Name: 아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 배우세요 성숙한 지방세포에서 역전염을 이용한 siRNA 및 microRNA 전달 방법을. 3T3-L1 세포를 사용하여 단백질 발현을 조절하고 인슐린 신호전달 및 포도당 흡수를 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 INSERM, 유니버시테 코트 다쥐르, 프랑스 국립 연구기관(ANR)이 향후 우수 연구소(Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01)와 우수 이니셔티브(Idexex UCAJEDI ANR-15-IDEX)를 통해 지원되었습니다. J.J.는 소시에테 프랑코폰 뒤 디아베테(SFD), 협회 프랑수아즈 데 에뛰드 에 드 레베시테(AFERO), 인스티투트 테마티크 멀티 유기체 테크놀로지스 부어 라 산테(ITMO), 벤자민-데레서트의 보조금으로 지원된다. J.G.는 ANR-18-CE14-0035-01에 의해 지원됩니다. J-F.T.는 ANR 보조금 ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01및 퐁당 부어 라 레체르체 메디칼 (Equipe FRM, DEQ20180839587)에 의해 지원됩니다. 또한 GIS IBISA 현미경 검사법과 이미징 플랫폼 코트 다쥐르(MICA)가 지원하는 콘세일 데파르테멘탈 데 알프스-마리타임스와 레지온 PACA가 지원하는 C3M의 이미징 코어 시설에 도 감사합니다.

