255</td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Carlo Erba 시약</td><td>415238</td><td></td></tr><tr><td>프로필렌 글리콜 모노메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>484431-4L</td><td>SU-8 레지스트 개발자</td></tr><tr><td>SU-8 3005</td><td>마이크로 레지스트 기술, 독일</td><td>C1.02.003-0001</td><td>네거티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>마이크로 레지스트 기술, 독일</td><td>C1.02.003-0005</td><td>네거티브 포토레지스트</td></tr><tr><td>바이오 펀치 제품군, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm</td><td>Tedpella</td><td>15111-40, 15111-60, 15111-80</td><td>칩 저장소 용 피부 생검 펀치</td></tr><tr><td>황산 96 %</td> <td>Carlo Erba 피</td><td>라냐 용액</td>용 시약 <td>410381</td> 시약</tr><tr><td>SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트</td><td>Dowsil, 다우 코닝</td><td>11-3184-01</td><td>실리콘 엘라스토머 (PDMS)</td></tr> <tr><td>트리메틸 클로로 실란 (TMCS)</td> <td>SU-8 패턴 마스터</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 용 시그마 알드리치 92360-100ML 실란화 제 <tr><td>< 강>미세 가공 장비 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 kV 전자 빔 리토그래</td>피 <td>Raith-Vistec EBPG 5HR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>핫 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>광학 리토그래피 시스템</td><td>EV-420 양면 접촉 마스크 정렬기</td><td></td><td></td></tr><tr><td>반응성 이온 에칭 시스템</td><td>Oxford plasmalab 80 plus 시스템</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 건조기</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

복잡한 질병 모델에는 생리학적, 병리학적으로 관련성이 있고 실행 가능한 통찰력을 제공하고 다른 방법으로는 보이지 않는 프로세스를 공개할 수 있는 최첨단 도구가 필요합니다. 생체 내 풍경을 밀접하게 모방한 고급 세포 분석은 암의 진행에 영향을 미치는 양방향 종양-숙주 상호작용을 시각화하고 측정하는 새로운 방법으로 자리 잡고 있습니다. 여기에서는 자연 및 치료 유발 면역 감시 하에서 종양 미세 환경(TME)의 복잡성을 모방하여 마이크로 장치에서 고도로 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 재현하는 두 가지 다목적 프로토콜에 대해 설명합니다. 섹션 1에서는 명시야 타임랩스 현미경으로 부착 종양 세포와 부유 면역 집단 간의 누화를 모니터링하기 위한 실험 설정이 제공됩니다. 적용 시나리오로서, 우리는 면역 세포의 모집 및 활성화에 대한 소위 면역 원성 암세포 사멸 유도제와 같은 항암 치료의 효과를 분석합니다. 섹션 2에서는 3D 종양 면역 미세 환경이 경쟁력 있는 레이아웃으로 조립됩니다. 차등 면역 침윤은 최대 72시간의 형광 스냅샷으로 모니터링되어 병용 치료 전략을 평가합니다. 두 설정 모두에서, 과다한 면역 세포 파라미터(예를 들어, 면역 세포 이동 및 상호작용, 치료제에 대한 반응)를 추출하기 위한 이미지 처리 단계가 예시된다. 이러한 간단하고 강력한 방법은 암, 기질 및 면역 세포 아형의 이질성과 가소성뿐만 아니라 암 진화의 동인으로서의 상호 상호 작용을 포함하는 TME의 복잡성을 시뮬레이션하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있습니다. 빠르게 진화하는 기술을 라이브 셀 고함량 이미징과 함께 사용하면 대규모 정보 데이터 세트가 생성되어 새로운 문제가 발생할 수 있습니다. 실제로 삼각형 ''공동 배양/현미경/고급 데이터 분석'은 맞춤형 치료 프로토콜을 지원할 수 있는 정확한 문제 매개변수화를 향한 경로를 설정합니다. 우리는 고처리량 처리를 위한 인공 지능과 암 면역 온어칩의 향후 통합이 정밀 및 개인화된 종양학을 위한 예측 및 전임상 도구로서의 기능을 활용하는 데 있어 큰 진전을 이룰 것으로 기대합니다.

종양 면역 침윤은 숙주 항종양 반응의 파라미터이다. 종양은 침윤 백혈구의 구성, 밀도, 위치 및 기능적 상태에서 이질적이며, 암세포와의 상호 작용은 질병 경과 및 치료에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 관련된 정보의 기초가 될 수 있습니다. 이러한 의미에서 미세유체 기술은 종양의 면역 조직을 탐색하고 항암 요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 보완적이고 특권적인 체외 도구로 사용될 수 있습니다. 미세유체 분석, 생세포 이미징 및 추적 소프트웨어의 결합은 면역 세포가 다양한 맥락에서 이동 패턴을 조정하는 방법을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 정량화 방법을 확립할 수 있습니다. 이 장에서는 표준 소프트 리소그래피 절차로 실현된 임시 미세 유체 장치에서 면역 및 표적 암세포의 다목적 2D 또는 3D 공동 배양을 설정하는 단계를 보고했습니다. 섹션 1에서는 부착성(MDA-MB-231 암세포)과 비부착성(PBMC) 집단 간의 화학적 및 물리적 접촉을 허용하기 위해 미세유체 장치를 사용했습니다. 일부 화학요법제(예를 들어, 다른 것...

