Name: 마우스의 점도 클리어런스의 생체 내 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 학습하세요 마우스 기도 점도 클리어런스(MCC) 측정 방법을 SPECT/CT 영상 기술을 활용하여 생체 내에서 정량화하는 기법입니다. 이 프로토콜은 호흡기 질환 연구 및 약물 개발에 활용됩니다.

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M.Z. 및 K.S.F.와이 작품은 피츠버그 대학의 임상 및 번역 과학 연구소를 통해 피트 혁신 챌린지 (PInCh)에 따라 수여 된 보조금에 의해 지원되었으며, NHLBI R01 교부금 HL153407, M.Z. 수여.

피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 이러한 동물 실험을 착수하기 전에이 간행물에 지정된 모든 동물 프로토콜을 승인했습니다.
참고: 이 프로토콜은 이중 양식 SPECT/CT 스캐너를 사용하여 방사성 종종 이미징을 활용한 생체 점액 통관 연구에서 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 입증 된 기술은 시스템 교정, 마취 마우스, 쥐의 기관 삽관, 폐에 동위원소 주입, 이중 양식 이미징, 이러한 이미지의 공동 등록 및 분석입니다.
1. SPECT/CT 시스템 설정
<ol><li>살아있는 동물을 사용하여 실험을 실행하기 전에 적절한 워크플로우를 설계하고 설정합니다.<ol>
<li>회전 반경 40cm의 투영 사이에6o의 스텝 크기로 구성된 SPECT 인수를 사용합니다. CT 획득은 프로젝션 사이에 1.6o 각도로 220개의 프로젝션으로 구성됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시스템에 마우스 및 SPECT 이미징에 대한 올바른 MWB 콜리메이터가 있는지 확인합니다. 부적절한 콜리메이터가 설치된 경우 콜리메이터 마법사를 사용하여 올바른 콜리메이터를 설치합니다.</li>
	<li>필요한 시스템 교정을 실행하여 시스템을 사용할 수 있도록 준비합니다. 참고: 스캐너의 SPECT 및 CT 구성 요소는 교정이 필요합니다. 소스 컨디셔닝및 다크/라이트(D/L) 보정을 사용하여 CT 구성요소를 교정하고, 2주마다 COS(Center Offset) 교정을 하고, 매달 X-ray 하드웨어를 평가합니다. SPECT 구성 요소는 일년에 한 번 보정해야 합니다.<ol>
<li>X-ray 하드웨어를 평가하려면 CT 교정 중 X선 하드웨어 평가(추가 CT 교정 메뉴)를선택합니다.</li>
		<li>소스 컨디셔닝을 수행하려면 CT 교정 중 소스 컨디셔닝 상자 수행(추가 CT 교정 메뉴)을선택합니다.</li>
		<li>D/L 교정을 수행하려면 CT 교정 중에 실험 중에 사용되는 CT 획득 프로토콜 옆에 있는 D/L 상자를 선택합니다. 다른 모든프로토콜(추가 CT 교정 메뉴)을선택 취소합니다.</li>
		<li>COS 교정을 수행하려면 침대를 교정 링 도구로 교체하고, 침대 유형 설정을 모션 제어 설정에 맞게 조정하고, CT 교정 중에 실험 중에 사용되는 CT 획득 프로토콜 옆에 있는 COS 상자를 확인합니다. 다른 모든프로토콜(추가 CT 교정 메뉴, 보충보정 링)을 선택 취소합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 마우스 삽관 및 주입
<ol><li>스캔할 마우스의 무게. 여러 마우스를 스캔하는 경우, 귀 펀칭 또는 꼬리의 표시와 같은 방법을 사용하여 식별 목적을 위해 마우스를 표시주의하십시오.</li>
	<li>1.5%의 이소플루란을 사용하여 가스실에서 2L/min O2의 가스 흐름을 사용하여 마우스를 마취하여 ~5분 동안 충분한 깊이의 마취를 생성하고, 호흡이 분당 ~55-65호흡이 16(그림 1A)로느려질 때까지 충분한 깊이의 마취를 생성한다.</li>
	<li>챔버에서 마우스를 제거하고 45o 경사에서 삽관 스탠드에 전면 절개에 의해 일시 중단. 삽관 스탠드에 코 콘을 장착하여 마우스가 삽관 중에 마취되도록하십시오(도 1B).</li>
	<li>50 μm 광섬유 와이어의 한쪽 끝을 광원에 연결하고 와이어를 사용하여 20 게이지 캐뉼라를 연결하여가이드(도 1C)로작용합니다.</li>
	<li>마우스의 입을 열고 무딘 집게를 사용하여 혀를 앞으로 당깁니다. 가이드 와이어를 비추고 성대(도1D)를시각화하는 데 사용합니다.</li>