참고: 멸균 기술을 사용하여 라미나르 유동 세포 배양 후드에서 프로토콜의 모든 단계를 수행합니다. 모든 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 뮤린 3T3-L1 섬유아세포를 지방세포로 분화
<ol><li>3T3-L1 섬유아세포는 피루바테 없이 배양 배지-DMEM, 25mM 포도당, 10% 신생아 종아리 혈청, 1% 페니실린 및 연쇄절제술(도1A)으로 3T3-L1섬유아세포를 성장시한다. 조직 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>인플루언서 후 이틀, 배양 배지를 변경, 피루바테, 25mM 포도당, 10% 태아 종아리 혈청(FCS), 1% 페니실린 및 연쇄상 구균신으로 대체하여 0.25mM 3-이소부틸-1-메틸산틴(IBMX), 0.25 μM dexamethasone, 5 μg/mL 참고: 세포가 100mm 접시당 300,000개의 세포에서 종자될 때 합의에 도달하는 데 5일이 걸립니다.</li>
	<li>이틀 후, 배양 배지를 피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균시(1% 페니실린 및 연쇄상 구균)로 대체하여 5 μg/mL 인슐린과 10μM 로시글리타존을 2일 동안 배양한다. 이어서, 피루바테, 25mM포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄상 구균(도1B)없이DMEM으로 2일마다 세포를 공급한다.</li>
	<li>3T3-L1 분화는 분화 프로토콜의 시작 후 7-8 일 트랜스펙트. 참고: 트랜스펙트 후 남은 섬유아세포의 확산을 피하기 위해 과잉 변환 전에 높은 수준의 분화(>80%)에 도달하는 것이 중요하며, 이는 결과를 편향시킬 수 있는 세포의 혼합된 집단으로 이어질 것이다.</li>
</ol>2. 프리코트 플레이트 준비
<ol><li>전 또는 몇 시간 전에, 1 mg/mL의 스톡 용액에서 30% 에탄올에 100 μg/mL에서 콜라겐 타입 I의 용액을 준비한다. 12웰 플레이트의 웰당 250 μL, 24웰 플레이트의 웰당 125 μL을 추가하고 용액을 우물 표면에 퍼놓습니다.</li>
	<li>콜라겐이 건조 될 때까지 배양 후드 아래에 뚜껑없이 접시를 둡니다. 덜벡코의 인산염 완충식식염(D-PBS)으로 두 번 씻으시다. 참고: 프리코트 플레이트를 구매할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 형질 전환 믹스의 준비
참고: siRNA의 최종 농도는 1과 100 nM (12 웰 플레이트의 웰 당 siRNA의 1 ~ 100 pmol)사이입니다. miR 모방의 최종 농도는 10 nM (10 pmol /well)입니다. 오프 타겟 효과를 피하기 위해 실험을 시작하기 전에 각 siRNA, miR 모방 또는 기타 올리고뉴클레오티드의 최상의 농도를 결정한다. 결과의 통계 분석을 용이하게하기 위해 삼중에서 형질 전환 실험을 수행합니다. 파이펫팅 중 정상적인 손실을 고려하여 모든 시약을 초과하여 준비합니다.
<ol><li>파이펫팅(부피/부피)을 개선된 최소 필수매체(표 1)와함께 siRNA(또는 기타 올리고뉴클레오티드)로 혼합한다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>회광 시약과 개선된 최소 필수 매체를 siRNA에 추가하고 파이펫을 혼합한다(표1). 실온에서 20분 동안 배양하십시오(이 기간 동안 4절로 진행). 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 트랜스펙트 믹스를 추가합니다.</li>
</ol>4. 3T3-L1 분리구 준비
<ol><li>D-PBS로 100mm 페트리 접시에 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 5배 트립신을 셀에 추가합니다(100mm 접시당 1mL)를 추가하여 트립신으로 모든 표면을 덮습니다. 30 s를 기다렸다 조심스럽게 트립신을 제거합니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 37°C에서 5-10분 동안 페트리 접시를 배양합니다. 100mm 접시를 탭하여 세포를 분리합니다.</li>
	<li>피루바테, 25mM 포도당, 10% FCS, 1% 페니실린 및 연쇄절제술없이 DMEM 10ml를 추가하여 트립신을 중화시합니다. 배지를 위아래로 조심스럽게 파이프하여 세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화합니다.</li>
	<li>말라세즈 카운팅 챔버 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 세포의 농도를 6.25 x 105 세포/mL로 조정한다. 종자 800 μL의 셀 서스펜션/웰의 12웰 플레이트(5 x 105 셀) 또는 24웰 플레이트(2.5 x 105 셀)의 셀 서스펜션/웰의 400 μl이 형질 혼합을 함유하고 있다. 참고: 100mm 페트리 접시 1개에 12웰 플레이트 또는 24웰 플레이트 1개를 준비할 수 있습니다. 100mm 접시에는 보통 6-7 x 106 개의 교포세포가 포함되어 있으며, 이는 12 웰 플레이트의 웰 당 5 x 105 교포구에 해당합니다.</li>
	<li>세포 배양 인큐베이터(7% CO2 및 37°C)에서 플레이트를 배양하고 24시간 동안 세포를 방해하지 않는다. 다음 날, 조심스럽게 피루바테, 25 mM 포도당, 10 % FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술없이 신선한 DMEM으로 상체를 교체하십시오. 참고: 세포를 콜라겐 전코팅 된 48- 및 96 웰 플레이트로 시드할 수도 있지만, 분포세포의 분리를 피하기 위해 미디어를 교체할 때 더 많은 예방 조치를 취할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 감염된 3T3-L1 선포세포의 기능분석
<ol><li>연구 대상 녹다운 24-48 h 및 48-96 h siRNA 또는 miR 모방 후 mRNA와 단백질에 대 한 전달, 각각.</li>
	<li>인슐린 신호, 포도당 섭취, 아디포핀 분비, lipolysis 및 리포발생을 연구하기 위해 감염된 지방세포의 기능적 분석을 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Klöting, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-sensitive+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Insulin-sensitive obesity.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).</li>
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<li>Ceppo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+Tpl2+kinase+in+inflammatory+changes+and+insulin+resistance+induced+by+the+interaction+between+adipocytes+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Implication of the Tpl2 kinase in inflammatory changes and insulin resistance induced by the interaction between adipocytes and macrophages.</a> Endocrinology. 155 (3), 951-964 (2014).</li>
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<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tpl2+kinase+is+upregulated+in+adipose+tissue+in+obesity+and+may+mediate+interleukin-1beta+and+tumor+necrosis+factor-%7Balpha%7D+effects+on+extracellular+signal-regulated+kinase+activation+and+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tpl2 kinase is upregulated in adipose tissue in obesity and may mediate interleukin-1beta and tumor necrosis factor-{alpha} effects on extracellular signal-regulated kinase activation and lipolysis.</a> Diabetes. 59 (1), 61-70 (2010).</li>
<li>Hart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-34a+as+hub+of+T+cell+regulation+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">miR-34a as hub of T cell regulation networks.</a> Journal of ImmunoTherapy of Cancer. 7, 187(2019).</li>
<li>Brandenburger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-34a+is+differentially+expressed+in+dorsal+root+ganglia+in+a+rat+model+of+chronic+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">MiR-34a is differentially expressed in dorsal root ganglia in a rat model of chronic neuropathic pain.</a> Neuroscience Letters. 708, 134365(2019).</li>
</ol>

