Name: 미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 배우세요 미세 유체 장치에서 직류 펄스 자극으로 신경 전구체 세포를 분화하는 방법을. 이 기술은 실험 설정 시간과 시약 사용량을 줄여 신경계 질환 치료 전략 개발에 효율적입니다.

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저자는 마우스 신경 줄기와 전구 세포 (mNPC)를 제공하는 그의 도움에 대한, 생물 의학 과학 연구소, 학계 Sinica 교수 탕 K. 탕 교수에게 감사드립니다. 저자는 또한 MNPC의 차별화에 대한 귀중한 토론을 위해 탕 K. 탕 교수와 이잉산 교수에게 감사를 표합니다.

1. MOE 칩의 설계 및 제조
<ol><li>개별 폴리메틸 메타크릴레이트(PMMA) 레이어 및 적절한 소프트웨어를 사용하여 양면 테이프에 대한 패턴을그립니다(그림 1A,재료의 표). CO2 레이저 기계 스크라이브(도1B)로PMMA 시트와 양면 테이프를 모두 잘라냅니다.<ol>
<li>CO2 레이저 스크라이브를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다. 소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다.</li>
		<li>PMMA 시트(275mm x 400mm) 또는 양면 테이프(210mm x 297mm)를 레이저 스크라이브(그림2A)의플랫폼에 놓습니다. 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저를 집중합니다.</li>
		<li>레이저 스크라이브를 프린터로 선택한 다음 레이저 스크라이브를 사용하여 패턴을 "인쇄"하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작하고 PMMA 시트 또는테이프(도 2B)에서개별 패턴을 얻습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소하십시오. 참고: PMMA 패턴의 도면 및 PMMA 시트의 직접 가공은 이전 보고서17에따라 수행되었다.</li>
	<li>PMMA 시트의 여러 층을 결합하기 위해, 1mm PMMA 시트의 3 개 조각 (레이어 1, 2 및 3)을 쌓고 110 °C에서 30 분 동안 열 본더에서 5kg / cm2의 압력하에서 결합하여 유동 / 전기 자극 채널 어셈블리(그림 2C)를형성합니다. 참고: 상업적으로 획득한 PMMA 시트의 상이한 배치는 약간 다른 유리 전이 온도(Tg)를 가지는 데. 최적의 접합 온도는 Tg에 가까운 5°C 증분에서 테스트해야 합니다.</li>
	<li>빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제로 MOE 칩 어셈블리의 레이어 1의 개별 개구부에 12개의 어댑터를 부착합니다. 참고: 어댑터는 사출 성형에 의해 PMMA로 만들어집니다. 하단의 평평한 표면은 MOE 칩에 연결하기 위한 것입니다. 1/4W-28 의 여성 나사 스레드가 있는 어댑터는 흰색 손가락이 단단한 플러그, 평평한 바닥 커넥터 또는 Luer 어댑터를 연결하기 위한 것입니다. 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용할 때는 주의하십시오. 눈에 튀는 것을 피하십시오.</li>
	<li>칩 조립 전에 30분 동안 자외선(UV) 조사를 이용하여 1mm PMMA 기판(Layer 1-3), 양면 테이프(Layer 4), 및 3mm 광학 등급PMMA(Layer 5)를 소독한다.</li>
	<li>PMMA 어셈블리(도 1-5)를 완료하기 위해 양면 테이프(Layer 4)와 함께 3mm 광학 등급 PMMA(Layer 5)에 1mmPMMA 기판(Layer 1-3)을 부착한다.</li>
	<li>칩의 조립을 위해 깨끗한 커버 유리를 준비합니다.<ol>
<li>스테인링 항아리에 세제의 10배 희석제를 채우고(재료의 표참조) 초음파 클리너를 사용하여 이 세제의 커버 글래스를 15분 간 청소합니다.</li>
		<li>흐르는 수돗물 아래에 염색 항아리를 철저히 헹구어 세제의 모든 흔적을 제거합니다.</li>
		<li>증류수로 헹구어 수돗물의 모든 흔적을 제거하고 1.7.2단계를 두 번 반복합니다.</li>
		<li>질소 가스로 불어 청소 된 커버 유리를 건조.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMMA 어셈블리(레이어 1-5), 양면 테이프(Layer 6), 및 칩 조립 전에 30분 동안 생물안전 캐비닛 내부의 UV 조사를 사용하여 커버글래스(Layer7)를 소독한다.</li>
	<li>양면 테이프(도 6)로 청소된 커버 글래스(레이어7)를PMMA 어셈블리(레이어 1-5레이어)에 부착한다.</li>
	<li>하룻밤 진공 챔버에서 MOE 칩을 배양; 후속 절차에 대한 MOE 칩 어셈블리를사용합니다(그림 3).</li>
</ol>2. 세포 배양 영역의 기판에 폴리 L-리신(PLL)을 코팅
<ol><li>폴리테트라플루오로틸렌 튜브, 플랫 바텀 커넥터, 콘 커넥터, 콘-루어 어댑터, 화이트 핑거 타이트 플러그(스토퍼라고도 함), 루어 어댑터, 루어 잠금 주사기 및 검은 고무붕(그림 4A,재료 표)을 준비한다. 위의 모든 부품을 121°C에서 30분 동안 자동 복제로 살균합니다.</li>
	<li>흰색 손가락 꽉 플러그와 함께 천 교량 어댑터(그림 1A)의개구부를 밀봉합니다. 중간 입구 및 콘센트 어댑터(도4B)를통해 평평한 하단 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결합니다. 콘 루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다.</li>
	<li>중간 입구의 3방향 스톱콕에 연결되는 3mL 주사기를 사용하여 0.01% PLL 용액2mL을 추가합니다(도4B <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> -).</li>
