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방법 논문

Human Natural Killer Cell Receptor-Ligand Repertoire의 프로파일링

2.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/61912

⸱

2020년 11월 19일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Program in Immunology, Stanford University School of Medicine, 3Chan-Zuckerberg BioHub

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 두 개의 상보적 질량 세포 분석(CyTOF) 패널을 설계하고 바이러스 감염 환경에서 자연 살해 세포 수용체 및 리간드 레퍼토리를 프로파일링하기 위해 CyTOF 염색 프로토콜을 최적화합니다.

초록

자연살해(NK) 세포는 바이러스 감염에 대한 첫 번째 반응 세포 중 하나입니다. 바이러스에 감염된 세포를 빠르게 인식하고 죽이는 NK 세포의 능력은 생식세포로 인코딩된 억제 수용체 및 활성화 수용체의 발현에 의해 조절됩니다. 동족 리간드가 표적 세포에 대한 이러한 수용체의 참여는 세포 간 상호 작용이 NK 세포 사멸로 이어질지 여부를 결정합니다. 이 프로토콜은 두 개의 상보적 질량 세포분석(CyTOF) 패널의 설계 및 최적화에 대해 자세히 설명합니다. 한 패널은 수용체 발현을 기반으로 NK 세포를 표현형화하도록 설계되었습니다. 다른 패널은 여러 면역 세포 subset에서 NK 세포 수용체에 대해 알려진 리간드의 발현을 조사하도록 설계되었습니다. 이 두 패널을 함께 사용하면 인간 NK 세포 수용체-리간드 레퍼토리를 프로파일링할 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 CyTOF용 샘플을 염색하는 프로세스도 자세히 설명합니다. 이 프로세스는 재현성 및 표준화 향상을 위해 최적화되었습니다. CyTOF의 장점은 신호 중복을 최소화하면서 각 패널에서 40개 이상의 마커를 측정할 수 있어 연구자들이 NK 세포 수용체-리간드 레퍼토리의 폭을 포착할 수 있다는 것입니다. 팔라듐 바코드는 또한 시료 간 변동과 시약 소비를 줄여 각 패널을 병렬로 시료를 쉽게 염색할 수 있도록 합니다. 이 프로토콜의 한계는 CyTOF의 처리량이 상대적으로 낮고 분석 후 세포를 복구할 수 없다는 것입니다. 이 패널은 뎅기열 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 인플루엔자를 포함한 급성 및 만성 바이러스 감염을 앓고 있는 환자의 임상 샘플을 분석하기 위해 설계되었습니다. 그러나 인간 NK 세포 수용체-리간드 레퍼토리를 조사하기 위해 모든 환경에서 활용할 수 있습니다. 중요한 것은 이러한 방법이 향후 CyTOF 패널의 설계 및 실행에 광범위하게 적용될 수 있다는 것입니다.

서론

자연살해(NK) 세포는 악성 세포, 감염 세포 또는 기타 스트레스를 받은 세포를 표적으로 삼아 죽이는 것이 주요 역할인 선천성 면역 세포입니다. NK 세포는 IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인의 분비와 세포독성 활성을 통해 병원체 및 악성 종양에 대한 적응 면역 반응을 형성할 수도 있습니다. NK 반응은 잠재적인 표적 세포에 발현된 수많은 리간드와 결합하는 생식세포로 인코딩된 억제 수용체 및 활성화 수용체의 조합 신호전달에 의해 부분적으로 매개됩니다. 여러 NK 세포 수용체에는 새로운 수용체-리간드 쌍이 정기적으로 확인되는 하나 이상의 리간드가 있습니다.

NK 세포는 스트레스를 받은 세포에 신속하게 반응하는 능력이 바이러스 확산을 제한하거나 NK 세포 회피 전략의 개발을 촉진할 수 있는 바이러스 감염의 맥락에서 연구하는 데 특히 관심이 있습니다. NK 세포 생물학에 대한 관심은 암 면역 요법 분야로 확장되어 연구자들은 종양 면역 감시 및 종양 미세환경에서 NK 세포의 역할을 조사하고 있습니다1. 그러나 인간 NK 세포는 30개 이상의 수용체를 발현할 수 있고, 수용체는 다시 30개 이상의 알려진 리간드와 상호 작용할 수 있기 때문에 NK 세포-표적 세포 상호 작용을 프로파일링하는 능력은 복잡합니다2. 따라서 여러 NK 세포 수용체와 동족 리간드를 동시에 검출하는 것은 NK 기능을 제어하는 수용체-리간드 상호 작용의 복잡성을 포착하는 데 필요합니다. 그 결과, 우리는 단일 세포 수준에서 40개 이상의 마커를 동시에 검출할 수 있는 질량 세포 분석(CyTOF)으로 눈을 돌렸습니다. 우리의 목표는 NK 세포 수용체-리간드 레퍼토리를 프로파일링하기 위해 두 개의 CyTOF 패널을 만드는 것이었습니다. 또한 임상 샘플의 효과적인 처리 및 염색을 위한 프로토콜을 설계하고 싶었습니다. 인체 임상 샘플은 신체가 바이러스 감염에 어떻게 반응하는지에 대한 풍부한 정보를 제공합니다. 따라서 우리는 NK 세포 수용체와 동족 리간드의 발현을 병렬로 조사하여 더 나은 표준화, 회수율 향상, 시약 소비 감소 및 배치 효과 제한을 조사하기 위해 이 프로토콜을 개발했습니다.