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이 논문은 성숙한 지방세포의 분화 및 트랜스포션을 위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 역형 형질 방법은 시나, 마이크로 RNA 모방, 항마이크로 RNA 모방, 항마이크로RNA 와 같은 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 가장 어려운 세포주 중 하나인 3T3-L1 아디포사이클로 전환하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 메서드에는 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 이 프로토콜은 플라스미드 DNA를 가진 형질 전환에 대 한 효율적이 지 않습니다., 기능의 이득 연구에 대 한이 기술의 유용성을 제한 하는. 3T3-L1 세포주를 포함하는 뮤린 세포주, 전형적으로 체외에서 반포세포 기능을 연구하는 데 사용되었지만, 미세 RNA 발현 패턴 및 뮤린 조직에서의 활동은 종종 인간에서 관찰된 것과 다르다. 이것은 또한 1 차적인 세포 및 세포주를 가진 케이스입니다. 더욱이, 3T3-L1 섬유아세포의 분화에 사용되는 배지는 비생리성 호르몬 칵테일(인슐린, 덱사메타손, IBMX 및 로시글리타존)을 필요로 하며, 분화...

비만은 인슐린 저항성 (IR), 타입-2 당뇨병 (T2D), 및 심장 혈관 질병을 포함하여 수많은 신진 대사 질병을 위한 중요한 위험 요소로 간주됩니다1. 현재 치료는 이 질병의 끊임없이 상승 보급을 중단하는 것을 실패하고, 비만과 당뇨병 환자의 IR의 관리는 중요한 임상 문제점 남아 있습니다. 지방 조직은 에너지 항상성의 제어에 중요한 역할을하며, 비만 중 병리학적 확장은 IR 및 T2D2,3의개발에 기여한다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 많은 연구 결과는 지방 세포 생리학에 있는 단백질 코딩 RNA의 역할 및 비만과의 그들의 협회를 조사했습니다.
최근에는 비코딩 RNA(ncRNA), 특히 마이크로 RNA(miRs)의 발견은 유전자 발현 프로그램의 조절 메커니즘과 관련된 새로운 개념을 위조했다. 연구 결과는 ncRNA가 adipocyte 기능의 중요한 레귤레이터이고, 그들의 dysregulation는 신진 대사 질병4에중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 따라서, 백심세포에서 단백질과 ncRNA의 조작은 백혈구 기능에서 그들의 역할및 T2D와 같은 병리에 그들의 충격을 해독하기 위하여 결정적입니다. 그러나, 생체 내뿐만 아니라 1 차 성 구도에서 단백질과 ncRNAs의 발현을 조작하는 것은 시험관 내 분비 세포의 사용을 선호, 매우 도전 남아있다.
Murine 3T3-L1 섬유아세포는 성숙하고 기능적이며 인슐린 반응성 세포세포로 쉽게 분화되며, 이는 세포세포를 연구하는 데 사용되는 잘 특징적인 세포주(예를 들어, 인슐린 신호, 포도당 섭취, lipolysis 및 adipokines 분비)5,6,7,8,9,10. 이러한 특성은 3T3-L1 아디포사이클을 단백질 코딩 및 NC-RNA의 발현을 조절하여 안도 세포 기능에서의 역할과 비만 관련 질환에서의 잠재적 역할을 해독하는 매력적인 모델입니다. 불행히도, 3T3-L1 섬유아세포는 시판기 시약을 사용하여 쉽게 트랜스펙트를 할 수 있지만, 분화된 3T3-L1 세포세포는 트랜스펙트에 가장 어려운 세포주 중 하나입니다. 이것이 3T3-L1 세포에서 유전자 발현을 조작하는 수많은 연구가 교포세포 기능보다는 지방세포 분화에 초점을 맞춘 이유입니다.
장시간, 선포세포를 경화시키는 유일한 효율적인 기술은전기기공5였으며,이는 지루하고 비용이 많이 들며 세포 손상을 일으킬 수 있다. 이 논문은 일반적인 트랜스펙트 시약을 사용하여 역경 질염 기술을 보고하여, 이는 트랜스펙트에 대한 실습 시간을 줄이고, 세포 생존에 영향을 미치지 않으며, 전기기보다 훨씬 저렴합니다. 이 프로토콜은 siRNA 및 마이크로 RNA 모방 (miR 모방) 및 항 miR와 같은 그밖 올리고뉴클레오티드의 질입에 완벽하게 적합합니다. 역형 형질 프로토콜의 원리는 세포 배양판에 복합체를 형성하기 위해 트랜스페트 시약및 올리고뉴클레오티드를 배양한 다음 성숙한 지방세포를 우물로 시드하는 것이다. 이어서, 송신세포는 올리고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체의 존재에서 부착판 표면에 재부착한다. 이 간단하고 효율적이며 저렴한 방법론은 지방 세포 기능에서 단백질 코딩 RNA 및 miRs의 역할과 비만 관련 질병에 대한 잠재적 역할에 대한 연구를 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>2.5% 트립신(10x)</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td>, <td>D-PBS</td></tr><tr><td>2-프로판올</td>로 5배로 희석, <td>시그마</td><td>I9516</td><td></td></tr>, <tr><td>3-이소부틸-1-메틸크산틴</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>D5879</td><td></td></tr>, <tr><td>Accell, 비표적화, 풀,</td><td>호라이즌 디스커버리</td>, <td>D-001910-10-05</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 타입 I 송아지 피부에서</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8919</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's&nbsp; 변성 독수리 배지 (DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>41965062</td><td>4.5 g / L D- 포도당; L-글루타민; 피루브산</td></tr><tr><td>없음 에탄올</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>FAM 표지 음성 대조군 si-RNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM4620</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>유리 글리세롤 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 표준 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HSP90 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-131119</td><td>희석 : 0.5 & 마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 인간 재조합</td><td>Gibco</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN micro-RNA 모방</td><td>Horizon Discovery</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT Kit</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer 분석 Hs_RNU6-2_11</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td></td></tr><tr><td>miScript Primer 분석 Mm_miR-34a_1</td><td>Qiagen</td><td>MS00001428</td><td></td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>219073</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청</td><td>Gibco</td><td>16010-159</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool</td><td>Horizon Discovery</td><td>L-056623-01-0005</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Perilipin-1 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>3470</td><td>희석 : 1/1000</td></tr><tr><td>페트리 접시 100 mm x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>PKB 항체</td><td>세포 신호 전달</td><td>9272</td><td>희석 : 1/1000</td></tr><tr><td>PKB Phospho Thr308 항체</td><td>세포 신호</td><td>9275</td><td>희석 : 1/1000</td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2408</td><td></td></tr><tr><td>형질주입 시약(INTERFERin)</td><td>Polyplus</td><td>409-10</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin 항체</td><td>Sigma aldrich</td><td>T6199</td><td>희석 : 0.5 μm; g/mL</td></tr><tr><td>Vamp2 항체</td><td>R& D 시스템</td><td>MAB5136</td><td>희석 : 0.1 & 마이크로; g/mL</td></tr></tbody></table>

