Name: 미세 조류의 모델 개선을 위한 높은 처리량 신진 대사 프로파일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 배우세요 Chlamydomonas reinhardtii를 이용한 고처리량 표현형 마이크로어레이 기술로 미세조류 신진대사 프로파일링을 수행하는 방법입니다. 이 프로토콜은 대사 네트워크 모델 개선과 새로운 대사 경로 발견에 활용됩니다.

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이 작업에 대한 주요 지원은 뉴욕 대학 아부다비 연구소 보조금 (73 71210 CGSB9)과 NYU 아부 다비 교수 연구 기금 (AD060)에서 탐킨에 의해 투자, 유전체학 및 시스템 생물학을위한 NYUAD 센터에 의해 제공되었다. W.F.는 절강대학교 백 인재 프로그램에 추가로 지원되었다. 아시쉬 자이스왈에게 비디오 녹화에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 신진대사 표현형 데이터를 생성해 주신 홍카이에게 감사드립니다.

1. 표현형 마이크로어레이 실험
<ol><li>미국 미네소타 대학교(https://www.chlamycollection.org)의 클라미도모나스 자원 센터에서 C. 레인하르트티균CC-503을 획득하십시오.</li>
	<li>400 μg/mL 타임엔틴, 50 μg/mL 암피실린, 100 μg/mL 암피실린, 100 μg/mL 카나마이신(세균 성장을 억제하기 위해) 25°C에서 25°C에서 2단계 로 의 최종 농도를 가진 신선한 Tris-Acetate-Phosphate(TAP) 매체19에서 세포를 성장시한다.</li>
	<li>22°C에서 10분 동안 2,000 x g의 배양을 회전시키고 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 버립니다.</li>
	<li>0.1% 테트라졸륨 바이올륨 염료 "D"가 포함된 신선한 TAP 미디어를 준비합니다. 참고: 각 플레이트에서 테스트된 대사산물 범주에 따라 일부 영양소를 제외하기 위해 이 단계에서 TAP 미디어를 수정합니다(예: 질소 소스 플레이트에 대한 염화암모늄 제외).</li>
	<li>준비된 신선한 TAP 매체에서 펠릿을 1 x 106 셀/mL의 최종 농도로 재중단합니다( 1.2단계부터)</li>
	<li>화학 화합물 어레이 분석 플레이트(탄소 공급원, 질소 공급원, 인 및 황 소스 플레이트 및 펩타이드 질소 소스)를 사용합니다.</li>
	<li>세포 함유 매체의 100 μL 알리쿼트를 분석 플레이트의 각 웰에 접종한다. 참고: 에세이를 복제해야 합니다.</li>
	<li>효모 추출물 /펩톤 플레이트에 줄인 세포를 줄이며 스미스 외에서와 같이 그램 염색을 수행합니다. 20 세균 오염을 모니터링하기 위해 분석 전후.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기 시스템에 화학 화합물 어레이 분석 플레이트를 삽입합니다.</li>
	<li>모든 플레이트를 최대 7일 동안 30°C의 배양하고 마이크로플레이트 판독기 시스템을 프로그래밍하여 15분마다 염료 색 변화를 판독합니다. 참고: 대부분의 마이크로플레이트 판독기는 인큐베이션 중에 연속광의 원천을 제공하지 않기 때문에 조류는 이종성 호흡을 수행 할 수 있어야합니다.</li>
</ol>2. 데이터 분석
<ol><li>마이크로플레이트 판독기에서 원시 운동 데이터를 CSV 파일로 내보내서, 이후 R.에서 옴니로그 표현형 마이크로어레이(OPM) 패키지에 입력으로 사용될 것이며, 메타데이터(예: 변형 지정, 성장 매체, 온도 등)로 생물학적 정보를 추가한다.<ol>
<li>PM Kinetic 데이터 변환기 소프트웨어를 사용하여; D5E 데이터 파일을 로드하고 PM 역학 분석 소프트웨어에서 다음 명령줄을 사용하여 OKA 파일로 변환합니다. 로드 | 가져오기(OKA 파일 폴더 찾기) | 필터 | 채우기 가져오기 | 모든 플레이트 | 추가 닫다. 수출 | 읽기 데이터(Kinetic)를 선택하고, 형식(CSV)(Tabulate 헤더)을선택하고 플레이트(모든 플레이트(개별 파일)를 선택합니다| 데이터 | 내보내기 구해내다.
</li>
		<li>Phenotype 마이크로어레이(PM) 데이터 분석을 수행하려면 R 소프트웨어 환경에서 실행되는 OPM 소프트웨어 패키지21,22를 사용합니다. 패키지, 자습서 및 참조 설명서는 http://www.goeker.org/opm/. RStudio에서 R용 그래픽 사용자 인터페이스는 다음 명령을 사용하여 opm 패키지와 해당 종속성을 설치합니다. 소스 (http://www.goeker.org/opm/install_opm.R) 라이브러리 (opm)
</li>
		<li>운동 데이터의 CSV 파일을 포함하는 디렉터리로 이동하여 read_ opm 함수를 사용하여 데이터를가져옵니다. x <- read_opm("",,]="grp", 포함=목록("csv:"))
</li>
		<li>곡선 파라미터 추정을 사용하여 운동 데이터를 집계하고 다시 분리합니다. (1 :길이(x)에서 i) { x [[i]] <나는 _aggre (x[[i]], 부팅 = 0 L, 코어 = 1 L, 방법 = "스플래쉬", 옵션 = set_spline_options ("smooth.spline"))) x[i]] <- do_disc(x[i]], 컷오프 = FALSE) } 메타데이터의 #Collection 메타데이터 <-collect_template(".") 메타데이터$스트레인 <-c("블랭크","CC-503") (1 :길이(x)) { x[[i]] < include_metadata(x[[i]], md = 메타데이터, 대체 = TRUE)} }
</li>
		<li>xy_plot 함수를 사용하여 분석된 96웰 플레이트에 대한 시간(x 축)의 함수로서 호흡(또는 성장) 측정(y축)을 매핑합니다. 인쇄(xy_plot(x[[[ 1], ="스트레인", 이론.max = FALSE))
</li>
		<li>level_plot 함수를 사용하여 데이터를 히트 맵으로 시각화하여 운동 데이터의 빠른 비교 개요를 허용합니다. level_plot (x, 메인 = 목록 (), 색상 = opm_opt ("color.borders"), panel.headers = 메타데이터 $ 스트레인, cex = NULL, strip.fmt = 목록 (), striptext.fmt = 목록 (), legend.9ep =", 공간 ="실험실", 바이어스 = 0.7 , num.colors = 200 L)
</li>
		<li>중요한 생물학적 정보, 곡선 파라미터, 원시 운동 곡선으로부터 의 지연 단계(λ), 성장속도(μ), 최대 세포 호흡(A), 및 곡선(AUC) 아래 영역(AUC)(21)을포함한다. 양성 대사 산물을 식별하려면 각 마이크로웰 플레이트의 공백 외에도 매질염의 비생물 반응성을 나타내는 음수 제어값의 A 값을 배경 빼기 값으로 사용합니다. 추출 함수는 A 매개 변수를 얻기 위해 사용됩니다. opm_opt("곡선.param") 파라마 <- 추출물(x, as.labels = 목록("스트레인")))