인간 NK 세포의 표현형을 특성화하기 위해 고안된 여러 유세포 분석 패널이 이전에 발표되었습니다 3,4,5,6,7,8. 이러한 패널의 대부분은 수용체-리간드 레퍼토리의 폭을 포착하는 능력이 제한되어 있어 제한된 마커 선택만 검출할 수 있습니다. 더욱이, 이러한 패널은 형광 색소 간의 신호 중첩에 의해 제한됩니다. CyTOF는 금속 동위원소에 접합된 항체를 사용하며, 이 항체는 비행 시간 질량 분석법으로 판독되므로 채널 간 스필오버를 크게 줄일 수 있습니다.

우리와 마찬가지로 다른 연구자들은 NK 세포 9,10,11,12,13,14를 연구하기 위해 CyTOF를 사용했지만, 일반적으로 NK 세포 마커가 적어 표현형의 깊이가 줄어듭니다. 이러한 그룹에서 사용하는 일반적인 염색 프로토콜은 당사와 유사하지만 몇 가지 중요한 차이점이 있습니다. 다른 프로토콜은 염색 전에 NK 세포를 분리하는 것을 포함하지 않지만 연구자들은 해당 하위 집합13,14에만 관심이 있습니다. NK 세포가 말초혈액 단핵세포(PBMC)의 5-20%만을 차지한다는 점을 감안할 때, 분리된 NK 세포가 아닌 전체 PBMC를 염색한다는 것은 수집된 사건의 대부분이 NK 세포가 아니라는 것을 의미합니다. 이렇게 하면 관심 있는 하위 집합에서 생성되는 데이터의 양이 줄어들고 기계 시간이 비효율적으로 사용됩니다. 또한, 이러한 패널 중 다수는 killer Ig-like receptor(KIR), NKG2A/C/D 및 자연 세포독성 수용체(NKp30, NKp44 및 NKp46)와 같은 NK 세포 수용체의 발현을 조사하지만, 이러한 marker의 발현은 해당 ligand의 발현에 대한 데이터가 없기 때문에 더 넓은 맥락에 포함되지 않습니다. 결과적으로, CyTOF를 통해 NK 세포를 조사하기 위해 이전에 발표된 이러한 방법은 단독으로 사용되는 광범위한 NK 세포 표현형에 충분하지만 NK 세포 활성에 대한 포괄적인 그림을 제공할 수는 없습니다. 이는 여기에 설명된 방법의 주요 장점을 가져다 주는데, 이는 현재까지 NK 세포 수용체에 대한 리간드의 발현을 탐색하는 데 초점을 맞춘 발표된 유세포 분석 또는 CyTOF 패널이 없다는 것입니다. 중요한 것은 당사의 리간드 패널에는 각 실험의 고유한 요구 사항에 맞게 마커를 추가할 수 있는 여러 개방형 채널이 있다는 것입니다.

CyTOF의 주요 한계 중 하나가 분석 후 샘플을 회수할 수 없다는 점을 고려할 때 이 방법은 추가 실험을 수행하는 데 관심이 있는 샘플이 제한된 연구자에게 적합하지 않을 수 있습니다. 또한 CyTOF의 낮은 처리량 특성은 시작 셀 수가 낮을 경우 생성된 데이터의 품질이 떨어진다는 것을 의미합니다. 이러한 두 가지 한계를 제외하고, 이 방법은 NK 세포와 표적 세포 간의 수용체-리간드 상호 작용을 조사하기 위한 모든 환경에서 잘 수행됩니다.

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프로토콜

익명화된 건강한 성인 PBMC는 Stanford Blood Center에서 구입한 백혈구 감소 시스템 챔버에서 얻었습니다. 파나마 파나마 시티에 있는 고르가스 메모리얼 보건 연구소(Gorgas Memorial Institute of Health Studies)와 보건부, 파나마 시티의 사회 보장 시스템 및 교외 지역에 속한 병원에서 신원이 제거된 건강한 소아 기증자와 소아 급성 뎅기열 환자의 PBMC를 획득했습니다. 뎅기열 연구 프로토콜은 델니뇨 병원(Hospital del Niño)의 IRB(CBIHN-M-0634)에 의해 승인되었으며, 이후 ICGES, CSS, 산토 토마스 병원 및 스탠포드 대학의 위원회에 의해 승인되었습니다. 항레트로바이러스 치료를 받고 있는 HIV 감염 환자의 PBMC는 ACTG 연구 A5321에서 얻었다.