	<li>중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 3 mL 주사기를 연결(도 4B <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> -).</li>
	<li>PLL 용액으로 세포 배양 영역을 채웁니다. 코팅 용액을 천천히 앞뒤로 펌핑합니다. 문화 영역 내부의 솔루션을 밀봉하기 위해 두 개의 3 방향 스톱콕을 닫습니다.</li>
	<li>5% CO2 대기로 채워진 인큐베이터에서 하룻밤 동안 37°C에서 MOE 칩을 배양합니다.</li>
</ol>3. 소금 교량 네트워크 준비
<ol><li>다음 단계 2.6, 두 개의 3 방향 스톱콕을 열고 수동으로 두 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 펌핑하여 채널의 거품을 플러시.</li>
	<li>완벽한 매체(덜벡코의 수정된 이글의 매체/햄의 영양소 혼합물 F-12(DMEM/F12)로 구성된 줄기세포 유지보수 배지, 2% B-27 보충제, 20 ng/mL EGF, 및 20 ng/mL bFGF) 3 mL 주사기로 배지 입구의 3방향 스톱콕에연결(도 4B- <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61917/1.png" style="vertical-align: middle;"> 및 도 4B <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61917/3.png" style="vertical-align: middle;"> -).</li>
	<li>세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하기 위해 완전한 배지 3mL를 추가합니다. 중간 콘센트의 3 방향 스톱콕에 빈 5 mL 주사기를 연결(도 4B <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61917/4.png" style="vertical-align: middle;"> -).</li>
	<li>소금 교량네트워크(그림 5)를준비합니다.<ol>
<li>검은 고무 덩어리를 잘라 틈새를 생성하고, 검은 고무 붕을 통해 및 루어 잠금 주사기(도 4A)에은 (Ag)/실버 염화물 (AgCl) 전극을 삽입합니다.</li>
		<li>흰색 손가락 밀폐 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 3% 뜨거운 아가로즈를 주입하여 Luer 어댑터를 채웁니다. 참고: 뜨거운 아가로즈를 준비하기 위해, 100mL의 인산염 완충식식염수(PBS)에 아가로즈 분말 3g을 용해하고 121°C에서 30분 동안 오토클레이브로 살균한다.</li>
		<li>Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결합니다. 검은 고무 붕을 통해 3 % 뜨거운 아가로즈를 주입하여 주사기를 바늘로 사용하여 Luer 잠금 주사기를 채웁니다. 아가로즈가 식히고 굳어지도록 10-20분 간 허용합니다. 참고: 아가로즈의 부피 용량을 늘리기 위해 Luer 잠금 주사기가 Luer 어댑터(그림4 및 도 5)에장착됩니다. 그런 다음 대형 전극을 Luer 잠금 주사기에 삽입합니다. 전극은 장기 실험을 위해 안정적인 전기 자극을 제공할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mNPC 준비
<ol><li>mNNP1을 5%CO2 대기로 채워진 인큐베이터에서 37°C에서 37°C에서 25T 세포 배양 플라스크에서 완전한 배지로 배양한다. 세포를 3-4일마다 배양하고, 원래 소스로부터 3-8개의 구절을 거친 세포를 가진 모든 실험을 수행한다.</li>
	<li>세포 현탁액을 15mL 원문 튜브로 옮기고, 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운한다. 슈퍼나탈을 흡인시키고, 1x 덜벡코의 PBS(DPBS)로 신경구를 씻는다. 신경구를 100 × g에서 5분 동안 스핀다운합니다.</li>
	<li>1x DPBS를 흡인한 다음 전체 배지에서 신경구를 다시 분리합니다. 철저하고 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>콘센트의 3방향 스톱콕에 연결되는 1mL 주사기를 사용하여 신경권 서스펜션 1mL를 추가한다(도4B <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61917/2.png" style="vertical-align: middle;"> -).</li>
</ol>5. DC 펄스 자극을위한 미세 유체 시스템의 설정(그림 6)
<ol><li>프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다. 참고: ITO 표면 온도는 비례 일체형 유도체 제어기에 의해 제어되고 37°C에서 유지됩니다. K형 열전대는 칩 내의 세포 배양 영역의 온도를 모니터링하기 위해 칩과 ITO 히터 사이에 고정된다. MOE 칩은 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 전동 단계에 설치되며 개별 채널 섹션에서 자동 타임랩스 이미지 획득에 적합합니다. ITO 히터의 제조 및 세포 배양 가열 시스템의 설정은 이전에18,19로기술되었다.</li>
	<li>중간 콘센트를 통해 MOE 칩에 수동 펌핑하여 mNPC를 주입합니다. 세포 시드 MOE 칩을 37°C ITO 히터에 4시간 동안 배양한다.</li>
	<li>4시간 후, 주사기 펌프를 사용하여 20 μL/h의 유량으로 매체 입구를 통해 MOE 칩을 통해 전체 배지를 펌핑한다. 참고: mNNC는 EF 자극 전에 추가로 24시간 동안 칩에서 재배되고 유지되어 세포 부착 및 성장을 허용합니다. 폐액은 도 6A에서"폐기물"로 표시된 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결된 빈 5mL 주사기로 수거된다. MOE 미세 유체 시스템 구성은 도 6에도시되어 있다. 이 미세 유체 시스템은 세포에 영양의 지속적인 공급을 제공합니다. 완전한 신선한 매체는 일정한 pH 값을 유지하기 위해 MOE 칩으로 지속적으로 펌핑됩니다. 따라서, 세포는 CO2 인큐베이터 외부에서 배양될 수 있다.</li>