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 새로운 대사 산물과 관련된 반응 과 유전자의 식별
<ol><li>검색 KEGG(교토 유전자 및 게놈의 교토 백과사전) (http://www.genome.jp/kegg/) 및 메타심(http://metacyc.org/)은 화학 화합물 어레이23,2423,24에서발견되는 대사산물을 이용한 반응에 대한 효소 위원회 번호(EC)를 식별한다.</li>
	<li>확인된 EC 번호를 공동 게놈 연구소(JGI), 식물성조메(http://www.phytozome.net), 및 동료 평가간행물(23,25,26,27)과같은 다중 사용 가능한 조류 성화 자원에서 검색 기반으로사용한다.</li>
	<li>쿼리가 주어진 EC 번호에 대한 유전적 증거가 반환되지 않는 경우, C. reinhardtii에가장 가까운 종으로 시작하여 다른 유기체에서 관련 단백질을 식별한 다음, NCBI PSI-BLAST 서버를 사용하여 프로파일 기반 검색을 수행하고 C. reinhardtii(taxid:3055)에서 비중복 단백질(nr)을 사용하여12명의관련 유전자 를 식별합니다.</li>
	<li>EMBL-EBI Pfam(http://pfam.xfam.org/search) 또는 InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/) 단백질 도메인 예측 서버를 통해 블라스트 히트를 쿼리하여 검색된 EC 번호와 관련성을 < 0.05의 E 값으로 PSI-BLAST 히트를 수동으로 선별합니다. 후자의 두 검사는 단백질에 대한 올바른 효소 활성의 식별을 보장하기 위한 중요한 단계입니다.</li>
</ol>4. 모델 개선 및 평가
<ol><li>최신 COBRA 툴박스 v.3.0 사용28마트랩에서29,30모델 개선을 위한 다음 단계를 수행할 수 있습니다. COBRA 도구 상자는 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/installation.html 단계를 따라 설치할 수 있습니다. 또는 코브라 툴박스는 파이썬(COBRApy)과 같은 다른 오픈 소스 프로그래밍 언어에서도 구현됩니다.31) https://opencobra.github.io/cobrapy/ .<ol><li>COBRA 도구 상자 v.3.0을 설치한 후 MATLAB을 열고 다음 명령을 실행하여 도구 상자를 초기화합니다. 이니코브라툴박스;</li>
		<li>코브라 툴박스 기능을 사용하여 iRC1080과 같은 대사 모델에 관련 유전자를 이용한 확인된 반응을 추가하여 반응을 더하고 유전자 연결을 변경한다. iRC1080 모델을 포함하는 디렉터리로 이동하여 http://bigg.ucsd.edu/models/iRC1080 다운로드한 다음 명령을 실행하여 모델을 로드하고 이름을 변경한 다음 새로운 반응 및 관련 유전자를 추가합니다. 부하('iRC 1080.mat') modelNew = iRC 1080; 모델 뉴 = 추가 반응 (모델 새로운, 'D-ALA 2', ... {'d-ala[c]' , 'atp[c]' , ... 'D-알라데이터[c]', 'adp[c]' , 'pi[c]' , ... 'h[c]' },[- 2 - 1 1 1 1],거짓); modelNEW = 변경유전자 협회 (모델 새로운, ... 'D-ALA 2','au.g 14655 _t 1' );</li>
		<li>어떤 경우에는 대사산물이 세포내에서 생산되지 않고 매체에서 채택될 때, 모델에 새로운 대사산물에 대한 수송 반응을 추가한다. 이러한 수송 반응은 세포외 배지에서 사이토솔까지 대사산물의 수동확산을 나타낸다. 또한, 상기 addExchangeRxn 기능을 이용하여 대응하는 인공 교환 반응을 추가하여 대사산물을 세포외 배지로 입력하거나 출력한다. 모델 뉴 = 추가 반응 (모델 새로운, 'CYCPt', ... {'cycp[e]','cycp[c]' },[- 1],true)' modelNew = addExchangeRxn (modelNew, 'cycp[e]', - 1000,1000);</li>
		<li>새로운 결과 모델,예를 들어, iBD1106의 동작을 객관적인 기능으로 바이오매스의 극대화를 위한 밝고 어두운 조건하에서 기능 최적화CbModel을 사용하여 플럭스 밸런스 분석(FBA)을 수행하여 테스트한다. 광 성장을 위해 PRISM 태양 리소의 빛 반응의 하부 및 상한을 646.07(최대 속도)로 설정합니다. 어두운 성장을 위해 모든 PRISM 빛 반응의 경계를 0으로 설정합니다. 어둡고 가벼운 조건에서 성장을 위해 이전에10으로 정의된 Biomass 함수를 사용합니다. FBA 솔루션은 반응 플럭스(solution.v) 및 비용 절감(solution.w)에 대응하는 두 개의 벡터와 대사 산물의 그림자 가격(solution.y)에 대응하는 하나의 벡터를 출력합니다. %빛 조건에서 성장을 시뮬레이션합니다. 모델 뉴 = 변경RxnBounds (모델새로운,{... % 'PRISM_solar_litho', ... 'PRISM_solar_exo', ... 'PRISM_incandescent_ 60 W', ... 'PRISM_fluorescent_cool_ 215 W', ... 'PRISM_metal_halide', ... 'PRISM_high_pressure_sodium', ... 'PRISM_growth_room', ... 'PRISM_white_LED', ... 'PRISM_red_LED_array_ 653 nm', ... 'PRISM_red_LED_ 674 nm', ... 'PRISM_fluorescent_warm_ 18 W', ... 'PRISM_design_growth', ... }, 0, 'b' ); modelNew = 변경 목표(modelNew, 'BIOMASS_Chlamy_mixo'); FBAsolutionNew = 최적화CbModel(모델뉴, 최대));</li>
		<li>i RC1080에 대해 4.1.4를 반복하여 iBD1106에 대해 얻은 FBA 솔루션과 iRC1080을 위해 얻은 솔루션과 비교합니다.</li>
		<li>모델을 비교하는 데 사용할 수 있는 다양한 COBRA 방법이 있습니다(예: 플럭스 가변성 분석, 유전자 삭제 연구, 견고성 분석, 플럭스 분할 예측, FBA, 샘플링 등). 자세한 자습서는 https://opencobra.github.io/cobratoolbox/stable/tutorials/index.html 찾을 수 있습니다. 여기서, i RC1080 모델이 각 모델에서 차지하는 대사산물의 그림자 가격(시스템 변수의 변화에 대한 바이오매스 객관적 함수의 감도)을 얻어, 정제된 버전, iBD1106과 비교되는 예가 제공된다. 대사 산물에 대한 그림자 가격을 가져옵니다 : 그림자가격 = 테이블(modelNew.mets, ... modelNew.metnames, FBAsolutionNew.y);</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