1. 항체 라벨링, 패널 준비 및 보관

  1. 금속 동위원소를 이용한 항체 표지
    참고: 염색의 실험 간 표준화를 높이려면 각 항체에 대해 여러 접합을 수행한 다음 아래 설명된 대로 장기 보관을 위해 산물을 단일 마스터 믹스로 결합하는 것이 좋습니다.
    1. 접합 전에 280nm에서 흡광도를 측정하여 각 항체의 농도를 결정합니다. 이 프로토콜에 사용된 항체는 상업적으로 이용 가능하며 Table of Materials에 나열된 공급업체에서 구입했습니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 항체 라벨링 키트를 사용하여 금속 동위원소로 항체를 라벨링합니다. 각 반응에 대해 100μg의 항체를 사용합니다.
    3. 280nm에서 흡광도를 측정하여 회수된 항체의 최종 농도를 결정합니다. 항체는 4°C에서 단기간 보관하십시오.
  2. 항체 적정
    참고: CyTOF 기술은 환경 금속의 잠재적인 오염 신호에 매우 민감합니다. 따라서 사용되는 모든 완충액/시약은 초순수로 준비해야 하며 비누로 세척한 적이 없는 플라스틱 또는 유리 용기에 보관해야 합니다.
    1. 해동할 PBMC 바이알당 9mL의 따뜻하고 완전한 RPMI(RPMI 1640, 10% FBS, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신) 및 20μL의 벤조나제를 포함하는 각 공여자에 대해 원심분리 튜브를 준비합니다. PBMC를 수조에서 해동하고 튜브에 추가합니다.
      참고: Benzonase는 용해된 세포의 유리 DNA에서 점도와 배경을 감소시킵니다.
    2. 300 x g 의 실온에서 5분간 원심분리기 PBMC를 5mL의 완전한 RPMI 배지에 재현탁하고 계수합니다.
    3. 각 패널 적정에 대해 둥근 바닥 96웰 플레이트의 6웰(각 역가에 대해 1개, 염색되지 않은 1개)의 6웰에 2-400만 PBMC/웰을 플레이트화합니다. 600 x g 의 플레이트를 실온에서 3분 동안 원심분리합니다. 플레이트를 튕겨 상층액을 제거합니다. 각 웰을 200μL의 CyPBS에 재현탁합니다.
    4. 아래 설명된 대로 시스플라틴 생존도 염색을 수행합니다.
      참고: 시스플라틴은 질량 세포 분석에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 사용됩니다.
      1. 100 μL의 25 μM 시스플라틴 스톡에 세포를 재현탁합니다. 실온에서 1분 동안 배양합니다.
      2. 각 웰에 FBS 100μL를 첨가하고 혼합하여 시스플라틴 반응을 소멸합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
        알림: 이후의 모든 원심분리 단계를 4°C에서 수행합니다.
      3. 200μL의 CyFACS(0.1% BSA, 0.05% 아지드화나트륨이 함유된 초순수에서 중금속 오염 물질이 없는 PBS 1개)로 셀을 두 번 세척합니다. 매번 원심분리기를 하고 플레이트를 튕깁니다.
    5. 표면 항체 패널을 아래와 같이 적정합니다.
      참고: NK 표면 패널과 리간드 패널에 대해 별도의 마스터 믹스를 만들어야 합니다.
      1. CyFACS를 사용하여 10 μg/mL 농도의 모든 표면 항체의 마스터 믹스를 만듭니다. 150μL의 최종 부피를 목표로 합니다. CyFACS를 사용하여 연속 1:2 희석을 수행하여 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625μg/mL 농도를 얻습니다.
      2. 염색 전 3분 동안 10,600 x g 에서 원심 필터 장치(0.1μm 공극 크기)를 통해 항체 칵테일을 필터링합니다.
      3. 각 역가에서 50 μL의 표면 항체 칵테일에 도금된 세포를 재현탁합니다. 오염되지 않은 우물을 CyFACS에 다시 현탁시킵니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
      4. 150μL의 CyFACS로 세포를 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
      5. 200μL의 CyFACS로 세포를 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
    6. CyPBS에서 100μL의 2% 파라포름알데히드(PFA)에 각 웰을 재현탁하여 세포 고정을 수행합니다. 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 플레이트를 배양합니다. 100μL의 CyFACS로 세포를 세척합니다. 700 x g 에서 5분 동안 원심분리기
      주의: PFA는 암뿐만 아니라 유전적 결함을 유발하는 것으로 의심됩니다. 또한 눈, 피부에 닿거나 흡입하면 유해합니다. 통풍이 잘 되도록 하고 용기를 조심스럽게 열고 에어로졸 형성을 방지하여 적절하게 취급하십시오.