	<li>전기 전선을 사용하여 칩의 Ag/AgCl 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 기능 발생기를 증폭기에 연결하여 50% 듀티 사이클(50% 시간 켜기 및 50% 시간 간격)에서 100Hz의 주파수에서 300mV/mm의 크기로 출력제곱파 DC 펄스를 출력합니다(50% 시간 온 및 50% 시간 끄기)(그림6B).<ol>
<li>전선을 EF 멀티플렉서에 연결합니다. Ag/AgCl 전극을 통해 전기 와이어를 MOE 칩에 연결합니다.</li>
		<li>EF 멀티플렉서를 전선을 사용하여 증폭기에 연결합니다. 기능 생성기를 앰프 및 디지털 오실로스코프에 연결합니다. 참고: EF 멀티플렉서는 회로내 배양 챔버의 임피던스를 포함하고 병렬 전자 네트워크의 모든 개별 챔버를 연결하는 회로입니다. 3개의 배양 챔버는 각각 멀티플렉스에서 가변 저항기(Vr) 및 심미터(도 6A에서μA로 도시됨)에 연재되어 전기적으로 연결된다. 각 배양챔버를 통한 전류는 Vr을 제어하여 다양하며, 전류는 해당 심미터상에 도시된다. 각 세포 배양 영역의 전기장 강도는 옴의 법칙, I=θEA에 의해 계산되었으며, 여기서 나는 전류, σ(DMEM/F1220에대한 1.38S·m-1로 설정)은 배양 배지의 전기 전도도이며, E는 전기장이며, A는 전기챔버의 단면 영역이다. 도 1에도시된 세포 배양 영역 치수의 경우, 전류는 DC 및 DC 펄스에 대해 각각 50% 듀티 사이클에서 ~87mA 및 ~44mA이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>mNPC를 48h의 100Hz 주파수에서 300mV/mm의 크기로 DC 펄스를 제곱하도록 합니다. 세포에 적절한 영양을 공급하고 매체에서 일정한 pH 값을 유지하기 위해 10 μL/h의 속도로 전체 배지를 지속적으로 펌핑합니다.</li>
</ol>6. 펄스 DC 자극 후 mNpC의 면역 불광 분석
참고: 이 단계에서는 모든 시약이 주사기 펌프를 사용하여 중간 입구를 통해 펌핑됩니다.
<ol><li>1번 시드 후 3, 7일 또는 14일 동안체외(DIV)를 배양한 후, 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 세포를 세척한다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 수정합니다. 1x PBS를 대체하기 위해 25 μL/min의 유속으로 칩에 4% PFA를 펌프합니다. 4% PFA를 대체하려면 20분 동안 25 μL/min의 유속도로 1x PBS로 셀을 세척하십시오.</li>
	<li>0.1% 트리톤 X-100을 50 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 6분 동안 투과하여 세포를 침투한다. 유량을 50 μL/h로 줄여 30분 동안 세포와 반응합니다. 0.1% 트리톤 X-100을 대체하려면 6분 동안 50 μL/min의 유속도로 셀을 1x PBS로 세척합니다.</li>
	<li>비특이적 항체 결합을 감소시키기 위해 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS를 사용하여 세포를 차단한다. 1% BSA를 칩에 50 μL/min의 유속으로 6분 동안 펌핑합니다. 유량을 100 μL/h로 줄이고 1시간 동안 펌프합니다.</li>
	<li>6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩내내면역스테인링을 위한 항체를 펌핑하고, 칩을 4°C에서 18시간 동안 배양한다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.</li>
	<li>알렉사 플루오르-컨쥬게이드 이차 항체를 6분 동안 50 μL/min의 유속으로 칩에 펌핑한다. 유량을 50 μL/h로 줄이고 어두운 실온에서 항체를 1시간 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.</li>
	<li>핵 염색의 경우, 호흐트스트 33342를 20 μL/분의 유속으로 칩에 넣고 어둠 속에서 실온에서 10분 동안 펌핑합니다. 15 분 동안 50 μL /min의 유속도로 1 x PBS로 셀을 씻으셔.</li>
	<li>면역 염색 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰한다.</li>
</ol>7. 이미지 분석 및 데이터 처리
<ol><li>내장 된 측정 도구가있는 소프트웨어를 사용하여 형광 이미지를 분석합니다 (재료 표참조).</li>
	<li>대조군 및 치료군에서 Hoechst-counterstained 핵(총 세포 수)을 비교하고 각 표현성 마커를 발현하는 세포의 백분율을 계산합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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MOE 칩을 제작하는 동안 어댑터는 빠르게 작용하는 시아노아크라일트 접착제를 사용하여 MOE 칩의 레이어 1에 부착됩니다. 접착제는 어댑터의 4 모서리에 적용된 다음 어댑터 위에 압력이 균등하게 적용됩니다. 접착제의 완전한 중합을 보장하기 위해 과도한 양의 접착제를 피해야합니다. 또한 완성된 MOE 칩 어셈블리는 진공 챔버에서 배양됩니다. 이 단계는 PMMA 층, 양면 테이프 및 커버 글래스 사이의 거품을 제거하는 데 도움이됩니다.
전극 물질의 선택은 매체에 풍부하게 존재하는 염화물 이온이 세포 배양 영역을 통해 흐르는 전해질 제품이라는 사실에 근거한다. EF 자극 실험 동안 전극 주위의 pH는 일정하게 유지되었습니다. 전극 재료로서 백금(Pt)을 사용하는 간단한 구성은 물을 전해질 시키고수전전(H+) 및 수산화 이온(OH-)을 각각 양배 영역에서 pH 변화를 유도한다. Pt 전극의 사용을 피함으로써 EF 자극 실험 중 pH 변경 문제를 우...