녹색 미세알가, C. reinhardtii의대사 표현은 여기에서 높은 처리량 PM 분석 플레이트 및 수정되지 않은 PMI를 사용하여 설명되었다. 이 소는 펩타이드 질소 공급원(PM06-08)과 함께 총 190개의 탄소 공급원(PM01 및 PM02), 95개의 질소 공급원(PM03), 59개의 인 소스 및 35개의 황 공급원(PM04)을 위해 활용되었다. 양성 호흡은 148개의 영양소(C-source 활용을 위한 1개의 긍정적인 분석, 각각S-source 및 P-source 활용에 대한 4개의 긍정적인 분석, 그리고 N-source 활용을 위한 139개의 양성 분석)에 대해 관찰되었다. 매체의 기질 또는 영양소(탄소, 질소, 인 또는 유황) 성분은 각 소스에 대해 테스트하는 관련 PM 마이크로플레이트에 적용될 때 정의된 매체에 첨가해서는 안 된다.
여기에 도시된 방법은 기존 대사 네트워크 모델을 확장하거나 새로운 모델의 재구성을 지시하는 데 사용될 수 있는 대사 미세조류 표현형을 특성화하는 데 효과적이다. 또한 대부분의 미세 조류의 영양 요구 사항이 알려지지 않았기 때문에 이 플랫폼을 사용하여 이러한 플랫폼을 신속하게 정의할 수 있습니다. 넬슨 외. 43은 이러한 방법을 성공적으로 적용하여 미세조류 클로로이듐 Sp의 성장을 지원하는 새로운 화합물을 식별하고, 클라미도모나스와 는 달리 40개의 다른 탄소 공급원을 포함하는 종 진입 대사산물을 정의하는 데 얻은 정보를 사용했다.
미세 조류 프로파일링을위한 PM의 한 가지 주요 제한은 PMI가 잠복실에 조명이 없고 미세 조류가 이종국 대사를 수행 할 수 있어야한다는 것입니다. 빛의 부재는 신진 대사 플럭스를 계산하기 위해 빛을 통합 하는 모델의 해석에 영향을 미칠 수 있습니다. 조정 기능을 갖는 유전자 쌍은 신진 대사 네트워크 허브를 구성하기 위해 공동 진화하였으며 광합성 및 비광합성 네트워크 허브 간의 구별을44로만들 수 있다. 일반적으로 광합성 네트워크 허브(예: 모델의 고도로 연결된 노드)는 이종성 모델에서 제외됩니다. 실용적인 목적을 위해, mixotrophic 종에서 이종성 위를 모델링하는 것은 빛에 의해 구동되는 것으로 알려진 반응을 생략하고 조건 간의 에너지 균형 차이를 설명해야합니다. 따라서, 빛에 의존적이고 가벼운 독립적인 신진대사를 모델링하는 것은 클라미도모나스 대사 모델링6,45에서표준 관행이다.
Trebouxiophytes 같이 몇몇 녹색 미세조류는, 성장을 위한 탄소 분자의 다양한 동화하기 위하여 알려지고, 이것은 lichens의 일원으로 그들의 긴 진화 역사에서 생겨난 것으로 생각됩니다46. 클라미도모나스와 같은 엽록소는 성장을 위해 아세테이트를 사용할 수 있지만, 매우 긴 사슬의 고도 불포화 지방산(VLC-PUFA)을 상업적으로 생산할 수 있는 잠재력으로 알려진 갈색 해양 미세알가 티조크리시스 루테아는 아세테이트를 사용할 수 없지만47년성장을 위해 글리세롤을 사용할 수 있다. 100gl-1 건조 세포 중량의 바이오매스 농도는 공급 배치 모드48에유기 탄소 원을 최적화한 첨가와 함께 클로렐라로 달성되었다. 또한, 클로렐라불가리에 설탕을 첨가하면CO2의 격리를 촉진하여 광합성 성장 시 첨가제 혜택을 제공할 수있다(49). 대부분의 이종국형 미세조류는 혼합형으로 성장할 수 있지만, 엽록토 염색체 소포링기엔시스는 설탕50을첨가하면 광합성을 차단하는 것으로 나타났다.
디아톤, 분열 바실라리오피타에 속하는, 식물성 플랑크톤의 주요 그룹입니다. 대부분의 투이음은 광토영양적으로만 성장할 수 있지만, 그 중 일부는 혼합또는 이종성51을재배할 수 있다. 예를 들어, 글리세롤은 모델 종 Phaeodactylum tricornutum(52)을포함하는 일부 규음에서CO2가 없는 상태에서 빛의 성장을 지원하는 것으로 나타났다. 또한, 니츠치아 리니시스와 같은 일부 벤딕 규격은 어두운53에서탄수화물에서 자랄 수 있다. 세포가 이종성으로 성장할 수 있도록 적절한 유기 탄소 원을 보충함으로써 PM 측정기 및 기타 조류 그룹에 PM 애서를 확장할 가능성이 있으며, 혼합 측위 전략은 최소한의 필수 광 공급을 제공하는 의무 적인 자가 영양축미세 조류에 잠재적으로 사용될 수 있습니다.
데이터의 재현성을 평가하기 위해 모든 플레이트에 대해 중복 분석방법을 수행하는 것이 좋습니다. 분석은 음의 제어 및 각각의 빈 우물에서 빼낸 후, 흡광도(PMI 값)가 양성인 경우에만 양성으로 간주될 수 있다. 이 설명은, 시험된 화합물의 존재에서, 염료의 생체 내 반응을 배지와 반영한다.