      참고: 이후의 모든 원심분리기 스핀은 700 x g 에서 4°C에서 5분 동안 수행됩니다.
    7. 초순수에 희석된 200μL의 1x Permeabilization Buffer(Perm buffer)에 재현탁하여 세포를 투과화합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다. 200μL의 Perm 버퍼로 셀을 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
      참고: Perm 버퍼에서 배양할 필요가 없습니다.
    8. 세포 내 항체 패널 적정
      1. Perm Buffer를 사용하여 10 μg/mL 농도의 모든 세포 내 항체의 마스터 믹스를 만듭니다. 150 μL의 최종 부피를 목표로 합니다. Perm Buffer를 사용하여 연속 1:2 희석을 수행하여 10, 5, 2.5, 1.25 및 0.625 μg/mL 농도를 얻습니다.
      2. 염색 전 3분 동안 10,600 x g 에서 원심 필터 장치(0.1μm 공극 크기)를 통해 항체 칵테일을 필터링합니다.
      3. 플레이트된 세포를 각 역가에서 50μL의 세포 내 항체 칵테일에 재현탁합니다. 염색되지 않은 우물을 Perm Buffer에 재현탁합니다. 4 °C에서 45 분 동안 배양합니다.
        참고: 세포 내 패널이 적정되지 않을 경우 Perm 완충액의 50μL에 웰을 재현탁합니다.
      4. 150μL의 Perm 버퍼로 셀을 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
      5. 200μL의 Perm 버퍼로 셀을 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
      6. 200μL의 CyFACS로 세포를 두 번 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
    9. DNA 인터컬레이터 염색
      참고: Intercalator는 세포 핵산에 결합하며 질량 세포 분석에서 핵이 있는 세포를 식별하는 데 사용됩니다.
      1. CyPBS와 2% PFA로 1:10,000으로 희석된 200μL의 인터칼레이터에 세포를 재현탁합니다. 플레이트를 4 ° C에서 밤새 배양하십시오.
      2. 필요한 경우 파라핀 필름으로 덮인 4 °C에서 최대 일주일 동안 플레이트를 보관하십시오.
        알림: 700 x g 에서 5°C에서 5분 동안 모든 후속 원심분리 단계를 수행합니다.
      3. CyTOF에서 샘플을 실행하기 전에 플레이트에서 파라핀 필름을 제거하고 700 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 접시를 튕깁니다. 200μL의 CyFACS로 세포를 한 번 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
      4. 200μL의 초순수로 세포를 세 번 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다. 200μL의 초순수에 세포를 재현탁합니다. 샘플을 실행하기 직전에 초순수에서 1x 농도로 희석된 정규화 비드에서 농도를 약 6 x 105 cells/mL로 조정합니다.
    10. CyTOF에서 샘플을 실행합니다.
    11. 데이터를 분석하고 가장 낮은 항체 역가를 선택하여 각 항체에 적합한 역가를 선택하며, 이는 시각적 평가를 기반으로 신호 강도가 가장 높고 양성 모집단과 음성 모집단을 가장 잘 분리하는 결과를 낳습니다.
      참고: NK 및 리간드 패널에 대한 적정은 각각 그림 1 및 그림 2 에 나와 있습니다. 양성 세포 집단과 음성 집단 간의 명확한 구분이 확인되지 않는 경우, 여러 세포 유형 또는 세포주에서 역가를 평가하여 양성 세포 집단과 음성 세포 집단을 모두 식별할 수 있습니다.
    12. 항체 패널 보관
      1. 적정 항체를 마스터 믹스에 결합하고 멸균 0.1μm 주사기 필터 장치를 통해 여과합니다. NK 표면 패널, NK 세포 내 패널 및 리간드 패널에 대해 별도의 마스터 믹스를 만들어야 합니다.
      2. 패널의 장기 보관을 위해서는 두 가지 허용 가능한 옵션 중 하나를 따르십시오.
      3. 동결 건조를 위해 마스터 믹스를 타사 회사로 보냅니다. 이 방법은 NK 패널에 사용됩니다. 사내에서 접합되지 않은 항체는 동결건조 과정을 방해하는 항체 안정제의 존재로 인해 동결건조할 수 없습니다. 이러한 항체는 염색 당일에 패널에 추가됩니다.
      4. 리피터 피펫을 사용하여 각 마스터 믹스의 50μL 분취량을 만들고 -80°C에서 보관합니다.