	<li>와이어가 성대를 넘어 상부 기관지에서 쉬도록 안내선을 성대를 통과하십시오. 1 인치 캐뉼라를 와이어를 따라 앞으로 밀어 마우스를 삽관하고 캐뉼라를 충분히 깊이 전달하여 허브가 동물의 절개(그림 1E)에위배되도록합니다. 캐뉼라를 제자리에 두고 와이어를 제거합니다.</li>
	<li>손가락으로 캐뉼라를 간단히 연결하고 호흡의 변화를 확인하여 삽관을 테스트합니다. 방출 시 호흡을 막거나 호흡을 긴장시키는 것은 적절한 기관 삽관의 징후입니다. 캐뉼라를 연결하면 호흡기 패턴에 변화가 없는 경우 후자는 식도에서 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>99m테크네튬 유황콜로이드(99mTc-Sc)의 0.2mC를 10μL의 부피로 준비하고, 피펫을 캐뉼라안으로 준비한다. 마우스가 1-2분 이상 폐로 자발적으로 흡입하도록 허용합니다(그림1F). 스캐너팔레트로 마우스를 전송하기 전에 캐뉼라를 제거합니다. 참고: 방사성 종종은 추기경 건강에 의해 준비되고 여과되었습니다.</li>
</ol>3. SPECT/CT 이미징
<ol><li>마우스를 코 콘으로 25mm 팔레트로 옮기고 테이프로 고정하여 가슴과 복부를 너무 단단히 테이프로 테이프로 테이프로 고정하여 호흡을 손상시키지 않도록 하십시오. 마우스에 부착된 금속 귀 태그를 제거하십시오.</li>
	<li>200 μL에서 0.05 mCi로 구성된 방사성 팬텀을 준비하고 이 양을 0.2mL PCR 튜브에 배치합니다. 마우스의 하부 복부 아래에 팔레트에 테이핑하여 튜브를 배치하여 폐와 겹치지 않도록하십시오. 참고: 팬텀은 CT 및 SPECT 이미지를 공동 등록하고 클리어런스에 대한 부정적인 제어를 목적으로 사용됩니다.</li>
	<li>SPECT/CT 시스템에 마우스를 삽입하고 이미징 워크플로를 선택하고 설정을 실행합니다.</li>
	<li>마우스에서 검출기의 위치를 설정하고 이미징 워크플로우를 실행합니다.</li>
	<li>방사능 후 시술을 받은 마우스를 위한 케이지를 준비하고, 음식과 물에 무제한으로 접근할 수 있으며, 방사선 안전 스티커를 사용하여 선명한 라벨을 부착합니다.</li>
	<li>워크플로가 완료되면 이미징 팔레트에서 마우스를 제거하고 음식과 물에 대한 광고 리비툼 액세스와 함께 스캔(스캔 1-시작 2)사이의 6시간 동안 준비된 케이지에서 복구할 수 있도록 합니다. 6 h는 섬모 기능에 따라 선형 클리어런스가 거의 폐포 클리어런스로 이루어지는 기간에 해당하는 기간에 따라 선택되었다.</li>
	<li>6시간 후, 마우스를 다시 마취하고 팬텀과 함께 스캔하여 동일한 워크플로우를 사용하여 기도에서 지워진 동위원소의 양을 측정합니다. 참고: 6시간 동안 이소플루란을 가진 중단없는 마취로 마우스가 회복되도록 하는 것이 중요하며, 이는 심혼우울제 효과가 있어 점도 가관이 거의 0에 가깝습니다.</li>
</ol>4. 분석
<ol><li>이미징 후 후 처리를 수행하여 완전한 3D 스택 이미지를 재구성합니다.<ol>
<li>99mTc에 대한 공장 표준 설정을 사용하여 SPECT 이미지를 히스토그램한 다음 MAP3D 알고리즘 및 포인트 스프레드 함수(PSF) 재구성을 사용하여 재구성합니다. 참고: 재구성은 8회 반복과 6개의 하위 집합을 사용하여 수행되었습니다. 효과적인 재건은 1:10에서 투영에 대한 하위 집합의 비율이 필요하거나 투영 수로 균등하게 분할되므로 60개의 프로젝션을 사용하여 인수로 인해 6개의 하위 집합이 사용되었습니다.</li>
		<li>Feldkamp 알고리즘과 셰프 로건 필터를 사용하여 CT 이미지를 재구성합니다. 참고: 4회 반복을 사용하여 재구성이 수행되었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피지 이미지J21에서 CT 및 SPECT 이미지를 다시 슬라이스 도구를 사용하여 기본 축 이미지에서 관상 뷰 이미지를 생성합니다. 그런 다음 SPECT 이미지에서 z 스택 합계 투영을 수행하여 각 조각의 개수 데이터를 추가하고 단일 이미지를 생성하여 분석의 용이성을 제공합니다.</li>
	<li>반사애 에펜도르프 튜브를 사용하여 CT 및 SPECT 이미지를 크기 조정 및 공동등록(그림 2A, B). 모든 샘플에서 일관된 크기 조정 측정을 추적하고 사용합니다.</li>
	<li>자동 임계값을 사용하여 CT 이미지를 바이아리화한 다음 스택을 반전시키고 z-stack 합계 투영을 수행하여 분석을 위한 폐의 윤곽을 생성합니다(그림2C).</li>