표적 대사 산물의 향상되고 안정적인 생산을 위한 조류 대사를 최적화하려면 신진 대사 네트워크의 시스템 수준 분석을 통해 복잡한 신진 대사 엔지니어링 전략의 개발이 필요합니다. 신진 대사 네트워크 모델은 최적화전략1,2,3,4의급속한 발전을위한 합리적인 디자인을 안내 할 수 있습니다. 약 160개의 미세조류종이 5개 시퀀시되었지만, 우리의 지식에는 44개의 조류 대사 모델만4,6,7을사용할 수 있다. 게놈 정보의 실험적 검증을 위한 고처리량 대사 현상제 데이터를 얻는 데 어려움이 있기 때문에, 고품질 네트워크 모델의 재구성은 조류 게놈 시퀀싱의 급속한 발달에 뒤쳐진다.
C. reinhardtii는 조류 기반 연구를위한 매력적인 모델 시스템입니다. 이 종은 광연 또는 이종성 또는 이종성으로 성장할 수 있으며 기본 및 적용 연구에서 모델 유기체로 널리 사용되어 왔습니다. 그것의 게놈 순서는 2007년에 간행되었습니다8,게놈 규모의 신진 대사 모형은 이후에 종9,10,11를위해 재구성되었습니다. C. reinhardtii (iRC1080)에 대한 게놈 스케일 모델은 장 외에 의해 재구성되었다. 10 게놈 및 문학 증거에 따라 (수반 ~ 250 소스). 그것은 있다 1,706 대사 산물 와 2,190 반응10; 그러나 모델의 완전성은 당시 사용 가능한 게시된 실험 증거를 넘어서는 확인할 수 없었습니다.
표현형 미생물어레이(PMs) 기술은 이성영양 미생물뿐만 아니라 조직 배양 세포에 대한 대사 프로파일링 정보를 제공할 수 있는 고처리량 플랫폼이다. 특히, 클라미도모나스 레인하르트티(12)에대해 최초보고된 바와 같이, 마이크로조류에서 표현형-유전자형 지식 격차를 해결하는 데 사용될 수 있으며, 이후 클로로이듐13 및 클로렐라(14)의 종에 대해 서술할 수 있다. 수천 개의 대사 산물, 신호 분자, 삼투혈, 이펙터 분자에 대한 세포 반응을 연구함으로써 PM 에세이는 기능성 대사 프로파일링을 제공하고 기능, 신진 대사 및 환경 민감도15,16,17에대한 통찰력을 제공할 수 있다. 구체적으로, PM 어약은 각 우물에 포함된 다른 양분, 대사 산물 또는 삼투석이 있는 96웰 마이크로플레이트에서 세포 대사산물 활용을 검출한다. 또한 항생제 및 호르몬과 같은 생리 활성 분자를 분석할 수도 있습니다. 테트라졸륨 계 제독염의 NADH 감소에 의한 색 생산의 강도에 의해 결정된 바와 같이, 기판의 대사 활용은 세포호흡(15,16,17)의관점에서 평가된다. 96웰 마이크로플레이트의 실험은 표현형 마이크로어레이 기기(PMI) 플랫폼을 통해 시간이 지남에 따라 자동으로 모니터링및 확인할 수 있습니다. 20 96웰 마이크로플레이트는 다른 삼투성/이온 및 pH 효과와 함께 탄소, 질소, 황 및 인 소스를 활용하기 위해 세포 표현형을 연구하기 위해 일반적인 세트 대사 산물을 나타내도록 설계되었습니다. PM기술은 미생물15,16,17,18에대한 다수의 기존 게놈 규모의 대사 모델을 업데이트하고 업그레이드하는 데 성공적으로 사용되어 왔다.
여기에 표시된 프로토콜 및 데이터는 Chaiboonchoe 등의 이전에 게시 된 작품을 기반으로합니다. 12 제시된 작품에서는 미세조류의 대사 표현형을 특성화하고 C. reinhardtii의 기존 조류 대사 모델을 확장하고 새로운 대사 모델의 재구성을 안내하기 위해 PM 분석 방법의 사용을 상세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>97062-796</td><td></td></tr><tr><td>Biolog 분석 플레이트 [PM01-08]</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biolog Omnilog Instrument</td><td>Biolog, Hayward, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlamydomonas reinhardtii strain CC-503</td><td>Chlamydomonas Resource Center at the University of Minnesota, USA.</td><td></td><td>미네소타 대학교 리전트</td></tr><tr><td>카나마이신</td><td>VWR</td><td>0408-EU-10G</td><td></td></tr><tr><td>테트라 졸륨 바이올렛 염료 " 디"</td><td>Biolog, 헤이워드, 캘리포니아, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>GlaxoSmithKline Australia Pty Ltd</td><td>42010012-2</td><td></td></tr></tbody></table>