신경 전구체 세포(NPC, 신경 줄기 및 전구세포라고도 함)는 신경퇴행성 치료 전략1에대한 유망한 후보일 수 있다. 차별화되지 않은 NPC는 자체 갱신 능력, 다중 효능 및 증식 능력2,3을가지고 있습니다. 이전 연구는 세포외 매트릭스와 분자 중재자가 NPC의 분화를 조절한다고 보고했습니다. 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF)는 NPC 증식을 촉진하여 미분화 상태4를유지한다.
이전 연구는 전기 자극이 분열5,마이그레이션6,7,8,분화1,9,10및 세포 사멸(11)과 같은 세포 생리적 활동을 조절할 수 있다고보고하였다. 전기장(EF)은 중추신경계 개발12,13,14의개발 및 재생에 중요한 역할을 한다. 2009년부터 2019년까지, 이 실험실은 미세유체 시스템1,6,7,8,15,16,17에서 EF의적용에대한 세포 반응을조사했다. 멀티채널, 광학적으로 투명한, 전기전술(MOE) 칩은 공초점 현미경검사법에 면역형광 염색에 적합하도록 설계되었습니다. 칩은 높은 광학 투명성과 좋은 내구성을 가지고 있으며, 하나의 연구에서 세 개의 독립적 인 자극 실험과 여러 면역 스테인드 조건의 동시 수행을 허용했다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 논문은 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템의 개발을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1mm PMMA 기판 (레이어 1-3)</td> <td>BHT</td><td>K2R20</td><td>폴리 메틸 메타 크릴 레이트 (PMMA),</td></tr><tr><td>http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html 15 mL 플라스틱 튜브</td><td>Protech Technology Enterprise Co., Ltd</td><td>CT-15-PL-TW</td><td>캡이있는 원뿔형 바닥 튜브, 조립, 사전 살균</td></tr><tr><td>된 3 mL 주사기</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>3mL 구강 주사기, 바늘 없음</td></tr><tr><td>3mm 광학 등급 PMMA (레이어 5)</td><td>CHI MEI Corporation</td><td>ACRYPOLY PMMA 시트</td><td>광학 등급 PMMA</td></tr><tr><td>3방향 스톱콕</td><td>NIPRO</td><td>NCN-3L</td><td>멸균 일회용 3방향 스톱콕</td></tr><tr><td>5mL 주사기</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3410</td><td>5mL 구강 주사기, 바늘 없음</td></tr><tr><td>어댑터</td><td>Dong Zhong Co., Ltd.</td><td>맞춤형</td><td>PMMA 어댑터</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Agarose, 저겔화 온도</td></tr><tr><td>증폭기</td><td>AA Lab Systems Ltd</td><td>A-304</td><td>고전압 증폭기</td></tr><tr><td>AutoCAD 소프트웨어</td><td>Autodesk</td><td>교육용 버전</td><td>제도</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td>B-27 보충제(50x), 비타민 A 제외</td></tr><tr><td>염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>는 재조합 인간 FGF-basic</td></tr><tr><td>검은색 고무 마개</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td>이라고도 합니다. <td>3 mL 구강 주사기에서, 바늘 없는</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td>차단 시약&nbsp;</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>HSIANGTAI</td><td>CV2060</td><td>원심분리기</td></tr><tr><td>CO2 레이저 스크라이버</td><td>Laser Tools and Technics Corp.&nbsp;</td><td>ILS-II</td><td>는 http://www.lttcorp.com/index.htm 콘 커넥터에서 구입했습니다.</td></tr><tr><td></td><td>IDEX Health & 과학</td><td>F-120X</td><td>원피스 핑거타이트 10-32 콘, 1/16" OD 천연</td></tr><tr><td>콘 루어 어댑터</td><td>IDEX 건강 & Science</td><td>P-659</td><td>Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK</td></tr><tr><td>컨포칼 형광 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5</td><td>Leica TCS SP5 사용자 설명서, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf</td></tr><tr><td>디지털 카메라</td><td>OLYMPUS</td><td>E-330</td><td>자동 타임랩스 이미지 획득</td></tr><tr><td>디지털 오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>TDS2024</td><td>전자 회로 또는 구성 요소에서 시간 경과에 따른 전압 또는 전류 신호를 측정하여 진폭과 주파수를 표시합니다.</td></tr><tr><td>양면 테이프</td><td>3M&nbsp;</td><td>PET 8018</td><td>http://en.thd.com.tw/</td></tr> <tr><td>Dulbecco'에서 구매 s 변형 된 독수리' s 매체 / 햄의 영양 혼합물 F-12 (DMEM / F12)</td><td>Gibco</td><td>12400024</td><td>DMEM / F-12, 분말, HEPES</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산 완충 식염수 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21600010</td><td>DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td></tr><tr><td>EF 멀티플렉서</td><td>Asiatic Sky Co., Ltd.