2. 염색 프로토콜

  1. 1.2.1 및 1.2.2 단계에 설명된 대로 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 해동합니다. 15mL 원심분리 튜브에서 리간드 패널 염색을 위해 최소 100만 개의 PBMC를 확보하십시오. NK 세포 분리 동안 이러한 PBMC를 얼음 위에 보관하십시오.
  2. NK 셀 분리
    참고: 다음 NK 셀 격리 단계는 특정 공급업체의 프로토콜의 수정된 버전입니다. 그러나 NK 셀의 자기 기반 음성 선택을 수행하는 모든 키트 또는 프로토콜이 적절한 대안이 될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 전체 PBMC에서 NK 세포의 표현형에도 적합하기 때문에 이 단계는 선택 사항입니다.
    1. 나머지 PBMC를 450 x g 에서 5분 동안 회전시킵니다. 총 107 개의 세포 당 40 μL의 MACS 완충액 (PBS, 0.5 % BSA, 2 mM EDTA)에 세포 펠렛을 재현 탁합니다.
    2. 총 107 cell 당 10 μL의 NK cell Biotin-Antibody Cocktail을 추가합니다. 잘 섞어 얼음 위에서 5분 동안 배양합니다.
    3. 총 107 세포당 30 μL의 MACS 버퍼와 107 총 세포당 20 μL의 NK 세포 MicroBead Cocktail을 추가합니다. 잘 섞어 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    4. 500μL의 MACS 완충액으로 헹궈 용리 컬럼을 준비합니다. 15mL 수집 튜브에 2mL의 차가운 완전 RPMI를 추가합니다.
    5. 세포가 포함된 튜브에 MACS 완충액을 추가하여 부피를 최대 500μL까지 가져옵니다. 전체 500μL 부피를 준비된 용리 컬럼에 피펫팅합니다. 다른 500μL의 MACS 버퍼로 튜브를 헹구고 컬럼으로 옮깁니다.
    6. 흐름이 멈춘 후 용리 컬럼을 500μL MACS 버퍼로 두 번 헹굽니다. 흐름이 멈춘 후 NK 세포를 계산합니다.
  3. 세포를 플레이트하고 세척합니다.
    1. 원심분리기는 실온에서 10분 동안 300 x g 의 NK 세포와 PBMC를 분리했습니다. CyPBS에서 500만 cells/mL 농도로 세포를 재현탁합니다(초순수에 중금속 오염 물질이 없는 PBS 1개). U-바닥, 96웰 플레이트의 플레이트 셀.
      참고: NK cell panel의 각 분취액은 최대 300만 개의 세포를 염색할 수 있습니다. 염색 전에 6개의 개별 NK 세포 샘플을 바코드로 작성하고 통합한 경우 총 NK 세포 수는 300만 개를 초과해서는 안 됩니다. 리간드 패널은 샘플당 최대 600만 개의 PBMC를 염색할 수 있습니다. 염색 전에 6개의 개별 샘플을 바코드로 분류하고 풀링하는 경우 PBMC의 총 수는 600만 개를 초과해서는 안 됩니다.
    2. 600 x g 의 원심분리기 플레이트를 실온에서 3분 동안 가열합니다. 플레이트를 튕겨 상층액을 제거합니다.
      알림: 600단계까지 3분 동안 2.7 x g 에서 모든 후속 원심분리기 회전을 수행합니다.
    3. 200μL의 CyPBS에서 세포를 재현탁합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
  4. 1.2.4단계에 설명된 대로 시스플라틴 생존도 염색을 수행합니다.
  5. 바코드 염색
    참고: 이 패널은 고정 되지 않은 살아있는 세포에 수정된 2/4, 팔라듐 기반 바코드 방법과 함께 사용되어 배치 효과를 최소화하고 세포 회수율을 최대화합니다15. 그러나 품질 데이터를 얻기 위해 바코드가 필요하지 않으므로 이 단계는 선택 사항입니다.
    1. 각 웰을 50 μL의 사전 혼합된 바코드에 재현탁시키고 4 °C에서 30분 동안 배양합니다. 150μL의 CyFACS로 세포를 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
    2. 200μL의 CyFACS로 세포를 두 번 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다. 30μL의 CyFACS에 모든 웰을 재현탁합니다. 고유한 바코드로 염색된 최대 6개의 웰(well)을 하나의 웰에 결합하고 플레이트의 원심분리와 플릭킹(flicking)을 수행합니다.
  6. 표면 염색
    1. 스파이크된 추가 표면 항체(anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1)와 함께 50μL의 CyFACS에 표면 NK 패널 lyosphere를 용해시킵니다. -80°C에서 보관된 리간드 패널을 해동하고 미니 원심분리기를 사용하여 튜브를 스핀다운합니다. 추가 리간드 패널 표면 마커(anti-CD16, anti-CD19)의 스파이크.
      참고: 이전에 여과되지 않은 항체 칵테일(즉, 동결 건조 또는 동결 전)은 염색 전 3분 동안 10,600 x g 에서 원심 필터 장치(0.1μm 공극 크기)를 통해 여과해야 합니다.
    2. 각 패널의 50μL에 각 웰을 재현탁합니다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 150μL의 CyFACS로 세포를 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다. 200μL의 CyFACS로 세포를 다시 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
  7. 1.2.6단계에서 설명한 대로 셀을 수정합니다.
    알림: 모든 후속 원심분리기 탈수를 700 x g 에서 5°C에서 5분 동안 수행합니다.
  8. 1.2.7단계에서 설명한 대로 세포를 투과합니다.
  9. 세포 내 염색
    1. 세포 내 NK 패널 lyosphere를 50μL의 Perm buffer에 용해시킵니다. 원하는 경우 PBMC 샘플에 대한 세포 내 항체 칵테일을 준비합니다.
      참고: 이전에 여과되지 않은 항체 칵테일(즉, 동결 건조 또는 동결 전)은 염색 전 3분 동안 10,600 x g 에서 원심 필터 장치(0.1μm 공극 크기)를 통해 여과해야 합니다.
    2. 각 세포 내 패널의 50 μL에 웰을 재현탁합니다. 세포 내 패널을 리간드 표면 패널과 함께 사용하지 않는 경우 PBMC 웰을 Perm 완충액의 50μL에 재현탁합니다. 4 °C에서 45 분 동안 배양합니다.
    3. 150μL의 Perm 버퍼로 셀을 세척합니다. 원심분리기 및 플릭 플레이트. 200μL의 Perm 버퍼로 셀을 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
    4. 200μL의 CyFACS로 세포를 두 번 세척합니다. 원심분리기를 만들고 플레이트를 튕깁니다.
  10. DNA 인터컬레이터 염색. 1.2.9.1단계에 설명된 대로 DNA 인터컬레이터 염색을 수행합니다. 플레이트를 4 °C에서 밤새 배양합니다.
    참고: Intercalator는 세포 핵산에 결합하며 질량 세포 분석에서 핵이 있는 세포를 식별하는 데 사용됩니다. 플레이트는 4°C에서 최대 일주일 동안 파라핀 필름으로 덮여 보관할 수 있습니다.
  11. CyTOF에서 샘플을 실행하기 전에 1.2.9.3 및 1.2.9.4 단계에 설명된 대로 셀을 세척합니다.
  12. CyTOF에서 샘플을 실행합니다.