	<li>CT 및 SPECT 이미지를 회전하고 채널 도구를 사용하여 이미지를 병합합니다. 오른쪽 폐 주위에 ROI를 그리고 측정하여 MCC를 계산합니다(그림2D). 참고: 이 측정은 0 및 6시간 시간 지점에 대한 오른쪽 폐의 총 카운트이며, 6시간 이미지는 포뮬러를 사용하여 방사성 부패를 보정합니다: N(t)= N0e-t. 99m Tc-Sc는 ~6 시간의 반감기와 초당 3.21e-5의 부패 상수를 가지고 있습니다. 그런 다음 이러한 값을 사용하여 백분율 클리어런스를 계산할 수 있습니다. 참고: 오른쪽 폐는 ROI 도면 및 측정 수에 선택되며 점막 간격으로 방사성 동위 원소톱을 폐에서 인두로 이송하여 삼켜서 위장에 끝납니다. 아주 빈번하게, 수는 좌측 폐와 겹치고 그러므로 잘못된 수를 생성하는 위장에서 볼 수 있습니다. 이 혼란은 오른쪽 폐에서만 수를 측정하여 피할 수 있습니다.</li>
</ol>

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질병과 발달 모두에서 motile 호흡 섬모의 역할은 계속 진화하고 더 잘 평가됩니다. 동기, 기관지나무안감에 안감세포의 정면에서 다중 모틸옥 의 메타크로날 박동은 점도 클리어런스 또는 MCC를 생성하는 세팔라드 흐름을 생성한다. MCC는 PCD22,COPD18과 같은 취득한 질병과 같은 교만증에서 손상되며, 그 중요성은 전통적으로 교향액으로 간주되지 않는 CHDs에서 인식되고 있습니다. 최근 데이터는이종택시(23)와 이성구(7)없이 CHD 모두에서 호흡섬모 장애를 보였다. 이러한 motile cilia 기능 장애는 더 큰 호흡 현상으로 번역하는 것을 보여주었다9 뿐만 아니라 더 큰 수술 후 이환율8. 대부분의 경우, 이러한 질병의, 사용할 수 있는 마우스 모델 및 마우스에서 MCC를 측정 하기 위한 우리의 프로토콜은 잠재적인 치료 를 테스트 하는 데 사용할 수 있는 귀중 한 도구.
동물 모델은 질병을 이해하고 치료 개발을위한 유틸리티를 제공합니다. 생체 내 동물 이미징은 동물을 희생할 필요 없이 동일한 동물로부터 여러 데이터 포인트를 획득할 수 있는 기능을 추가로 유용하게 제공하므로 조사관이 치료 효과의 종방향 과정을 따를 수 있습니다. MCC의 마우스 모델은 여러 조사자에 의해 수십 년 동안 개발되었으며, 처음에는 2 차원 핵 이미징 기술 인 planar scintigraphy를 사용하여 비글 개에서 수행되고있습니다(24). 이 기술은 10 년 후에 마우스에서 사용하기 위하여 적응되었습니다, 그25,26후에 SPECT 화상 진찰에 적응에 선행되었습니다. 마우스 모델에서 이 기술의 개발은 섬모 기능이 현저히 변경되는 PCD와 같은 인간 질환의 여러 마우스 모델의 가용성으로 인해 이 기술의 관련성에 큰 발전이었다. MCC는 폐 기질 및 면역 억제의 마우스 모델에서 평가되었으며, 다른모델(19,26)과함께 사용될 가능성이 있다. CF, 천식, PCD 및 CHD와 관련된 공수 질환이 있는 인간 환자에서 MCC 측정 연구가 수행되었으며, 이 기술이 폐 생리학 및 치료 효능13의두 연구를 모두 도울 수 있는 결과를 산출하였다.
이 프로토콜의 중요한 부분은 올바른 이미징 매개 변수로 인수를 설정하여 정량화를 위한 정확한 이미지를 획득하는 것입니다. 어떤 콜리메이터가 사용되는지, 회전당 획득할 투영 횟수, 회전 단계 크기를 포함하여 SPECT 획득 설정을 디자인할 때 여러 가지 요인이 중요합니다. 콜리메이터 선택은 인수의 민감도 및 해결의 주요 요소이며, 획득 설정은 사용되는콜리메이터(27)에맞게 조정되어야 할 수 있다. 또는 쥐와 같은 더 큰 동물을 사용할 때 콜리메이터를 조정해야합니다. 예를 들어 여러 핀홀 콜리메이터는 더 민감하지만, 겹치는 프로젝션을 피하기 위해 단계 크기를 선택하고 원치 않는 멀티플렉싱을 유발할 때주의를 기울여야 하며, 이는 재건아티팩트(25)를유발할 수 있는 일부 이미지 모호성을 희생하여 획득의 감도를 더욱 높일 수 있다. 재구성 설정은 정량화 가능한 이미지를 생성하는 열쇠이기도 합니다. MAP3D는 일반적으로 사용되는 반복 재구성 알고리즘이며 PSF는 일반적인 재구성 모델입니다. 둘 다 이미지를 재구성할 수 있지만 반복 및 하위 집합 수를 설정할 때주의해야 합니다. 반복 횟수가 많을수록 재건에 필요한 계산 시간이 증가하고, 추가 증가에 따른 수익 감소로 재건의 질이 높아집니다.