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 rna 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

An Adipocyte Cell Culture Model to Study the Impact of Protein and Micro-RNA Modulation on Adipocyte Function

adipocyte 기능의 변경은 타입-2 당뇨병및 인슐린 저항을 포함하여 신진 대사 질병의 병발생에 기여합니다. 이것은 비만 관련 질병에 대하여 새로운 치료를 개발하기 위하여 안증 기능 장애에 관련시킨 분자 기계장치를 더 잘 이해하는 필요를 강조합니다. 지방세포에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다. 이 논문은 소염성 RNA(siRNA) 및 마이크로 RNA 모방(miR 모방) 올리고뉴클레오티드를 사용하여 후색 성 전환체에서 단백질과 마이크로 RNA의 발현을 조절하고, 소염포 세포로 소명 섬유아세포를 분화시키는 프로토콜을 설명합니다. 이러한 역형 형질 프로토콜은 성숙한 송신세포가 첨가되는 세포 배양판에서 복합체를 형성하기 위해 트랜스페션 시약및 올리고뉴클레오티드의 배양을 포함한다. 그런 다음 고뉴클레오티드/트랜스페트 시약 복합체가 있는 경우 부착판 표면에 다시 부착할 수 있다. 인슐린 신호, 포도당 섭취, 리포발생 및 lipolypolysis의 연구와 같은 기능성 분석은 단백질 또는 마이크로 RNA 조작이 백혈구 기능에 미치는 영향을 연구하기 위해 트랜스페드 3T3-L1 성숙한 지방세포에서 수행될 수 있다.