면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

이 프로토콜은 종양-면역 세포 누화를 시각화 및 모니터링하고 항암 치료의 효과를 분석하기 위해 마이크로 장치에서 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 수행하는 실험 설정을 제공합니다. 이 기술은 면역 세포 모집 및 상호 작용에 대한 실시간의 쉬운 시각화를 제공하며 인간 및 환자 유래 샘플에 사용할 수 있습니다. 대부분의 최첨단 현미경과 호환됩니다.이 절차를 시연하는 것은 종양학 및 분자 의학과의 박사 과정 학생인 Francesco Noto, Istituto Superiore di Sanita, Universita Cattolica del Sacro Cuore의 박사 과정 학생인 Nicoleta Manduca 및 Esther Maccafeo, 중개 의학 및 외과 부서입니다. 칩은 이전에 클린룸의 플라즈마 클리너 또는 반응성 철 에칭 기계에서 플라즈마 활성화되었습니다. 쥐-비장 세포 및 종양 세포주는 텍스트에 설명된 프로토콜을 모방하기 위해 여기에서 사용됩니다.셀 현탁액을 적재하기 전에 6개의 저장소 모두에서 배지를 빼냅니다. 그런 다음 1 x 10을 왼쪽 상단 저장소 및 하부 우물에서 10 내지 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 5번째 종양 세포에 천천히 로딩합니다. 오른쪽에, 50 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁된 6번째 부유 면역 세포를 1 x 10 2개의 웰로 부드럽게 피펫팅한다.모든 세포가 추가되면 각 칩의 6개 저장소를 모두 최대 100-150마이크로리터의 성장 배지로 채우고 세포가 각 배양 구획 내에 올바르게 분포되었는지 확인합니다. 타임랩스 기록 전에 시스템이 안정화될 수 있도록 칩을 1시간 동안 배양합니다. 생세포 이미징의 경우 현미경 스테이지의 칩 플레이트에 종양 면역을 장착합니다.Incucyte Live-Cell Analysis Software와 같은 현미경 소프트웨어 인터페이스에서 획득 워크플로우 설정을 사용자 정의할 수 있습니다. 관찰 기간, 최적의 프레임 속도 및 지속 시간을 실험에 적합한 매개변수 및 연구 중인 세포 유형에 따라 선택합니다. 적절한 실험 기간 동안 세포를 이미지화합니다.콜드 팁을 사용하여 두 가지 실험 조건에 대해 약물 또는 약물 조합을 포함하는 배지로 희석된 마트리겔 2개의 분취량을 준비합니다. 부드럽게 피펫 라이브 호환 형광 염료 염색 종양 세포를 얼음 위의 매트릭스 용액에 현탁하여 세포의 균질한 분포를 얻습니다. 칩 플레이트를 냉각 블록 또는 얼음이 담긴 바구니에 놓고 차가운 10마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 약물 처리된 종양 세포 매트릭스 용액을 왼쪽 및 오른쪽 겔 포트에 천천히 주입합니다.부드러운 압력을 가하여 매트릭스 용액을 채널의 한쪽에서 다른 쪽으로 밀어 넣습니다. 모든 종양 세포가 로드되면 장치를 30분 동안 똑바로 세운 상태로 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 매트릭스 겔화가 완료되면 6개 저장소 모두의 배지 채널을 50마이크로리터의 배양 배지로 채웁니다.중합된 겔 무결성 및 종양 세포 분포를 현미경으로 확인합니다. 그런 다음 면역 세포 준비가 완료 될 때까지 칩을 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, 각 웰로부터 배지를 흡인한다.중간 중간 중간 채널의 입구 근처에 팁을 놓고 적당한 압력을 사용하여 대조 형광 염료로 표지된 6번째 면역 세포에 10마이크로리터의 10을 부드럽게 주입합니다. 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 4개의 측면 채널 웰 각각에 주입하고, 40 내지 90 마이크로리터의 배지를 상부 중앙 웰에, 50 내지 100 마이크로리터의 배지를 하부 중앙 웰에 주입한다. 모든 웰이 로드되면 현미경을 사용하여 면역 세포 분포가 중앙 챔버에 국한된 상태로 유지되었는지 확인합니다.그런 다음 이미징될 때까지 세포 배양 인큐베이터의 평평한 표면에 장치를 조심스럽게 놓습니다. 종양 구획에 침투하는 형광 염색 살아있는 면역 세포의 정도를 계산하려면 형광 현미경으로 특정 관심 지점에서 장치를 이미지화하고 Nikon NIS-Elements와 같은 현미경 이미징 소프트웨어에서 적절한 카메라 매개변수를 설정합니다. 또한 표지 된 면역 세포에 대한 매개 변수를 설정하십시오.미세유체 플랫폼에 적절하게 구축된 마이크로채널 브리지를 통한 백혈구의 표적 세포 이동은 비디오 현미경으로 추적할 수 있습니다. 이 추적 분석에서 개별 PBMC는 죽어가는 독소루비신 치료 또는 살아있는 PBS 처리 암세포로 인해 챌린지되었습니다. 관련 화학주성 값 및 이동 플롯이 자동으로 생성되었으며, 독소루비신 또는 PBS에 노출된 유방암 세포와 함께 로드될 때 면역 세포에 대한 다른 이동 프로파일이 관찰되었습니다.PBMC가 세포 사멸 암세포와 마주했을 때, 그들은 죽어가는 세포와 죽은 세포를 향해 마이크로 채널을 건넜지만 처리되지 않은 살아있는 세포로 교차하지는 않았습니다. 24 내지 48 시간에 걸쳐 밀도가 증가한 백혈구의 분획은 독소 처리 된 암세포와 장기간 접촉을 나타냈다. 이 분석에서는 후성유전학적 약물의 항암 조합에 대한 반응으로 면역 세포의 모집을 정량화하기 위해 새로운 3D 면역적격 종양 모델을 사용했습니다.이어서, 적색 염료 표지된 PBMC를 중앙 유체 챔버 내로 균질하게 분배하였다. 그런 다음 PBMC를 유인하는 두 종양 덩어리의 능력을 비교했으며, 이 실험에서 PBMC를 오른쪽 마이크로채널로 강력하게 모집했습니다. 3D 모델의 경우 용액을 하이드로겔 및 얼음 위의 세포와 혼합하여 기포와 사전 중합을 방지합니다.과도한 압력없이 천천히 주입하십시오. 사용된 매트릭스에 따라 중합 단계를 조정합니다. 상층액에서 생/사멸 세포 분석 및 사이토카인 분비 프로파일링을 구현할 수 있습니다.컨포칼 이미징을 위한 면역형광은 면역 아형을 분류하고 활성화 및 고갈 성숙의 발현 마커에 대해 수행할 수 있습니다.