ImageJ에서 이미지를 정량화하기 위해 사용하기에 이상적인 측정 도구는 선택 에서 픽셀의 합계 값을 출력하는 RawIntDen입니다. 다른 크기의 폐 ROI에 걸쳐 SPECT 데이터를 정량화 할 때, RawIntDen의 사용은 카운트의 절대 측정을 제공하고 평균 측정이21과 같이 ROI의 영역에 측정을 조정하지 않습니다.
이 기술은 이 기술을 적용할 때 구도자가 인식해야 하는 여러 관련 오류 소스를 가지고 있습니다. 주목할만한 창립자는 마취제의 사용입니다. 이소플루란은 빠른 작용, 흡입 된 마취제로 마우스가 인수 완료 후 빠르게 회복됩니다. 그러나, 그들의 케이지에서 복구하는 충분한 시간을 마우스를 제공하기 위하여 주의해야 하고, 필요 이상으로 더 이상 마취를 유지하지 않아야 합니다. 0과 6시간 사이의 흡입 된 이소플루란을 사용하여 지속적으로 마취된 채 보관된 개인 경험(미공개 데이터) 마우스에서 무시할 수 없는 클리어런스를 보였습니다. 마찬가지로, 마취의 통제 된 복용량은 또한 급속한 회복을 보장 하기 위해 필요. 영상을 위해 팔레트에 동물을 고정할 때, 공동 등록에 사용되는 팬텀 튜브는 폐와 겹치는 유물을 피하기 위해 위장에 낮게 유지되어야 합니다. 마찬가지로, 품질의 CT 이미지를 보장하기 위해, 엑스레이 산란에서 아티팩트를 방지하기 위해 마우스에서 금속 태그를 제거하는 주의.
현재 MCC 프로토콜은 무수한 동물 모델에 적용할 수 있습니다. 이 기술은 스캔된 동물의 건강에 무시할 수 있는 영향을 미치며, 마우스에 의해 잘 용납되며, 이 때문에 이미 섬세한 마우스의 건강을 위험에 빠뜨리지 않고 질병 모델과 함께 사용될 수 있다. 이 방법론의 강도는 비디오 현미경 검사법을 위해 기관을 소비하기 위해 동물의 희생없이 기도 기능의 일관되고 반복 가능한 측정을 획득 할 수있는 생체 내 기술인 생체 내 기술에서 비롯되며, 전 생체 모델에게는26이필요합니다. 동일한 동물의 여러 스캔에 걸쳐 반복 측정을 생산하는 이 기술의 일관성은 동일한 동물을 다른 제제 또는 잠재적 치료제로 치료할 수 있게 해주며, 동일한 동물 간의 통계적 비교를 통해 모든 동물 모델에 내재된 생물학적 가변성을 감소시켜 통계적으로 유의한 차이를 보이는 데 필요한 샘플 크기를 줄입니다.
MCC 기술을 이용한 기도 기능의 평가는 다양한 동물 모델에 맞게 조정되고 다양한 기도 건강 모델에 적용될 뿐만 아니라 새로운 치료법을 테스트할 수 있습니다. PCD의 마우스 모델의 기도는 COPD의 모델뿐만 아니라이 기술을 사용하여 평가 할 수 있습니다. 우리의 방법은 또한 일반적인 임상 사용에 있는 MCC에 각종 마취제의 차동 효력을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 마지막으로, 기도에 대한 치료제의 효과도 이 모델을 사용하여 평가될 수 있다. 이전에 언급되었지만 반복을 부담하는 것처럼, 그것은 질병의 과정을 통해 반복 MCC 평가를 허용 생체 내 측정이기 때문에, 뿐만 아니라 시간이 지남에 따라 치료 개입의 테스트 혜택을 할 수 있습니다. 추가적으로, 마우스는 인간 질병을 모방/ 연구하는 데 사용되는 가장 흔한 실험실 동물이며, 어떤 경우에는 인간 질환의 여러 형질전환 마우스 모델중에서 선택할 수 있습니다.