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결과

항체는 제조업체의 지침에 따라 상업적으로 이용 가능한 라벨링 키트를 사용하여 금속 동위원소에 접합되었습니다. 항체 클론은 이 패널에서 사용하기 전에 유세포 분석과 질량 세포 분석으로 검증되었습니다. 클론의 초기 목록은 문헌 및 항체 가용성에 대한 검토를 기반으로 선택되었습니다. NK 세포 수용체에 대한 일부 리간드의 발현 수준은 건강한 PBMC에서 낮거나 검출되지 않습니다. 따라서 건강한 PBMCs, 만성 골수성 백혈병 K562 세포, 급성 림프구 백혈병 NALM6 세포 또는 B 세포 급성 림프구 백혈병 697 세포를 염색하여 일부 항체에 대한 양성 염색을 검증했습니다(보충 그림 1). 적절한 염색을 생성하지 않거나 너무 비싼 NK 세포 패널을 위해 선택된 클론은 보충 표 1 에 상세히 기술되고 보충 그림 2에 나타난 바와 같이 다른 클론으로 대체되었습니다.

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토론

여기에서는 NK 세포 수용체-리간드 레퍼토리를 프로파일링하기 위한 두 개의 무료 CyTOF 패널의 설계 및 적용에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에는 고품질 데이터를 얻는 데 중요한 몇 가지 단계가 포함되어 있습니다. CyTOF는 형광 색소가 아닌 중금속 이온을 항체에 대한 표지 프로브로 사용합니다19. 따라서 이 기술은 환경 금속20의 잠재적인 오염 신호에 영향을 받습니다. 금속 불순물의 잠재적인 공급원에는 실험실 주방 세제(바륨)와 실험실 완충액(수은, 납, 주석)이 포함됩니다. 이러한 이유로 모든 완충액은 초순수로 준비해야 하며 모든 시약은 비누로 세척한 적이 없는 플라스틱 또는 유리 용기에 보관하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 Fienberg et al.21에 설명된 바와 같이 시스플라틴 기반 방법을 사용하는 생...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