미세 조류의 모델 개선을 위한 높은 처리량 신진 대사 프로파일링

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

신진 대사 모델은 유기체의 사용 가능한 게놈 성서에 따라 재구성되고 시스템 수준에서 신진 대사 과정을 연구할 수있는 예측 도구를 제공합니다. 게놈 규모 대사 모델은 실험적으로 확인되지 않은 반응뿐만 아니라 갭을 포함할 수 있다. 새로 고립 된 미세 조류 종의 재구성 된 모델은 이러한 분리물의 대사에 사용할 수있는 일반적으로 희소한 생화학 적 증거가 있기 때문에 이러한 격차로 인해 약점을 초래할 것입니다. 표현형 마이크로어레이(PM) 기술은 다양한 항목 대사산물에 대응하여 세포 대사 활동을 기능적으로 결정하는 효과적인 고처리량 방법입니다. 높은 처리량 현상제 분석을 대사 모델링과 결합하면 기존의 신진 대사 네트워크 모델이 유전체 증거를 지원하고 확장하기 위해 생화학적 증거를 제공함으로써 빠르게 재구성하거나 최적화될 수 있습니다. 이 연구는 녹색 미세 조류 모델 종 Chlamydomonas reinhardtii를 예로 사용하여 미세 조류연구를 위한 PM 애서의 사용을 보여줍니다. PM에 의해 얻어진 254개 이상의 반응에 대한 실험적 증거는 이 연구에서 게놈 규모의 C. reinhardtii 대사 네트워크 모델iRC1080을 약 25% 확장하고 정제하는 데 사용되었습니다. 여기에서 생성된 프로토콜은 알려진 미세 조류 돌연변이및 새로운 분리제를 포함하여 다른 미세 조류의 신진 대사를 기능적으로 프로파일링하기 위한 기초로 사용될 수 있다.