Cilia는 조류에서 인간에 이르는 진화 역사를 통해 보존되는 마이크로투블러 기반 세포 세포기관입니다. 그(것)들은 세포 표면에서 방출하고 기능1의다수를 가지고 있습니다, 지역 환경 감각 신호의 인식에서 운동성, 초기 단세포 진핵생물에인간에서 다시 추적할 수 있는 기능에 구역 수색할 수 있는 기능2,3. Cilia는 환경 신호를 처리하기 위해 세포의 특수 안테나로서 비 motile 및 단일 역할을 할 수 있습니다. 또는 다중, 동기화된, 메타크로날파에서 구타하여 나팔관의 안대기와 알베올리1,2로이어지는 말단 기관지들을 제외한 상부 및 하부 기도의 안대기와 같은 유체 흐름을 생성한다.
호흡기의 광범위한 상피 표면은 잠재적으로 위험한 흡입 된 오염 물질과 병원균의 다양한 형태로 지속적인 오염 에 노출되어 방어를 필요로합니다. 하나의 주요 방어 메커니즘은 기관지수나무의 점막 장치로, 분비된 점액의 연속흐름이 기관지-기관지 상피 세포의 정표면을 일렬로 세우는 다중 motile cilia의 구타에 의해 기도 밖으로 기계적으로 수송된다. 이러한 기능은 흡입 된 오염 물질을 포획하고, 연속적 동시 적 박동을 통해 세팔라드4,5를수송합니다.
Cilia는 배아 노드에서 모틸아 섬교가 대칭6을깨는 배아 개발에서 좌우 패터닝의 개발과 같은 중요한 역할을 갖는 것으로 입증되었습니다. 섬모 관련 유전자의 돌연변이는 심장6의비대칭 구조로 인해 선천성 심장 질환 (CHD)과 같은 질병에 연결되었습니다. 최근 연구에 따르면 CHD 환자의 호흡기 내 의 고부적 기능 장애 발생률뿐만 아니라 수술 후 호흡기 합병증및 만성 호흡기 증상의 보급률이 증가하고 상부 및하부기도7,8,9,10이보고되었다. CHD 및 ciliary 기능 장애를 가진 환자, 또는 이종세 없이, 수술 후 호흡 합병증 및 부정적인 호흡 결과의 위험이 증가 하는 것으로 입증 되었습니다5,8,10. 시그널링 및 개발에서그들의 역할을 넘어, 기도 섬모의 중요성은 주요 예가 주요 섬모 성 안증 (PCD)인 ciliopathies에 의해 입증되었습니다. PCD는 연동호흡기 섬모에 영향을 미치는 다수의 돌연변이로 인한 선천성 질환으로 재발성 폐 감염, 기관지염 및 잠재적으로 폐 이식의필요성(11)이다. 추가적으로, 섬모가 낭포성 섬유증에서 정상임에도 불구하고 (CF), 백인 인구에서 가장 흔한 선천성 장애, MCC는 CFTR 유전자(12)의돌연변이로 인한 두꺼운 점성 점액으로 인해 손상된다. PCD 및 CF의 여러 마우스 모델뿐만 아니라 CHD의 모델의 계속 증가가 있다. 궁극적으로 섬모는 많은 주요 역할을 가진 다재다능한 구조이며, 생체 내에서 몰틸호흡기 의 기능을 평가하는 방법은 전임상 연구에 유용할 수 있으며, 돌연변이의 효과뿐만 아니라 점도 클리어런시(MCC)13에대한 약물의 효과를 평가한다. 이 방법은 또한 이 마우스 모형에 있는 MCC에 새로운 약, 유전자 치료 또는 내정간섭의 효력을 평가에 귀중한 것입니다.
MCC를 평가하는 데 사용 된 많은 다른 모델이 있습니다. 한 가지 주목할 만한 방법은 기관지에 주입된 메틸렌 블루 염료의 사용을 포함하며, 염료운동(14)의광섬유 측정에 의해 측정된 클리어런스와 함께 한다. 이 방법은 전임상 마우스 모델보다 인간에서 더 일상적인 염료의 움직임을 관찰하는 능력에 의해 제한됩니다. 또 다른 주목할만한 방법은 기도에서 개별 입자를 추적하는 데 사용할 수있는 싱크로트론 위상 대조 X 선 이미징 (PCXI)입니다. 이 방법은 비교적 새롭고 널리 액세스할 수 없는15. 비디오 현미경 검사법에 대한 기관체를 절제하여 기도를 평가하는 수많은 전 생체 내 방법이 있지만, 이러한 모델은 인간환자(16)에거의 유용성을 제공하지 않습니다. 광학 일관성 단층 촬영과 같은 섬모 이미징을 위한 고해상도 기술은 동일한 방식으로제한됩니다(17).