</td><td>개별</td><td>채널에서 전류를 모니터링하고 제어하는</td></tr><tr><td>맞춤형 표피 성장 인자 (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>또한 재조합 인간 EGF라고도 불리는</td></tr><tr><td>빠른 행동 시아노아크릴레이트 접착제</td><td>3M&nbsp;</td><td>7004T</td><td>힘 즉시 접착제 (액체)</td></tr> <tr><td>편평한 바닥 연결관</td><td>IDEX 건강 & Science</td><td>P-206</td><td>플랜지리스 남성 너트 Delrin, 1/4-28 플랫-바텀, 1/16" OD 블루</td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td>Agilent Technologies</td><td>33120A</td><td>고성능 15 MHz 합성&nbsp; 함수 발생기&nbsp; 내장 임의 파형 기능</td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 IgG H& L (Alexa Fluor 488)</td> <td>Abcam</td><td>ab150117</td><td>염소 안티 마우스 IgG H & L (Alexa Fluor 488) 사전 흡착 염소</td></tr><tr><td>안티 토끼 IgG H & L (Alexa Fluor 555)</td><td>Abcam</td><td>ab150086</td><td>토끼 IgG에 대한 염소 다클론 2차 항체 - H& L (Alexa Fluor 555), 사전 흡착된</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>1.48v</td><td>형광 이미지를 분석하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>인듐&ndash; 주석&ndash; ITO</td><td>히터용</td><td>Merck</td><td>300739</td></tr><tr><td>유리</td><td>OLYMPUS</td><td>CKX41</td><td>세포 형태 관찰용</td></tr><tr><td>K-타입 열전대</td><td>Tecpel</td><td>TPK-02A</td><td>온도&nbsp; 열전대</td></tr><tr><td>Luer 접합기</td><td>IDEX 건강 & 과학</td><td>P618-01</td><td>루어 어댑터 암 루어 1/4-28 남성 폴리프로필렌</td></tr><tr><td>루어 잠금 주사기</td><td>TERUMO</td><td>DVR-3413</td><td>한천 염 브리지용</td></tr><tr><td>마우스 안티 GFAP</td><td>eBioscience</td><td>14-9892</td><td>성상세포 마커</td></tr><tr><td>희소돌기아교세포 &nbsp; 채점자&nbsp; O4&nbsp; 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB1326</td><td>희소돌기아교세포 마커</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>고정&nbsp; agent</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Basic Life</td><td>BL2651</td><td>Washing solution</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td><td>SIGMA</td><td>P4707</td><td>Coating solution</td></tr><tr><td>Precision cover glasses thickness No. 1.5H</td><td>MARIENFELD</td><td>107242</td><td>https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html</td></tr><tr><td>programmable X-Y-Z motorised stage</td><td>Tanlian Inc</td><td>맞춤</td><td>구매 http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm</td></tr><tr><td>비례&ndash; 통합&ndash; 파생 (PID) 컨트롤러</td><td>Toho Electronics</td><td>TTM-J4-R-AB</td><td>온도 컨트롤러&nbsp;</td></tr><tr><td>PTFE 튜브</td><td>Professional Plastics Inc. 대만 지사</td><td>외경 1/16 인치</td><td>흰색 반투명 PTFE 튜브</td></tr><tr><td>토끼 안티 Tuj1</td><td>Abcam</td><td>ab18207</td><td>뉴런 마커</td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>New Era Systems Inc</td><td>NE-1000</td><td>NE-1000 프로그래밍 가능한 단일 주사기 펌프</td></tr><tr><td>TFD4 세제</td><td>FRANKLAB</td><td>TFD4</td><td>커버 유리 세정제</td></tr><tr><td>열 접착제</td><td>Kuan-MIN 테크 Co.</td><td></td><td>http://kmtco.com.tw/</td></tr> <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>투과 용액</td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>LEO</td><td>LEO-300S</td><td>초음파 스테레오 청소기</td></tr><tr><td>진공 챔버</td><td>DENG YNG INSTRUMENTS CO., LTD.에서</td> 구매 사용자 정의<td>DOV-30</td><td>진공 건조 오븐</td></tr><tr><td>흰색 핑거타이트 플러그</td><td>IDEX 건강 & Science</td><td>P-316</td><td>1/4-28 플랫 바텀, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html</td></tr></tbody></table>

