October 29th, 2020
이 프로토콜의 목표는 Drosophila 애벌레에서 기계적 고치에 대한 향상된 분석법을 수행하는 방법을 보여주는 것입니다. 우리는 기계적 과민성 (알로디니아 및 과민증)이 Drosophila 애벌레에 존재한다는 것을 보여주기 위하여 여기에서 분석기를 이용합니다.
이 프로토콜은 사용자가 유전적으로 다루기 쉬운 초파리 유충에서 기계적 통각 반응을 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있는 도구를 구축할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 간단한 재료를 사용하여 하위 임계값에서 완전히 반응하는 범위까지 기계적 통각을 측정하는 데 사용할 수 있는 맞춤형 도구를 구축한다는 것입니다. 이러한 도구와 방법은 부상 또는 질병 후 기준선 기계적 통각 및 통각 민감성을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
맞춤형 필라멘트로 유충을 조사하려면 연습이 필요합니다. 사용자는 실험을 시도하기 전에 대조군 유충으로 용량-반응 곡선을 생성할 수 있어야 합니다. 기계식 프로브를 구성하려면 작은 와이어 커터를 사용하여 각 니티놀 필라멘트를 장축에 수직으로 지정된 길이로 자릅니다.
필라멘트는 세 가지 사전 설정된 직경으로 제공됩니다. 실체 현미경으로 필라멘트 끝을 검사하여 유충 피부에 조직 손상을 일으키고 보정을 방해할 수 있는 날카롭거나 불규칙한 모서리가 남아 있지 않은지 확인합니다. 그런 다음 숫돌을 사용하여 날카로운 불규칙성이 지속되지 않을 때까지 프로브의 가장자리를 수동으로 매끄럽게 합니다.
다음으로, 피하 주사 바늘을 사용하여 나무 아이스 캔디 스틱 끝 부분에 구멍을 뚫습니다. 단일 니티놀 필라멘트에 목재 접착제를 바르고 접착제로 코팅된 필라멘트를 바늘 슬롯에 삽입합니다. 접착제가 마르면 프로브가 구부러질 때까지 프로브를 눈금에 대고 눌러 그램 단위로 기록할 수 있는 최대 힘을 결정합니다.
공식을 사용하여 기록된 질량을 밀리뉴턴 단위의 힘으로 변환합니다. 그런 다음 측정된 힘을 필라멘트 팁의 표면적으로 나누어 계산된 힘을 압력의 킬로파스칼로 변환합니다. 직경과 길이가 다른 필라멘트를 사용하여 여러 프로브를 준비하면 초파리 유충에 대한 반응 범위에 걸친 전체 세트가 생성됩니다.
실험을 위해 초파리 유충을 준비하려면 섭씨 25도의 인큐베이터에서 표준 사료로 유충 자손을 약 96시간 동안 키웁니다. 유충이 세 번째 인스타 단계에 도달하면 유충을 테스트할 수 있도록 작은 페트리 접시에 파리 먹이 마개를 준비하고 집게를 사용하여 중간 크기의 중간 크기의 인스타 유충을 작은 두 번째 및 초기 세 번째 인스타와 더 큰 후기 또는 방황하는 세 번째 인스타 유충에서 부드럽게 분류합니다. 그런 다음 집게를 사용하여 20-30 마리의 mid-third instar 유충을 실온에서 물로 적신 작은 파리 먹이가 들어있는 작은 페트리 접시로 옮깁니다.
기계적 통각 분석을 수행하려면 집게를 사용하여 3분의 1 중반의 instar 유충을 명시야 실체 현미경 아래의 어둡고 얇은 비닐 패드에 놓고 현미경 대물 렌즈와 패드 사이에 광섬유 조명을 배열합니다. 종이 타월을 사용하여 유충 주변의 과도한 물을 닦아내고 패드를 움직여 유충의 머리와 입이 연구원의 주로 사용하지 않는 손 쪽으로 향하도록 합니다. 기계적 프로브를 선택하고 프로브를 약 복부 분절 A8에서 유충의 뒤쪽 등쪽에 1-2초 동안 적용하고, 프로브가 구부러져 이전에 측정된 압력량을 끌어낼 때까지 프로브 접촉 지점의 기본 패드로 유충을 조심스럽게 압축합니다.
유충이 3초 이내에 몸의 축을 따라 360도의 완전한 코르크 마개 롤을 보이는 경우 긍정적인 통각 반응이 나타납니다. 각 유충에 대한 행동 반응을 기록합니다. 그런 다음 테스트된 유충을 버리고 분석을 위해 다음 유충을 준비합니다.
나이티놀 필라멘트가 있는 이러한 맞춤형 기계식 프로브는 기계적으로 유발된 거동을 유도하고 다양한 강도의 무해한 기계적 프로브와 유해한 기계적 프로브를 모두 사용하여 완전한 행동 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 행동 분석 결과에서 알 수 있듯이 200킬로파스칼 이하의 압력을 가하는 프로브는 초파리 유충에서 혐오스러운 롤링 반응을 유발하지 않습니다. 예상대로, 이러한 subthreshold 또는 non-noxious mechanical probe는 눈에 보이는 신경 조직 손상을 유발하지 않습니다.
반대로, 슈퍼 임계 값 또는 유해 프로브는 용량 의존적 방식으로 말초 감각 뉴런 자체에 대한 조직 손상뿐만 아니라 증강된 행동 반응을 유도합니다. 이 프로브는 부상 후 기계적 과민증을 측정하는 데에도 사용할 수 있습니다. 자외선 처리 후 2시간 이내에 유충의 약 20%가 혐오스러운 롤링으로 반응하는 반면, 50%는 모의 자외선 조사된 동물에 비해 4시간 이내에 반응했습니다.
이 분석에 사용된 프로브는 일반적으로 임계값 미만인 200킬로파스칼이었기 때문에 이 반응은 기계적 이질통으로 간주되었습니다. 이후 시점에서 UV 처리된 유충의 행동 반응은 약간 증가하지만 모의 방사선 조사 대조군과 통계적으로 다르지 않습니다. 자외선 처리 후 4시간, 8시간, 16시간에 462킬로파스칼 프로브로 조사한 유충은 혐오적 롤링 반응이 크게 증가했으며, 자극이 초기에는 유독했기 때문에 행동 과민성이 최고
조에 달한 4시간이 나타난다.반응은 기계적 통각과민으로 간주되었습니다. 프로브 준비와 유충 선택 및 압축은 프로세스의 성공에 매우 중요합니다. 이러한 프로브를 사용하여 기준선을 가져온 통각 및 기계적 통각 과민증은 부상 후 측정할 수 있습니다.
이러한 도구와 분석을 사용하여 유전적으로 다루기 쉬운 초파리 모델에서 기계적 통각 및 통각 과민성의 분자 및 유전적 기반을 측정할 수 있습니다.
이 프로토콜은 초파리 유충에서 기계적 통증 감지를 측정하는 개선된 분석법을 보여주며, 기계적 과민성의 존재를 강조합니다.
This assay enables quantitative measurement of mechanical nociception and hypersensitivity in a genetically tractable model, supporting target validation and mechanistic de-risking in pain research. By providing dose-response capabilities from innocuous to noxious stimuli, it facilitates preclinical screening of analgesic candidates and biomarker discovery. The approach improves predictive confidence in early discovery by modeling human-like allodynia and hyperalgesia phenotypes.
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation of analgesic candidates.