본 기사에서는 무수한 동물 모델에서 폐 클리어런스를 측정하는 데 사용되어 온 생체 내 MCC를 측정하는 재현 가능한 방법을 제시하고, 만성 폐쇄성 폐 질환에서 MCC를 연구하고 면역 억제 약물18,19의효과를 평가한다. 이 방법은 폐에 주입 한 후 용해성 미립자 방사성 추적기 인 방사성 제약 99m테크네튬 유황 콜로이드(99mTc-Sc)의 통관을 추적합니다. 그런 다음 방사성 핵종은 단일 광자 방출 계산 단층 촬영(SPECT)18,20을사용하여 추적할 수 있다. 우리는 폐에 방사성 동위원소 카운트의 공동 국소화와 듀얼 양식 SPECT 및 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 영상을 사용하고 6 시간 이상이 수의 감소를 측정하여 MCC를 측정하기위한이 기술을 더욱 정제했습니다. CT 및 SPECT 이미지의 공동 등록을 통해 이중 양식 이미징을 통해 당사의 관심 지역인 폐에 방사선 수를 정확하게 국소화할 수 있습니다. 우리는 마우스에서 MCC 측정을위한 방법을 자세히 설명하지만, 프로토콜은 쥐에서 MCC를 공부하도록 조정할 수 있습니다. 콜리메이터는 방사선 량뿐만 아니라 조정될 필요가 있습니다. 우리의 관점에서, 마우스 MCC 검사는 작은 동물 크기 때문에 기술적으로 더 도전적이지만, 때문에 인간의 장애의 수의 설립 된 마우스 모델의 많은 수로 쥐보다 더 유용. 또한, 동물 식민지에서 그들의 낮은 비용과 유지 보수의 비용으로 인해, 더 큰 샘플 크기는 마우스에서 더 실현 가능하다.

<table><tbody><tr><td>500 &마이크로; m Unjacketed 광섬유 와이어</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td></td></tr><tr><td>99mTechnecium-Sulfur Colloid</td><td>Cardinal Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마취 기화기</td><td>Vetland Medical</td><td>A13480</td><td></td></tr><tr><td>Durmont # 5 집게</td><td>미세 과학 도구</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>FIJI ImageJ 2.0.0-rc-65 / 1.52p 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Introcan 안전 카테터 20G 1inch</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1534477</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>118-2097</td><td></td></tr><tr><td>마우스 삽관 스탠드</td><td>Kent Scientific</td><td>ETI-MSE-01</td><td></td></tr><tr><td>Siemens Inveon 이중 양식 SPECT/CT</td><td>Siemens</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단일 채널 마취 스탠드</td><td>Summit 마취 솔루션</td><td>22860</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스의 점도 클리어런스의 생체 내 평가

In vivo Evaluation of Mucociliary Clearance in Mice

세포의 특수 세포인 호흡기 는 호흡기를 일렬로 세우는 상피 세포의 정표면을 일렬로 세입니다. 메타 크로네아, 동시적 방식으로 구타함으로써, 이러한 다중, motile, 액틴 기반 세포기관은 흡입된 오염물질및 병원균의 호흡기를 지우는 세팔라드 유체 흐름을 생성합니다. 환경 오염이 증가함에 따라 새로운 바이러스 병원균 및 신흥 다중 약물 내성 박테리아로 인해 cilia 생성 점액 통관(MCC)은 폐 건강을 유지하는 데 필수적입니다. MCC는 또한 1 차적인 ciliary dyskinesia 같이 다중 선천성 무질서에서 우울합니다, 낭포성 섬유증 은 만성 폐쇄성 폐 질병 같이 취득한 무질서. 이러한 모든 장애는 어떤 경우에는 여러 마우스 모델을 확립했습니다. 본 간행물에서는, 당사는 생체내 마우스에 있는 MCC를 정확하고 재현적으로 측정하기 위하여 방사능 및 이중 양식 SPECT/CT 화상 진찰의 소량을 사용하여 방법을 상세히 설명합니다. 이 방법은 이미징 후 마우스를 복구하고, 직렬 측정을 가능하게 하고, 시간이 지남에 따라 잠재적인 치료법을 세로로 테스트할 수 있게 해줍니다. 야생형 마우스의 데이터는 세부 사항에 대한 적절한 주의가 지급되는 한 MCC 측정의 재현성을 입증하고 프로토콜을 엄격하게 준수한다.