이 프로토콜은 표현형 마이크로어레이(PM) 기술 플랫폼을 사용하여 녹색 미세조류인 클라미도모나스 레인하르트티의 대사 요건을 정의하고 기존 대사 네트워크 모델을 구체화하는 것을 보여줍니다.

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...

표현형 마이크로어레이 기술은 다양한 항목 대사산물에 대응하여 세포 대사 활동을 기능적으로 결정하는 효과적인 고처리량 방법입니다. 본 기술의 활용도는 테트라졸륨 계 레독스 염료의 NADH 감소에 의해 생성된 색 개발의 양에 의해 결정되는 세포 호흡의 형태로 측정된다. 이 작품에서는 모델 종 클라미도모나스 레인하르트티이를 사용하여 미세 조류의 맥락에서 표현형 마이크로 어레이 어레이 의 사용을 소개합니다.이 연구의 목적은 기존의 조류 대사 네트워크 모델을 확장하거나 새로운 모델의 재건을 안내하는 데 사용할 수있는 미세 조류의 대사 phenotyping을 특성화하기위한 신뢰할 수있는 방법을 확립하는 것입니다. 클라미도모나스 레인하르트티균CC-503은 미국 미네소타 대학교의 클라미도모나스 자원 센터에서 얻을 수 있다. 신선한 트리세테이트 인산염 지방 미디어에서 세포를 중간 로그 단계로 성장시면 됩니다.현미경의 밑에 세포를 확인해서 그(것)들이 좋은 모양이고 어떤 오염도 없는지 확인하십시오. 2000 G-force에서 10분 동안 문화를 회전시하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 상체를 버리십시오.0.1%테트라졸륨 바이올륨 염료 D"를 함유한 신선한 탭 미디어를 제조하여 세포에 타임틴틴, 암피실린, 카나마이신 등 다양한 항생제를 첨가하여 세균 성장을 억제한다. 지방 매체와이 단계는 각 플레이트 유형에 따라 영양소에서 생략해야합니다. 펠릿과 신선한 탭 미디어를 밀리리터당 100만 개의 세포로 다시 중단합니다.탄소 공급원, 질소 공급원, 인 및 황 소스 플레이트 및 펩타이드 질소 소스와 같은 화학 화합물 어레이 분석 플레이트를 사용합니다. 에세이 플레이트의 각 웰에 자체 함유 매체의 100 마이크로리터를 접종. 에세이를 복제해야 합니다.이 단계에서 세포는 세균 오염을 모니터링하기 위해 분석 전후에 그램 음성 얼룩으로 테스트되어야한다는 점에 유의해야합니다. 마이크로 플레이트 판독기 시스템에 화학 화합물 영역 분석 플레이트를 삽입합니다. 모든 플레이트를 최대 7일 동안 30도에서 배양하고 마이크로플레이트 판독기 시스템을 프로그래밍하여 15분마다 염료 색상 변화를 읽습니다.대부분의 마이크로 플레이트 판독기는 잠복하는 동안 연속 적인 빛의 근원을 제공하지 않기 때문에, 조류는 이성영양 호흡을 수행 할 수 있어야합니다. 마이크로 플레이트 판독기에서 원시 운동 데이터를 CSV 파일로 내보내면 표현형 마이크로 어레이 소프트웨어 패키지 및 소프트웨어에 대한 입력으로 사용됩니다. 표현형 마이크로어레이 데이터 분석을 수행하려면 R 소프트웨어 환경에서 실행되는 OmniLog 표현형 마이크로 Erik OPM 소프트웨어 패키지를 사용합니다.R 스튜디오에서 R의 그래픽 사용자 인터페이스는 원고에 자세히 설명된 명령을 사용하여 OPM 패키지와 종속성을 설치합니다. 운동 데이터의 CSV 파일을 포함하는 디렉터리로 이동하여 읽기 OPM 함수를 사용하여 데이터를 가져옵니다. 운동 데이터는 pref 매개 변수 추정을 사용하여 집계및 불연속화될 수 있습니다.함수 XY 플롯을 사용하면 호흡 또는 성장 측정을 분석 96 웰 플레이트의 시간 함수로 매핑할 수 있습니다. 데이터는 함수 수준 플롯을 사용하여 히트 맵으로 시각화하여 운동 데이터의 빠른 비교 개요를 허용할 수 있습니다. 다음 단계는 새로운 대사 산물과 관련된 반응과 유전자를 식별하는 것입니다.조류에 대한 기존 모델이 존재하는 경우, 표현형 마이크로어레이 시스템의 데이터 분석을 사용하여 이 모델을 구체화할 수 있다. 여기서 우리는 표현형 마이크로어레이 데이터를 사용하여 Chlamydomonas 모형을 위한 게놈 규모의 신진 대사 네트워크 정제를 위해 사용된 파이프라인을 제시합니다. 새로운 화합물 테스트가 활용을 위해 양성인 경우, 화합물의 관련 반응 프로파일은 대사 지식 기준을 사용하여 정의되어 관련 효소 커미션 번호를 제공한다.첫 번째 단계는 케그와 메타사이클을 검색하여 효소 커미션 번호, EC를 식별하여 화학 화합물 어레이에서 발견된 대사를 사용한 반응을 식별하는 것입니다. 