microfluidic-co-culture-models-for-dissecting-immune-response-in

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를...

종양 Microenvironment를 재현을위한 마이크로 유체 장치<em&gt; 체외에서</em

이 동영상은 3차원 종양 스페로이드와 T 세포 공동 배양을 확립하는 방법을 보여줍니다. 종양 스페로이드를 함유하는 마이크로웰이 있는 아가로스 캐스트를 준비한 후 T 세포를 첨가합니다. 배양 후 이 설정을 통해 통제된 3차원 환경에서 T 세포와 종양 스페로이드의 상호 작용을 연구할 수 있습니다.

종양 스페로이드에 침투하는 T 세포의 3차원 공동 배양 모델

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

종양 미세환경(TME)을 모방하기 위해 투과성 미다공성 멤브레인 삽입물을 조정했습니다. 이 모델은 혼합 세포 배양으로 구성되며, 형광 태깅 또는 세포 분류를 사용하지 않고 고도로 농축된 개별 세포 집단을 간단하게 생성할 수 있으며, 정상 또는 스트레스 조건에서 TME 내 세포 간 통신을 연구할 수 있습니다.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.

농축 및 설립된 피하 Murine 종양에서 종양 면역 및 비 면역 Microenvironments의 특성

우리는 단일 세포에서 잘 정의 된 환경 조건 내에서 암 역학의 장기 실시간 정량 적 연구를위한 제어 가능한 플랫폼을 제공하는 미세 유체 암 온 칩 모델인 "Evolution Accelerator" 기술을 제시합니다. 수준. 이 기술은 근본적인 연구 또는 전임상 신약 개발을 위한 시험관 내 모델로 작동할 것으로 예상됩니다.

실시간 관찰을 위한 미세 유체 진화 가속기에 암 인구에 걸쳐 이기종 약물 그라데이션의 생성

제시된 접근은 3D 스페로이드 ascy 및 T 세포 세포 독성에 있는 암 세포 침략을 동시에 평가합니다. 스페로이드는 비계가 없는 아가로즈 멀티 마이크로웰 캐스트에서 생성됩니다. I형 콜라겐 매트릭스에 공동 배양 및 포함은 암세포 침입 및 T세포 중재 세포 독성을 모니터링할 수 있는 동일한 장치 내에서 수행된다.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

여기에서는 미세생리학적 시스템에서 콜라겐 및 콜라겐-아가로스 매트릭스를 사용하여 3D 세포 배양을 구현하기 위한 지침을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 신장 근위세뇨관 및 신세포 암 스페로이드 공동 배양을 지원하여 생체 내 조건을 시뮬레이션하고 신장암 세포 상호 작용에 대한 고급 조사를 가능하게 합니다.

신장암 진행을 모델링하기 위한 건강한 신장과 종양 상피의 미세유체 공동 배양

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

배우세요 미세유체 공동 배양 모델을 활용하여 2D 및 3D 종양-면역 세포 상호작용을 실시간으로 시각화하고 항암 치료 효과를 분석하는 방법을. 환자 유래 샘플에도 적용 가능합니다.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

더 많은 동영상 탐색