미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화

Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices

생리전기장(EF)은 세포 이동, 분화, 분열 및 사망에 중요한 역할을 합니다. 이 논문은 현미경 검사를 사용하여 장기 세포 분화 연구에 사용 된 미세 유체 세포 배양 시스템을 설명합니다. 미세 유체 시스템은 광학적으로 투명한 전기 전술 칩, 투명한 인듐 틴-옥사이드(ITO) 히터, 배양 미디어 충전 펌프, 전기 전원 공급 장치, 고주파 파워 앰프, EF 멀티플렉서, 프로그래밍 가능한 X-Y-Z 동력 단계, 그리고 디지털 카메라가 장착된 반전 위상 마이크로 콘트라스트 등 다음과 같은 주요 구성 요소로 구성됩니다. 미세 유체 시스템은 전반적인 실험 설정을 단순화하고 시약 및 시료 소비를 단순화하는 데 유용합니다. 이 작업은 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도 된 신경 줄기 및 전구 세포 (NPC)의 분화를 포함한다. 줄기 세포 유지 배지에서, 마우스 NPC (mNPC)는 DC 펄스 자극 후 뉴런, 성상 세포 및 올리고드 엔드로시테로 분화되었다. 결과는 간단한 DC 펄스 처리가 mNpCs의 운명을 통제할 수 있고 신경계 무질서를 위한 치료 전략을 개발하는 것을 이용될 수 있었다는 것을 건의합니다. 이 시스템은 여러 채널의 세포 배양, 장기 EF 자극, 세포 형태 학적 관찰 및 자동 시간 경과 이미지 수집에 사용할 수 있습니다. 이 미세 유체 시스템은 필요한 실험 시간을 단축할 뿐만 아니라 미세 환경에 대한 제어 정확도도 증가합니다.

MOE 칩의 상세한 구성은 도 1에도시된다. 미세 유체 칩은 실험 설정 크기, 샘플 볼륨 및 시약 볼륨을 줄이는 데 유익한 접근 방식을 제공합니다. MOE 칩은 단일 연구에서 3개의 독립적인 EF 자극 실험 및 여러 면역 염색 조건을 동시에 수행하도록설계되었습니다(그림 3). 또한 광학 적 투명성이 높은 MOE 칩은 공초점 현미경 검사에 적합합니다. MOE 칩은 또한 단일 실험에서 다른 세포 배양 조건(예를 들어, 다중 EF 자극, 여러 약물, 상이한 코팅 기판, 다중 일련의 세포의 효과)의 효과를 동시에 조사하도록 설계되었습니다.
mNPC는 제곱파 DC 펄스(100Hz 의 주파수에서 크기 300mV/mm)에 노출되었습니다. DC 펄스 자극은 48h를 위해 ...

이 연구에서는, 우리는 신경 줄기와 전구 세포 (NPC)의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다(NPC) 전적으로 미세 유체 시스템에서 직접 전류 (DC) 펄스 자극에 의해 유도.

Physiological electric fields (EF) play vital roles in cell migration, differentiation, division, and death. This paper describes a microfluidic cell ...