다음으로, 당사는 확인된 EC 번호를 공동 게놈 연구소, JGI, Phytozome 및 피어 검토 간행물과 같은 다중 사용 가능한 조류 성서 자원에서 검색 기반으로 사용합니다. 코브라계 클라미도모나스 라인하르트티 대사 네트워크 모델iRC1080에 반응및 대사산물이 추가되어 모델을 확장하고 정제한다.EC 번호를 지원하는 유전적 증거가 발견되지 않으면 NCBI 위치 특이적 반복성, NCBI PSI-BLAST와 같은 프로파일 기반 검색이 반응과 관련된 후보 유전자를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 그런 다음 결과를 수동으로 평가합니다. 검색 EC 번호와 관련성을 위해 E 값0.05 미만으로 이 QC 단계를 전달하는 경우 메트릭 모델에 추가됩니다.이 프로토콜의 마지막 단계는 모델을 구체화하고 모델을 평가하고 비교하는 것입니다. 최신 COBRA 툴박스 버전 3.0과 MATLAB 플랫폼을 사용하여 모델 개선 단계를 수행합니다. 코브라 도구 상자를 설치한 후 iRC1080 모델을 다운로드할 수 있습니다.그런 다음 MATLAB에서 가장 먼저 해야 할 일은 참조 모델iRC1080을 포함하는 폴더로 이동하는 것입니다. 코브라 툴박스 기능을 사용하여 iRC1080과 같은 신진 대사 모델에 관련 유전자를 가진 확인된 반응을 추가합니다. 반응을 추가하고 유전자 협회를 변경합니다.iRC1080 모델이 포함된 디렉터리로 이동하여 모델을 로드하는 명령을 실행합니다. 이름을 바꾸고 새로운 반응과 관련 유전자를 추가합니다. 어떤 경우에는 대사산물이 세포내에서 생산되지 않고, 매체로부터 취항되는 경우, 새로운 대사산물에 대한 수송 반응은 세포외 배지로 대사산물을 입력하거나 출력하기 위해 추가/교환 반응 기능을 사용하여 모델에 추가되어야 한다.새로운 결과 및 모델, 예를 들어, iBD1106의 동작을 테스트하여, 플럭스 밸런스 분석을 수행하여 FBA, 이 기능을 사용하여 물체 함수로서 바이오매스의 최대화를 위해 밝고 어두운 조건에서 CB 모델을 최적화한다. 그 중에서도 FBA 솔루션은 반응 플럭스, 대사산물 그림자 가격 및 반응 감소 비용 세 벡터를 출력합니다. 여기서, iRC1080 모델이 각 모델에서 차지하는 변화 및 대사산물에 대한 바이오매스 객관적 기능의 감도를 나타내는 섀도우 가격을 획득하여, 정제된 버전iBD1106과 비교되는 예가 제공된다.여기서 우리는 각각 청록색과 보라색으로 블랭크 및 CC-503에 대한 탄소 원및 질소 소스 분석 플레이트의 호흡 XY 플롯 및 레벨 플롯을 보여줍니다. 각 우물 내에서 호흡 곡선은 시간 함수로서 감소하여 염료 변환을 나타냅니다. 패널 A의 강조 된 피크는 클라미도모나스 문학과 일치하는이 플레이트에서 유일한 탄소 원으로 아세테이트의 검출을 나타냅니다.세 가지 다른 방법을 사용하여 확인된 대사 산물의 수의 비교, iRC1080, 이는 잘 큐레이터 클라미도모나 대사 모델, 비행 GC-TOF의 가스 크로마토그래피 시간, 그리고 표현형 마이크로 어레이 에세이는 3 세트 사이에 6 개의 대사 산물 중첩을 보여줍니다, 동안 149 는 iRC108마이크로어레이로 iRC1088. 이것은 각 기술이 신진 대사 프로파일링 연구를 향해 힘을 가지고 있지만, 표현형 마이크로 어레이 분석 세트는 새로운 대사 정보의 중요한 근원이 될 수 있다는 것을 보여줍니다. 획득된 정보는 대사 네트워크 모델 iRC1080을 확장하고 정제하는 데 사용되었다.여기서, 우리는 iRC1080 모델의 함량과 확장 된 모델 iBD1106의 함량을 비교, 반응의 수, 대사 산물의 수와 유전자의 수를 포함. 모델 정제는 새로운 결과 네트워크에 254개 이상의 반응을 추가한 것으로 나타났습니다. 이러한 반응은 아미노산, 디펩티드, 트리펩티드 및 수송 반응으로 분류됩니다.새로 확인된 대사산물은 기존 클라미도모나스 라인하르트티 대사 모델의 대사 네트워크 확장 및 정제에 사용되었다. 표현형 마이크로어레이 어더세약은 기존 및 새로 분리된 균주의 대사 표현형을 특성화하는 데 사용될 수 있다. 또한, 미세 조류의 맥락에서 우리가 사용한 프로토콜은 다른 종의 대사 모델의 정제를 안내 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

기계적 세포 파괴, 용매 기반 지질 추출, 에스테르 교환 반응 및 정량 가스 크로마토 그래피를 사용하여 지방산의 식별에 기초하여 미세 조류의 지방산 함량 및 조성의 결정을위한 방법을 설명한다. tripentadecanoin 내부 표준 물질은 추출과 불완전 에스테르 교환시 가능한 손실을 보상하기 위해 사용된다.