3T3-L1 분광구에서 단백질 또는 마이크로 RNA의 발현을 조절하기 위해 여기에 설명된 역형 형질의 절차를 사용하여, 형포세포는 트랜스펙션 후 그들의 형태를 보존하는 것으로나타났다(도 1B,C). 실제로, 2일 후, 대포세포는 잘 퍼지고 접시에 부착되어 성숙한 3T3-L1 의 특징인 다중 지질 방울을 제시했다. 지질 함량은 전과 감염및 비과감염형(도1D,E)과다르지 않았다. 더욱이, 퍼록시소 증식활성 수용체 감마2(Pparγ2),아디포넥틴(Adipoq), 포도당 수송기 4 또는 솔루트 캐리어 패밀리 2 멤버와 같은 분화 마커의 mRNA 발현 4(Slc2a4),인슐린 수용체 기판 1(Irs1),perilipin-1(Plin1)은비 과감염 된 ...

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

Alteration of adipocyte function contributes to the pathogenesis of metabolic diseases including Type 2 diabetes and insulin resistance. This highlights ...

이 프로토콜은 단백질, 또는 microRNA 발현을 분화한 아디포사이클로 조작하여 백혈구 기능에서 그들의 역할을 연구할 수 있게 합니다. 이 역형 형질 법은 마우스 3T3-L1 선포세포로 올리고뉴클레오티드를 트랜스펙트하는 간단하고 경제적이며 매우 효율적인 방법입니다. 이 방법은 또한 adipocytes로 분화된 인간 적인 지방세포에 적용될 수 있습니다.절차를 시연하는 것은 실험실의 기술자 인 멜라니 고드프린 (Melanie Gaudfrin)이 될 것입니다. 3T3-L1 섬유아세포는 Pyruvate없이 DMEM에서 100 밀리미터 요리, 25 밀리머 포도당, 10 %의 신생아 송아지 혈청, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술을 재배하십시오. 요리는 37섭씨 37도, 이산화탄소 7%에 티슈 배양기인에 놓습니다.합류 이틀 후, 배양 배지를 변경, 피루바테없이 DMEM으로 교체, 25 밀리머 포도당, 10%FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 상감 균주 보충 0.25 밀리머 IBMX, 0.25 마이크로 모라 dexamethasone, 0.25 마이크로 그램, 밀리리터 인슐린 당 5 마이크로 그램, 및 10 마이크로 그램. 2 일 동안 요리를 배양하십시오. 이틀 후, 피루바테없이 DMEM으로 배양 배지를 대체, 25 밀리모어 포도당, 10%FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 상미신은 밀리리터 인슐린 당 5 마이크로 그램과 10 마이크로 몰러 rosiglitazone 및 인큐베이트 2 일 동안 보충.피루바테, 25 밀리머 포도당, 10 %FCS, 1 % 페니실린과 연쇄상 구균증없이 DMEM으로 이틀마다 세포를 공급하고 인큐베이터에 세포를 유지합니다. 1일 또는 몇 시간 전에, 밀리리터 당 100 마이크로그램에서 콜라겐 타입 I의 용액을 밀리리터당 1밀리그램의 스톡 용액에서 30%에탄올로 준비합니다. 24웰 플레이트의 웰당 12웰 플레이트 또는 125 마이크로리터당 250마이크로리터의 콜라겐을 넣고 우물 표면에 용액을 퍼놓습니다.콜라겐이 건조 될 때까지 배양 후드 아래에 뚜껑없이 접시를 둡니다. 그런 다음 D-PBS로 두 번 씻으시면 됩니다. 실온에서 5분 동안 혼합하고 배양할 수 있는 최소한의 필수 매체가 개선된 siRNA 파이펫.스페션 시약과 개선된 최소한의 필수 매체를 siRNA 및 파이펫에 추가하여 혼합합니다. 실온에서 20분 동안 인큐베이션을 드시면 됩니다. 그런 다음 콜라겐 코팅 플레이트의 각 웰에 형질 혼합물을 추가합니다.D-PBS로 100mm 페트리 접시에 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 5배 트립신을 세포에 추가하여 트립신으로 전체 표면을 덮습니다. 30초 동안 기다렸다가 트립신을 조심스럽게 제거합니다.인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5~10분 동안 페트리 요리를 배양합니다. 그런 다음 접시를 탭하여 세포를 분리하여 세포 손상을 피하십시오. 피루바테 없이 DMEM의 10 밀리리터를 추가, 25 밀리머 포도 당, 10%FCS, 1% 페니실린과 연쇄상 구균 트립신을 중화.세포를 분리하고 세포 현탁액을 균질화하기 위해 배지를 위아래로 조심스럽게 피펫합니다. 말라세즈 카운팅 챔버 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 세포를 계산하고 세포의 농도를 매체의 밀리리터 당 0.625,000 세포로 조절한다. 종자 800 마이크로리터는 12웰 플레이트 또는 400 마이크로리터의 세포 현탁액당 24웰 플레이트의 질당 경질 혼합물을 함유하고 있다.세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양하고 24 시간 동안 방해하지 마십시오. 다음 날, 조심스럽게 피루바테없이 신선한 DMEM으로 상체를 교체, 25 밀리몰러 포도당, 10 %FCS, 1 % 페니실린과 연쇄 절제술, 인큐베이터에 세포를 반환. siRNA 또는 miR 전달 후 표적 녹다운을 검출하기 위한 일반적인 시간 점은 mRNA를 위해 24 48시간 및 단백질에 대한 48-96시간입니다.기능적 실험은 인슐린 신호, 포도당 섭취, 아디포크인 분비, 리포시스 및 리포발생을 포함한 전감염된 지방세포에서 수행될 수 있다. 대신구는 형질 전환 후 그들의 형태를 보존하기 위하여 표시되었습니다. 2일 후, 형포세포는 지질 함량이 있는 다중 지질 방울을 트랜스페드및 비감염성 세포 사이에 다르지 않다는 것을 제시했습니다.다양한 분화 마커의 mRNA 발현은 비감염된 세포에 비해 전과된 세포에서 변하지 않았다. 역순환 프로토콜은 비도세포의 70% 이상이 전염됨에 따라 효율적입니다. 페리핀-1에 대한 siRNA를 통한 트랜스페션 후 3일 후, 페리리핀-1의 mRNA 수준은 70% 감소했으며, 단백질 수준은 63%로 감소했으며, 또한 형광 현미경검사법에 의해 분석되었으며, 대조군발의 발현에 비해 92% 감소한 것으로 나타났다.miR-34a의 발현을 최대 조절하기 위해 올리고뉴클레오티드를 모방한 마이크로RNA를 통한 선포세포의 역형이 여기에 나와 있다. miR-34a의 과발현은 VAMP2 단백질 발현의 감소를 50%까지 감소시켰으며, 3T3-L1 분광구에서 페리핀-1의 녹다운은 기저리폴리시스의 증가로 이어졌고 miR-34a의 과발현은 인슐린 유발 단백질 키나제 Bphosphyl 의 억제로 이어졌다. 새로 분화된 아디포세포에 대한 트랜스페션을 수행하고 트립신을 사용하여 아디포세포의 처리를 주의 깊게 모니터링하기 위해 높은 수준의 지방세포 분화에 도달하는 것이 중요합니다.트랜스펙트 에 이어, 인슐린 신호, 포도당 섭취량, 리포제네시스 및 리폴리시스에 대한 단백질 또는 마이크로RNA 조작의 영향을 연구하기 위해 대각선에 대한 기능적 실험을 수행할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