이 프로토콜을 사용하여, 우리는 이소플루란 챔버(도 1A)에서마우스를 마취시켰다. 적절한 수준의 마취를 달성한 후, 마우스는 수직 지지체(도1B)에배치되었고 성대는 조명 가이드와이어(도 1C-1D)를사용하여 시각화하였다. 마우스는 0.2mCi 99mTc-Sc로 삽화되어 캐뉼라와 마우스를 통해 10 μL의 부피로 폐로 자발적으로 흡입할 수있었다(도 1E-1F). 이미지 수집 및 처리 후, CT 및 SPECT 이미지는 가상튜브를랜드마크(도 2B)로사용하여 지역화되었다. 폐의 마스크는 CT영상(도 2C)에서생성되었으며 0(도2D)및 6시간(도2E-2F)에서분석을 위해 오른쪽 폐 주위로 ROI를 그리는 데 사용하였다. 프로토콜의 재현성을 테스트하기 위해, 총 8마리의 마우스가 동일한 실험 조건으로 다른 날에 두 번 스캔되었으며, 쌍별 t-테스트를 사용하여 반복 스캔(p-value=0.9904)(그림 3A)의큰 차이를 나타내지 않았다. 추가 2 마우스는 동일한 실험 조건으로 다른 날에 세 번 스캔되었고, 단방향 ANOVA를 사용하여 분석하여 반복 스캔(0.0041의 p-값)(도 3B)과상당한 일치를 나타냈다. 총 8마리의 마우스를 스캔하고 2개의 대표적인 이미지가 표시되었다(그림4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig01.jpg"> 그림 1: 마우스 삽관 및 동위원소 주입. 동위원소를 관하하고 기도에 주입하는 데 필요한 단계의 이미지입니다. A)마우스는 챔버에서 마취된다. B)마취 된 마우스는 전면 절개에 의해 중단 된 수직 지지에 배치됩니다. C)가이드 와이어역할을 하는 조명0.5mm 광섬유 와이어는 20G 캐뉼라를 통해 이를 실행하여 제조한다. D)마우스의 입이 포셉을 사용하여 열고 발광 가이드와이어를 사용하여 발광하여 성대를 시각화합니다. E)캐뉼라가 성대를 가로질러 밀려나고 가이드와이어가 제거됩니다. F)수용성 동위원소는 파이펫을 사용하여 캐뉼라에 주입되고 마우스는 자발적으로 동위원소를 폐로 흡입할 수 있게 한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig02v2.jpg"> 그림 2: MCC 스캔의 SPECT/CT 이미지입니다. A)CT 이미지와 공동 으로 현지화된 SPECT 이미지입니다. B)공동 국소화에 사용된 눈에 보이는 팬텀 튜브가 있는 CT 이미지입니다. C)CT 이미지를 비나화하고 z-스택 합계 투영을 수행하여 파생된 기도의 마스크. D)SPECT 이미지와 공동 으로 조정된 CT 마스크입니다. 분석을 위한 ROI는 오른쪽 폐 의 주위에 그려졌습니다. E)6 시간 에서 기도의 마스크. F)분석을 위한 ROI를 통해 6시간 만에 기도의 CT 및 SPECT 의 공동 국소화된 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig03.jpg"> 그림 3: 여러 검사에서 동일한 마우스의 클리어런스 측정. A)실험 조건에 변화가 없는 8마리의 마우스를 위해 2개의 개별 반복 클리어런스를 측정하였다. 쌍t 테스트는 0.9904의 p 값으로 반복 스캔 사이에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. B)실험 조건에 변화가 없는 2마리의 마우스에 대해 3개의 개별 반복 클리어런스를 측정하였다. 단방향 ANOVA는 0.0041의 p 값과 반복 스캔 사이에 상당한 일치가 있음을 보여주었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61929/61929fig04.jpg"> 그림 4: ROI가 0 및 6시간 동안 올바른 폐를 요약한 2개의 마우스에서 0 및 6시간 기도의 공동 국소화된 SPECT/CT 영상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1 : 시각화 호흡의 효과와 광섬유 와이어에 의해 조명 보컬 코드의 비디오. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/61929supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
추가 파일. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61929/Supplemental_Files.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 간행물에서는, 우리는 이중 양식 방사성 핵종 화상 진찰을 이용하는 생체내 마우스에 있는 기도 점원 클리어런스 (MCC)를 평가하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜은 이중 SPECT/CT 시스템에서 마우스 전신(MWB) 콜리메이터를 사용하여 단일 광자 방출 컴퓨팅 단층 촬영(SPECT) 및 컴퓨터 단층 촬영(CT) 획득 프로토콜을 위해 설계되었습니다.

Respiratory motile cilia, specialized organelles of the cell, line the apical surface of epithelial cells lining the respiratory tract. By beating in a ...