미세 조류의 지방산 콘텐츠 및 조성 분석

미세조류 배양과 산업용 연도 가스의 통합은 궁극적으로 중금속 및 기타 무기 화합물을 성장 배지에 도입할 것입니다. 이 연구는 광생물반응기에서 자란 Nannochloropsis salina의 성장에 대한 중금속 및 무기 오염 물질의 최종 운명과 영향을 결정하는 데 사용되는 절차를 제시합니다.

중금속과 미세 조류의 생산성에 다른 무기 오염 물질의 정량화

식물 세포벽 구조 및 화학적 특성을 평가하여 바이오 연료 및 바이오 재료에 이상적인 공급 원료를 식별합니다. 표준 방법은 대규모 데이터 세트에 적용할 때 제한이 있습니다. 이러한 고처리량 전처리, 효소 당화 및 열분해 분자 빔 질량 분석 방법은 많은 수의 바이오매스 샘플을 비교하여 실험 시간과 비용을 줄입니다.

총 리그닌, 리그닌 단량체, 및 효소 설탕 자료 : 리그 노 셀룰로오스 바이오 매스의 반항의 변화의 높은 처리량 검열

2차원 가스 크로마토그래피-비행 시간 질량 분석 방법은 조류의 열수 액화에서 생성된 바이오 원유의 수성 분획을 특성화하기 위해 설명됩니다. 이 프로토콜은 또한 빠른 열분해, 촉매 빠른 열분해, 촉매 탈산소화 및 수소 처리에서 액체 생성물의 수성 분획을 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

비행 시간 형 질량 분석과 2D 가스 크로마토 그래피를 사용하여 조류의 열수 액화에서 수성 분수의 질적 특성

이 논문은 다른 방법과 관련하여 적절한 운동 성장 매개 변수를 추정하기 위해 사용할 수있는 벤치 규모의 광합성 생물 반응기의 조립 공정 및 작동에 대해 설명합니다. 이 시스템은 센서, 데이터 수집 및 제어 장치 및 오픈 소스 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 pH, 빛 및 온도를 지속적으로 모니터링합니다.

키네 성장 시험을위한 온도, 빛 및 pH 모니터링을 갖춘 벤치 규모의 조류 광합성 생물 반응기의 건설 및 설치

여기, 우리 실험실 규모 거품 열 photobioreactors를 생성 하 고 문화 microalgae를 그들을 사용 하 여 프로토콜을 제시. 그것은 또한 문화 성장 율 및 중립 지질 내용에 대 한 메서드를 제공합니다.

중립 지질에 대 한 녹색 미세 거품 열 Photobioreactors에 시험 재배

다중 생체 분자의 시스템 전반의 분석은 생물학적 과정에 대한 기능적 및 기계적 통찰력을 얻는 데 매우 중요합니다. 따라서, 광범위한 프로토콜은 동기화된 클라미도모나스 배양으로부터 수확된 단일 샘플로부터 지질, 대사산물, 단백질 및 전분의 높은 처리량 추출에 대해 설명된다.

녹색 조류 클라미도모나스 린하르티의 동기화 된 배양의 심층 분석을위한 다중 Omics 추출 방법

벤치 스케일, 축 재배는 후속 공정 확장 전에 미세 조류 특성화 및 생산성 최적화를 용이하게 합니다. 광생물 반응기는 신뢰할 수 있고 재현 가능한 미세 조류 실험에 필요한 제어를 제공하며 도시 또는 산업 연소 배출에서 부식성 가스(CO2,SO2,NO2)로미세 조류를 안전하게 경작하도록 조정할 수 있습니다.

부식성 연도 가스가 있는 벤치 스케일 광생물반응기에서 미세조류 재배 및 바이오매스 정량화

천연 가스 발전소 연도 가스의 이산화탄소를 활용하여 열린 경마장 연못에서 미세 조류를 재배하는 프로토콜이 설명되어 있습니다. 연도 가스 주입은 pH 센서로 제어되며, 미세조류 성장은 광학 밀도의 실시간 측정으로 모니터링됩니다.

발전소의 탄소 포집과 미세조류 재배를 위한 반자동 개방형 경마장 연못 결합

이 간행물은 맞춤형 조명 체계를 갖춘 실험실 광생물 반응기 (PBR)의 설계에 대해 설명합니다. 중탄산염을 탄소원으로 사용하는 시아노박테리아 또는 미세조류의 성장은 용적 산소 생산을 측정함으로써 지속적으로 모니터링됩니다. 이러한 PBR은 실험 중 사용자 개입이 거의없는 신속하고 복제 된 실험실 성장 비교를 용이하게합니다.

온라인 성장 측정 및 사용자 정의 가능한 조명 체계를 갖춘 실험실 광생물 반응기 운영

배우세요 Chlamydomonas reinhardtii를 이용한 고처리량 표현형 마이크로어레이 기술로 미세조류 신진대사 프로파일링을 수행하는 방법입니다. 이 프로토콜은 대사 네트워크 모델 개선과 새로운 대사 경로 발견에 활용됩니다.

미세 조류의 모델 개선을 위한 높은 처리량 신진 대사 프로파일링

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