저자는 이 패널에 기여한 Blish Laboratory의 모든 현직 및 전직 구성원에게 감사의 뜻을 전합니다. AIDS 임상시험 그룹(AIDS Clinical Trials Group)과 ACTG A5321 팀, 고르가스 메모리얼 보건 연구소(Gorgas Memorial Institute for Health Studies)의 산드라 로페즈-베르제스(Sandra López-Vergès) 박사와 데이비스 벨트란(Davis Beltrán) 박사에게 시료 큐레이션에 감사드립니다. 마지막으로, Helios 기계를 사용해 주신 Michael Leipold, Holden Maecker 및 Stanford Human Immune Monitoring Center에 감사드립니다. 이 작업은 NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 및 Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases #1016687 to CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 및 NIH/NIAID K08 AI138640 to EV, National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 to JM 및 NIH 교육 보조금 T32-AI-007290(PI Olivia Martinez)의 지원을 받았습니다. ACTG 연구는 AI-68634(통계 및 데이터 관리 센터), UM1-A1-26617, AI-131798 및 AI-68636(ACTG)으로부터 보조금 지원을 받았습니다. CB는 Stanford Maternal Child Health Research Institute의 소아 중개 의학 분야의 Tashia and John Morgridge 교수이자 Chan Zuckerberg Biohub의 연구원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
89YSigma-Aldrich204919
102-팔라듐 질산염 Trace Sciences International특별 주문
104-팔라듐 질산염 Trace Sciences International특별 주문
106-팔라듐 질산염Trace Sciences International특별 주문
108-팔라듐 질산염Trace Sciences International특별 주문
115InTrace Sciences International특별 주문
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144nd플루이다임201144A
145nd플루이다임201145A
146nd플루이다임201146A
147sm플루이다임201147A
148nd플루이다임201148A
149sm플루이다201149A
150nd플루이다임201150A
151Eu플루이다임201151A
152sm플루이다임201152A
153Eu플루이다임201153A
154sm플루이다201154A
155Gd플루이다임201155A
156Gd플루이다임201156A
157Gd트레이스 사이언스 인터내셔널N/A
158Gd플루이다임201158A
159Tb플루이다201159A
160Gd플루이다201160A
161Dy플루이다임201161A
162Dy플루이다임201162A
163Dy플루이다임201163A
164Dy플루이다201164A
165Ho플루이다임201165A
166er플루이다임201166A
167Er플루이다임201167A
168Er플루이다임201168A
169Tm플루이다201169A
170Er플루이다201170A
171Yb플루이다임201171A
172Yb플루이다201172A
173Yb플루이다임201173A
174Yb플루이다임201174A
175Lu플루이다임201175A
176Yb플루이다임201176A
209Bi 안티-CD16플루이다임3209002B클론 3G8. 1:50 희석액에서 사용됩니다. 
697 세포Creative BioarrayCSC-C0217
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5 with Ultracel-30 Membrane, 30 kDaMilliporeUFC503096
Anhydrous acetonitrileFisher ScientificBP1165-50
anti-2B4Biolegend329502Clone C1.7.
안티 B7-H6R & D SystemsMAB7144클론 875001.
안티 CCR2바이오레전드 357202클론 K036C2.
안티 CD2바이오레전드 300202클론 RPA-2.10.
안티 CD3Biolegend300402클론 UCHT1.
안티 CD4바이오 레전317402클론 OKT4.
안티 CD4바이오레전드 344602클론 SK3.
안티 CD7Biolegend343102클론 CD7-6B7.
안티 CD8Biolegend344702클론 SK1.
안티 CD11b바이오레전드 301302클론 ICRF44.
안티 CD14바이오레전드 301802클론 M5E2.
안티 CD19바이오레전드 302202클론 HIB19.
안티 CD33Biolegend303402클론 WM53.
안티 CD38바이오레전드 303502클론 HIT2.
안티 CD48Biolegend336702클론 BJ40.
안티 CD56BD Pharmingen559043클론 NCAM16.2.
안티 CD57Biolegend322302클론 HCD57.
안티 CD62L바이오레전드 304802클론 DREG-56.
안티 CD69바이오레전310902클론 FN50.
안티 CD94바이오레전드 305502클론 DX22.
안티 CD95바이오레전드 305602클론 DX2.
안티 CD155바이오레전드 337602클론 SKII.4.
안티 CXCR6바이오레전드 356002클론 K041E5.
안티-DNAM-1BD Biosciences559787클론 DX11.
안티 DR4Biolegend307202클론 DJR1.
안티 DR5바이오레전드 307302클론 DJR2-2.
안티 FAS-L바이오레전드 306402클론 NOK-1.
anti-FcRgMillipore06-727다클론 항체.
안티 HLA-C,EMilliporeMABF233클론 DT9.
안티 HLA-Bw4Miltenyi Biotec특별 주문클론 REA274.
안티 HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530클론 REA143.
안티 HLA-DRBiolegend307602클론 L243.
안티 HLA-EBiolegend342602클론 3D12.
안티 ICAM-1바이오레전드 353102클론 HA58.
안티 Ki-67바이오레전드 350502클론 Ki-67.
안티 KIR2DL1 / KIR2DS5R & D SystemsMAB1844클론 143211.
안티 KIR2DL3R & D SystemsMAB2014클론 180701.
안티 KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200클론 UP-R1.
