분자 분석을 위한 소뇌 지역 해부

소뇌에 대한 전통적인 분자 연구는 전체 소뇌 추출물에 대해 수행되어 왔으며, 이는 특정 소뇌 부위 간의 차이를 가릴 수 있습니다. 이 프로토콜은 소뇌의 뚜렷한 영역을 개별적으로 평가할 수 있게 해주며 다양한 행동 및 질병 진행에 대한 고유한 기여의 기초가 될 수 있는 분자 메커니즘을 탐구할 수 있도록 합니다. 이 기술의 주요 장점은 4개의 소뇌 영역, 깊은 소뇌 핵, Vermis의 전방 및 후방 소뇌 피질, 반구의 소뇌 피질을 재현 가능하고 빠르게 해부

안락사된 쥐의 목을 베인 후 면도날로 머리의 내측 시상선을 따라 코에서 시작하여 다시 끝까지 절개합니다. 피부를 분리하고 면도날을 사용하여 양쪽 근육을 잘라내고 외이도를 지나 잘라냅니다. 해부 가위를 사용하여 뇌간이 소뇌와 만나는 지점까지 많은 척수 부위를 자르고 소뇌가 손상되지 않도록 주의합니다.

혈관 가위날 중 하나를 뇌간과 척추 사이의 공간에 삽입하고 외이도를 향해 자르고 위로 들어 올리면서 조직의 손상을 제한합니다. 두개골 가장자리를 따라 후각구를 향해 계속 자릅니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 두개골 뒤쪽을 부드럽게 떼어내어 뇌와 소뇌의 뒤쪽 영역을 드러냅니다.

뭉툭한 집게를 두개골의 절단된 가장자리를 따라 놓고 두개골을 위로 벗겨 뇌 위로 만듭니다. 혈관 가위와 뭉툭한 집게로 두개골의 나머지 부분을 잘라내고, 뇌 꼭대기에서 두개골 대부분을 제거한다. 마이크로 주걱으로 뇌를 살짝 들어 올려 남아 있는 두개골에서 후각구를 제거하고 시신경 섬유를 분리합니다.

이 시점에서 뇌는 쉽게 자유로워져야 합니다. 뇌를 페트리 접시에 넣고 얼음 위에 놓고 남아 있는 두개골이나 다른 파편을 제거합니다. 등쪽이 위로 향하게 하여 뇌를 뇌 매트릭스에 부드럽게 넣습니다.

매트릭스에서 수평으로 설정되어 있고 정중선이 중앙에 있는지 확인하십시오. 시상 정중선을 따라 하나의 면도날을 놓고 면도날이 매트릭스의 바닥까지 끝까지 밀도록 합니다. 첫 번째 면도날 옆으로 1mm 떨어진 곳에 다른 면도날을 놓습니다.

두 개의 블레이드를 더 배치하면 뇌의 한쪽에 모두 1mm 간격으로 세 개의 블레이드가 배치됩니다. 반대쪽에서도 이것을 반복하십시오. 면도날의 앞면과 뒤쪽 끝을 조심스럽게 잡고 매트릭스에서 똑바로 들어 올립니다.

면도날 바깥쪽에 있는 티슈는 버리십시오. 천천히 한 번에 하나의 면도날을 다른 면도날과 분리하고 조직 부분이 손상되지 않도록 주의하십시오. 티슈 부분을 면도날에서 밀어 내고 마이크로 주걱으로 유리 슬라이드에 놓습니다.

6개의 시상 뇌 단면을 수집해야 합니다. 가장 앞쪽 측면 섹션에는 DCN이 표시됩니다. DCN을 분리하려면 DCN 위에 수직으로 200마이크로리터 피펫 팁을 잡고 모든 방향으로 단단히 흔드는 조직을 통해 아래로 누릅니다.

피펫을 들어 올리고 팁에 조직이 있는지 육안으로 확인합니다. 한 손가락을 팁 상단에 놓고 아래로 누르면 조직이 부풀어 오릅니다. 올바르게 표시된 마이크로피시 튜브에 팁을 삽입하고 조직 펀치가 튜브 바닥에 놓였는지 확인합니다.

나머지 세 섹션에 대해 이 작업을 반복하여 DCN 펀치를 동일한 튜브에 배치합니다. 튜브를 액체 질소로 급속 동결합니다. DCN이 추출된 부분에서 소뇌 주위의 나머지 뇌 조직을 밀어냅니다.