지방 조직(AT)은 전신 항상성에 영향을 미칠 수 있으므로 지방 세포 분화 및 기능의 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요합니다. 우리는 유도 지방 세포 자멸사에 대한 모델로서 지방 세포 항상성, 분화 및 저산소증 노출을 분석하여 이러한 과정에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 프로토콜을 제공합니다.

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인간 지방 Microphysiologic 플랫폼: 백색 지방 조직에 끼여

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

우리는 지방 조직 신진 대사 표현형에 기여에 매트릭스 및 지방 세포의 역할의 해부를 허용하는 시험관 내 3D 인간 세포 외 매트릭스 -adipocyte를 설명합니다.

매트릭스 세포 대사 크로스토크 연구를 위한 인간 3D 세포외 세포외 매트릭스-세포세포 배양 모델

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이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

임의의 점 kinematograms과 컴퓨터 - 생성 무척추 동물의 비디오 재생을 고용 op​​erant 조절 패러다임을 사용하는 도마뱀의 시각적 감도를 테스트.

도마뱀의 운동의 속도와 방향에 시각 민감도 테스트

컴퓨터에서 생성된 모델로 재키 용이를 사용하여 자극합니다.

컴퓨터가 만든 동물 모델 자극

배우세요 성숙한 지방세포에서 역전염을 이용한 siRNA 및 microRNA 전달 방법을. 3T3-L1 세포를 사용하여 단백질 발현을 조절하고 인슐린 신호전달 및 포도당 흡수를 연구할 수 있습니다.

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