안티 KIR2DS4R & D SystemsMAB1847클론 179315.
안티 KIR3DL1BD Biosciences555964클론 DX-9.
안티 LFA-3바이오레전드 330902클론 TS2/9.
안티 LILRB1R& D Systems292319클론 MAB20172.
안티 LLT-1R & D SystemsAF3480클론 402659.
안티 운모R & D SystemsMAB1300-100클론 159227.
안티 MICBR& D SystemsMAB1599-100클론 236511.
안티 넥틴 -1Biolegend340402클론 R1.302.
안티 넥틴-2바이오레전드 337402클론 TX31.
안티 NKG2AR& D SystemsMAB1059클론 131411.
안티 NKG2CR& D SystemsMAB1381클론 134522.
안티 NKG2D바이오레전드 320802클론 1D11.
안티 NKp30바이오레전드 325202클론 P30-15.
안티 NKp44Biolegend325102클론 P44-8.
안티 NKp46바이오레전드 331902클론 9E2.
안티 NTB-A바이오레전드 317202클론 NT-7.
안티 팬 HLA 클래스 IBiolegend311402클론 W6/32.
안티 PD1바이오레전329902클론 EH12.2H7.
안티 PerforinAbcamab47225클론 B-D48.
안티 Siglec-7Biolegend347702클론 S7.7.
안티 SykBiolegend644302클론 4D10.2.
안티 촉각Biolegend338402클론 NK92.39.
안티 TIGITR & D SystemsMAB7898클론 741182.
항 ULBP-1R & D SystemsMAB1380-100클론 170818.
안티 ULBP-2, 5, 6R & D SystemsMAB1298-100클론 165903.
항체 안정제Candor Bioscience131 050
Benzonase NucleaseMillipore70664
본드 브레이커 TCEP 용액Thermo Fisher Scientific77720
소 혈청 알부민 용액Sigma-AldrichA9576
염화칼슘 이수화물(CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platinum(II)diamine dichloride (cisplatin)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250100 mM 원액을 DMSO에서 제조하고 25 µ로 나누었습니다. L 부분 표본. 25 µ에 사용하는; 살아있는/죽은 염색을 위한 M 희석. 신호는 194Pt 및 195Pt 채널에 나타납니다.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience Permeabilization BufferThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0.5 M)HoeferGR123-100EDTA가 함유된 이중 농축 HEPES 완충액은 다음 레시피에 따라 만들어졌습니다: 1.3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl22PO4(Thermo Fisher Scientific), 1M HEPES 4mL(Thermo Fisher Scientific), 0.5M EDTA 2mL(Hoefer, Holliston, MA, USA) 및 100mL H2O. 이 이중 농축 HEPES 완충액의 pH는 1M HCl 및 1M NaOH를 사용하여 7.3의 pH로 조정되었습니다.
EQ Four Element Calibration BeadsFluidigm201078
Fetal Bovine SerumThermo Fisher ScientificN/A
Helios 질량 세포분석기FluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
HyClone Antibiotic/Antimycotic Solution (Pen/Strep/Fungiezone) 솔루션Fisher Scientific
이리듐 - 191Ir/193Ir 인터컬레이터DVS Sciences (Fluidigm)201192B1:10000 희석으로 사용됩니다.
이소티오시아노벤질-EDTA (ITCB-EDTA)도진도 분자 기술, Inc.M030-10무수 아세토니트릴에 1.25mg/mL로 희석.
K562 세포미국형 배양 컬렉션(ATCC)ATCC CCL-243
L-글루타민(200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
염화마그네슘(MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 항체 라벨링 키트FluidigmN/A키트에는 금속이 포함되어 있으므로 카탈로그 번호가 없습니다. 
Millex-VV 주사기 필터 장치, 0.1 &마이크로; mMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 정수 시스템MilliporeZ00Q0V0WW
MS 컬럼Miltenyi Biotec
NALM6 세포미국식 배양 수집 (ATCC)ATCC CRL-3273
Nanosep Omega Membrane 3KPall CorporationOD003C35
NK 세포 분리 키트, humanMiltenyi Biotec130-092-657
파라포름알데히드(16%)Electron Microscopy Sciences15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19써모 피셔 사이언티픽Q10179클론 SJ25-C1. 1:50 희석에서 사용됩니다. 신호는 112Cd-114Cd 채널에 나타납니다.
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158클론 Tü36. 1:200 희석으로 사용됩니다.
록랜드 PBS록랜드 이뮤노케미컬, Inc.MB-008 CyPBS(Milli-Q 물에서 1X로 희석된 10X Rockland PBS) 및 CyFACS 완충액(0.1% BSA 및 0.05% 아지드화나트륨으로 Milli-Q 물에서 1X로 희석된 10X Rockland PBS)을 만드는 데 사용됩니다. 완충액은 0.22 µ를 통해 멸균 여과되었습니다. M 여과기 그리고 4°에 sotred; C는 스테리업 병에 들어 있습니다. 
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific21870092
아지드화나트륨(NaN3)Sigma-AldrichS2002
염화나트륨(NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP 멸균 진공 여과 시스템Millipore SigmaS2GPU10RE
튜닝 솔루션Fluidigm201072
세척 용액 플루이다임201070
임 임 임 임 임 임 임 임 드 드 드 SV3007901

참고문헌

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