뭉툭한 집게를 사용하여 이 반구 소뇌 피질 부분을 부드럽게 집어 각각의 마이크로피시 튜브에 넣은 다음 급속 동결합니다. 마지막 두 개의 vermal section은 주변 뇌 조직을 밀어내고 소뇌만 남깁니다. 면도날을 사용하여 앞쪽 소음순과 뒤쪽 소음순을 분리하여 절단합니다.

절단이 순순 6이 형성된 직후이고 순순 10을 포함하지 않는지 확인하십시오. 뭉툭한 집게를 사용하여 전방 소뇌 피질 절편과 후방 소뇌 피질 절편을 각각의 마이크로피시 튜브에 조심스럽게 넣고 튜브를 액체 질소에 5분 동안 그대로 두어 급속 동결합니다. 조직이 너무 빨리 해동되지 않도록 마이크로피시 튜브를 얼음 위에 놓고 마이크로피시 튜브에 150마이크로리터의 저온 RNA 분리 용액을 바른 다음 멸균된 유봉으로 균질화합니다.

조직이 균질화되면 용액을 위아래로 피펫팅하여 손상되지 않은 조직이 남아 있지 않도록 합니다. 또한 작은 조직 조각을 인슐린 주사기로 몇 번 당겨 분해합니다. 또 다른 350 마이크로 리터의 시약, 피펫을 위아래로 넣어 완전히 혼합하고 실온에서 5 분 동안 그대로 두십시오.

튜브에 클로로포름 150마이크로리터를 넣고 세게 흔든 다음 2-3분 동안 그대로 두십시오. 12, 000 번 G에서 15 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하고 원심분리기의 온도를 섭씨 4도로 설정합니다.

투명한 수성상만 새 튜브로 옮기고 불투명한 간상을 방해하지 않도록 주의하십시오. 튜브에 남아 있는 용액을 저장하거나 폐기합니다. 100% 이소프로필 알코올을 1:2 비율로 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.

샘플을 실온에서 10분 동안 그대로 두어 RNA를 용액에서 침전시킵니다. 12, 000 번 G와 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리기를 만들고 펠릿을 쉽게 시각화 할 수 있도록 모든 튜브를 동일한 방향으로 배치합니다. 원심분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 피펫으로 상층액을 제거하여 펠릿이 방해받지 않도록 합니다.

펠릿은 젤과 같아서 보기 어렵기 때문에 원심분리기의 튜브 방향에 따라 펠릿의 위치를 추정합니다. 모든 상등액을 제거한 후에, 75%ethanol의 500 마이크로리터를 추가하고, 짧게 와류 및 5 분 동안 7, 500 시간 G 및 4 섭씨 온도에 분리기를 두십시오. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오.

캡을 열어 5-10분 동안 샘플을 건조시킵니다. 건조되면 펠릿을 DNA의 자유수에 20마이크로리터로 DCN의 샘플에 재현탁하고 다른 모든 샘플의 경우 30마이크로리터에 재현탁합니다. 추가 분석이 있을 때까지 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

이 프로토콜은 마우스 소뇌의 4개의 뚜렷한 영역을 해부하고 유전자 발현의 지역적 차이를 탐색하는 데 사용되었습니다. 알돌라제 C, 파브알부민 및 KCNG4의 발현 수준은 실시간 정량 PCR을 사용하여 평가되었습니다. 알돌라제 C는 후방 소뇌 vermis에서 더 많이 발현됩니다.

그러나 DCN과 vermis의 앞쪽 영역은 벌크 소뇌 박리와 비교할 때 더 낮습니다. Parvalbumin은 벌크 소뇌 추출물과 비교할 때 DCN 전방 vermis, 후방 vermis 및 반구 소뇌 피질에 유사하게 존재합니다. KCNG4는 DCN과 내부 vermis에서 크게 농축되지만 bulk extraction과 비교할 때 후방 vermis 또는 hemisphere에서는 그렇지 않습니다.

소뇌 피질에서 알돌라제 C의 발현을 직접 비교하기 위해, 발현 수준을 전방(anterior vermis)과 비교했습니다. 알돌라제 C의 발현 수준은 후방 Vermis에서 유의하게 높았고 소뇌 반구에서 더 높은 경향을 보였습니다. 이 영역에서 추출한 RNA는 RNA 염기서열분석, 실험에도 사용할 수 있습니다.

소뇌 영역에 대한 RNA 염기서열분석(RNA seq)을 비교하면 이러한 영역의 이산 기능의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 보다 자세한 정보를 제공할 수 있습니다. 질병에 대한 취약성의 잠재적 차이뿐만 아니라.