이 연구는 미세 유체 시스템에서 직접 전류 펄스 자극에 의해서만 유도되는 신경 전구체 세포의 분화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 실험 설정 시간, 샘플 볼륨 및 시약 볼륨을 줄이는 데 유익한 접근 방식을 제공합니다. 또한, MOE 칩은 공초점 현미경 관측에 적합합니다.간단한 직접 전류 펄스 치료는 마우스 신경 전구체 세포의 운명을 통제할 수 있고 신경계 무질서를 위한 치료 전략을 개발하는 데 이용될 수 있었습니다. 시작하려면 적절한 소프트웨어를 사용하여 개별 PMMA 레이어및 양면 테이프에 대한 패턴을 그립니다. 이산화탄소 레이저 스크라이브를 켜고 개인용 컴퓨터에 연결합니다.소프트웨어를 사용하여 설계된 패턴 파일을 엽니다. PMMA 시트 또는 양면 테이프를 레이저 스크라이브 플랫폼에 놓은 다음 자동 초점 도구를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프의 표면에 레이저를 집중시합니다. 프린터로 레이저 스크라이브를 선택한 다음 레이저 스크라이브를 사용하여 PMMA 시트 또는 양면 테이프에서 직접 절제를 시작합니다.PMMA 시트에서 보호 필름을 제거하고 질소 가스를 사용하여 표면을 청소하십시오. PMMA 시트의 여러 층을 결합하기 위해, 1mm PMMA 시트의 세 조각을 스택하고 흐름 또는 전기 자극 채널 조립을 형성하기 위해 110섭에서 30 분 동안 열 본더에 평방 센티미터 당 5 킬로그램의 압력으로 결합합니다. 빠른 작용 시아노아크라일트 접착제와 MOE 칩 어셈블리 중 하나에 개별 개구부에 어댑터 12 개를 부착합니다.칩 조립 하기 전에 30 분 동안 자외선 조사를 사용 하 여 1 밀리 미터 PMMA 기판, 양면 테이프 및 3 밀리 미터 광학 등급 PMMA를 소독. PMMA 어셈블리를 완료하기 위해 양면 테이프로 3밀리미터 광학 등급 PMMA의 1mm PMMA 기판을 부착합니다. 양면 테이프로 청소된 커버글래스를 PMMA 어셈블리에 부착합니다.흰색 손가락 꽉 플러그와 함께 한천 교량 어댑터의 개구부를 밀봉합니다. 중간 입구 및 콘센트 어댑터를 통해 평평한 하단 커넥터를 MOE 칩 어셈블리에 연결한 다음 콘 루어 어댑터를 3방향 스톱콕에 연결합니다. 중간 입구의 3방향 스톱콕에 연결되는 3밀리리터 주사기를 사용하여 0.01%PLL 용액 2개를 추가하고 빈 3밀리리터 주사기를 중간 콘센트의 3방향 스톱콕에 연결합니다.PLL 용액으로 세포 배양 영역을 채우고 코팅 용액을 앞뒤로 천천히 펌핑합니다. 문화 권 내의 용액을 밀봉하기 위해 두 개의 3 방향 스톱콕을 닫습니다. 5%의 이산화탄소 대기로 채워진 인큐베이터에서 하룻밤 사이에 MOE 칩을 37도의 인큐베이션으로 배양합니다.두 개의 3방향 스톱콕을 열고 두 주사기를 사용하여 채널에서 코팅 용액을 앞뒤로 수동으로 펌핑하여 채널의 거품을 제거합니다. 3밀리리터의 완전한 배지를 3밀리리터를 3밀리리터 주사기에 넣고 매질의 3방향 스톱콕에 연결하고 세포 배양 영역에서 코팅 용액을 대체하도록 추가한다. 흰색 손가락꽉 플러그를 Luer 어댑터로 교체하고 어댑터를 채우기 위해 3% 뜨거운 아가로즈를 주입합니다.Luer 잠금 주사기를 Luer 어댑터에 연결하고 검은 고무 봉을 통해 3 % 뜨거운 아가로즈를 주입하여 Luer 잠금 주사기를 채웁니다. 아가로즈가 식히고 굳히는 데 10-20분을 허용하십시오. 37°C에서 유지되는 프로그래밍 가능한 XYZ 전동 스테이지에 고정된 투명 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 설치합니다.mNPC를 중형 콘센트를 통해 MOE 칩으로 수동으로 펌핑한 다음 ITO 히터에 셀 시드 MOE 칩을 4시간 동안 배양합니다. 전기 전선을 사용하여 칩의 전극을 통해 EF 멀티플렉서를 MOE 칩에 연결합니다. EF 멀티플렉서와 기능 발생기를 증폭기와 연결하여 출력 사각파 DC 펄스를 제공합니다.MOE 칩의 모든 평평한 바닥 커넥터와 어댑터를 제거하고 어댑터를 PBS로 채운 다음 어댑터 개구부를 파라필름으로 밀봉합니다. 면역 염색 후, 공초점 형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰한다. DC 펄스 자극은 줄기 세포 유지 보수 매체에서 뉴런, 성상세포 및 올리고드엔드로키테로 분화되는 동시 mNPC의 결과.신경세포의 백분율, 성상세포, 및 올리고드엔드로시테스의 대조군과 자극 단에서 여기에 표시됩니다. DC 펄스 처리 후, mNNP는 DIV 7에서 상당히 많은 수의 뉴런을 표현했고, DIV 3의 성상세포, DIV 7 및 DIV 14의 올리고드엔드로키테스는 대조군보다 자극 군에서 상대적으로 높은 수준으로 존재하였다. 30~40개의 세포에 의해 형성된 신경구는 mNPC 분화를 개시하기 위해 바람직하다.mNPC의 과성장은 분화 과정에서 세포 생존을 손상시킬 것이다.

electric-field-induced-neural-precursor-cell-differentiation

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현은 소설 아가로 오스 겔 기반 microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포 (NSCs)의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 이 기술은 인간의 신경 줄기 세포와 같은 세포 소스가 없어서 다른 포유 동물 세포 시스템에 쉽게 적응할 수 있으며, 시간을 주변의 차례가 중요합니다.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

이 프로토콜은 세포를 추적할 수 있습니다 맞춤 디자인 electrotactic의 실에서 2D 및 3D 환경을 설정하는 데 사용 방법을...

2D 및 3D 환경에서 신경 전구 세포의 전기장 제어 감독 마이 그 레이션

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

이 비디오는 전기 자극을 통해 신경 줄기 및 전구 세포 또는 NPC를 구별하기 위해 세포 외 매트릭스로 코팅된 미세유체 칩을 사용하는 방법을 보여줍니다. 코팅된 부위에 파종하고 부착한 후 NPC는 성장하고 직류를 가하면 뉴런, 성상세포, 희소돌기아교세포로 분화됩니다.

전기자극 유도 신경줄기세포와 전구세포의 분화

이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 신경근 접합부의 형성을 보여줍니다. 신경 전구 세포와 근육 전구 세포는 장치 내의 다른 웰에 파종되고 각각 운동 뉴런과 근관으로 성숙하도록 방치됩니다. 부피와 화학적 구배의 생성은 활성 신경근 접합부의 발달로 이어집니다.

미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

이 비디오는 마이크로그루브 장벽으로 분리된 체세포와 축삭 구획으로 구성된 미세유체 장치를 사용하여 신경 줄기세포(NSC)의 분화를 보여줍니다. NSC는 체세포 구획에 도입되어 부착될 수 있습니다. NSC는 체세포 구획 내부의 뉴런으로 분화하고 마이크로 그루브 장벽을 통해 축삭 구획으로 축삭을 확장합니다.

Differentiation of Neural Stem Cells to Neurons Using a Compartmentalized Microfluidic Device

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 배양 뉴런에 순환 올레핀 공중합체로 성형된 구획화된 미세 유체 칩의 사용을 입증한다. 이 칩은 기존의 구획 형 폴리 (디메틸 실록산) 장치보다 사전 조립되고 사용하기 쉽습니다. 바이러스성 표지, 유동성 격리, 축사 절제술 및 면역 염색을 포함하여 다중 일반적인 실험 패러다임은 여기에서 기술됩니다.

사전 조립된 플라스틱 미세유체 칩 내에서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 구획화

우리는 1500 배양 장치, 향상된 연동 펌프의 배열및 현장 믹싱 계수로 구성된 복잡한 생명 기계에 대한 높은 처리량 연구를위한 미세 유체 시스템을 제시합니다. 미세 유체 칩은 생체 내 매우 복잡하고 역동적인 미세 환경 조건을 분석할 수 있게 해줍니다.

고처리량 미세 유체 장치를 사용하여 동적 환경 조건의 생성

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

유방암 세포는 비종양 유방 상피 세포와 비교하여 다른 유전 특성을 나타냅니다. 이러한 유전 특성의 차이에 기초하여, 두 집단은 면역 요법 목적으로 분리 될 수 있다는 가설이 세워졌다. 이를 지원하기 위해 MCF-7 및 MCF-10A 세포를 분류하는 미세 유체 장치를 모델링합니다.

AC 전기영동을 이용한 비전이성(MCF-7) 및 비종양(MCF-10A) 유방암 세포 분리를 위한 미세유체 장치

배우세요 미세 유체 장치에서 직류 펄스 자극으로 신경 전구체 세포를 분화하는 방법을. 이 기술은 실험 설정 시간과 시약 사용량을 줄여 신경계 질환 치료 전략 개발에 효율적입니다.

미세 유체 장치에서 전기장 유발 신경 전구체 세포 분화

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