당사의 프로토콜은 이중 양식 SPECT 및 CT 이미징을 통해 추적되는 방사성 핵종을 사용하여 동물 모델에서 점액 섬모 청소를 정확하게 측정하여 기도 청소율을 정확하게 파악하고 측정할 수 있도록 합니다. 이 기술은 이중 SPECT/CT를 활용하기 때문에 다양한 동물 및 질병 모델에 적용할 수 있는 MCC를 측정하기 위한 재현 가능한 방법입니다. 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인한 후 스탠드에 노즈콘을 장착하여 마취를 유지하고 마취된 마우스를 45도 각도로 삽관 스탠드에 앞니 옆으로 매달아 놓습니다.50미크론 광섬유 와이어의 한쪽 끝을 광원에 연결하고 와이어 위에 20게이지 캐뉼라를 끼웁니다. 뭉툭한 집게를 사용하여 혀를 빼내고 가이드 와이어를 비추어 성대를 시각화합니다. 가이드 와이어를 성대를 통해 통과시켜 와이어가 상부 기관에 있는 성대 바로 너머에 있도록 하고 허브가 동물의 앞니에 닿을 만큼 충분히 깊어질 때까지 와이어를 따라 1인치 캐뉼라를 앞으로 밉니다.캐뉼러를 제자리에 두고 와이어를 제거하고 손가락을 사용하여 캐뉼라를 잠시 꽂아 호흡의 변화를 확인합니다. 그런 다음 새로 준비한 0.2 밀리큐리 99m 테크네튬 황 콜로이드 10 마이크로 리터를 캐뉼라에 넣고 마우스가 1-2 분 동안 방사성 핵종을 폐로 자발적으로 흡입하도록합니다. SPECT/CT 이미징의 경우, 캐뉼라를 제거한 후 테이프를 사용하여 노즈콘이 있는 25mm 팔레트에 마우스를 고정하고 폐 아래 마우스의 하복부 아래에 0.05밀리큐리 방사성 팬텀이 포함된 200마이크로리터 PCR 튜브를 테이프로 붙입니다.마우스를 SPECT/CT 시스템에 놓습니다. 이미징 워크플로우를 선택하고 설정을 클릭합니다. 마우스에서 감지기의 위치를 설정하고 이미징 워크플로우를 실행합니다.워크플로우가 완료되면 스캔하는 동안 6시간 동안 모니터링 및 음식과 물, 방사선 안전 스티커에 대한 제한 없는 접근이 가능한 새 케이지로 마우스를 옮깁니다. 이미징 후 99m 테크네튬 황 콜로이드에 대한 공장 표준 설정을 사용하여 SPECT 이미지를 히스토그램하고 MAP3D 알고리즘 및 점 확산 함수 재구성을 사용하여 3D 스택 이미지를 재구성합니다. Feldkamp 알고리즘과 Shepp-Logan 필터를 사용하여 CT 이미지를 재구성하고 FIJI에서 CT 및 SPECT 이미지를 엽니다.재슬라이스 도구를 사용하여 기본 축 이미지에서 코로나 보기 이미지를 생성하고 SPECT 이미지에서 z-스택 합계 투영을 수행하여 각 슬라이스에서 개수 데이터를 추가합니다. 쉽게 분석할 수 있도록 단일 이미지를 생성합니다. 또한 Phantom Eppendorf 튜브를 참조로 사용하여 CT 및 SPECT 이미지의 크기를 조정하고 공동 정합할 수 있습니다.자동 임계값을 사용하여 CT 이미지를 이진화하고, 스택을 반전시키고, z-스택 합계 투영을 수행하여 분석을 위한 폐의 윤곽을 생성합니다. CT 및 SPECT 이미지를 회전하고 채널 도구를 사용하여 하나의 이미지로 병합합니다. 그런 다음 오른쪽 폐 주위에 관심 영역을 그려 점액 섬모 청소를 확인합니다.이미지 획득 및 처리 후 CT 및 SPECT 이미지는 팬텀 튜브를 랜드마크로 사용하여 공동 국소화할 수 있습니다. 폐의 마스크는 CT 이미지에서 생성될 수 있으며 다른 시점에서 분석을 위해 폐 주변의 관심 영역을 그리는 데 사용할 수 있습니다. 이 분석에서는 프로토콜의 재현성을 테스트하기 위해 동일한 실험 조건에서 서로 다른 날에 총 8마리의 마우스를 두 번 스캔했습니다.쌍체 T-검정 분석에서는 반복 스캔 간에 유의한 차이가 없었습니다. 추가로 두 마리의 쥐를 동일한 실험 조건에서 다른 날에 세 번 스캔했습니다. 일원 분산 분석(One-way ANOVA) 분석은 반복 스캔 간에 유의한 일치를 보여주었습니다.여기서, 스캔된 마우스 중 2개의 대표 이미지를 관찰할 수 있습니다. 기도를 시각화할 수 있어야 합니다. 그리고 삽관이 성공적인지 확인하기 위해 필요한 경우 캐뉼라를 제거하고 다시 삽관하여 잘못된 식도 삽관을 방지합니다.이 프로토콜은 질병 모델에 적용하여 기도 청소에 대한 다양한 약물의 효과를 평가하고 새로운 약물 요법의 개발을 지원할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

쥐 호흡 생리학과기도 염증 세포의 샘플링의 반복 측정이 바람직하지만, 일반적으로 가능하지 않습니다. 여기 구두기도 염증 세포의기도 기능 항 진성과 샘플링의 반복 측정을 허용 쥐를 intubating에 대한 반복 방법을 설명합니다.

에어웨이 저항 측정 및 마우스에 Bronchoalveolar 세척 유체 샘플링에 대한 가역, 비침습 방법

숙주 면역 반응 평가를 위한 마우스의 비강 내 마우스 헤르페스바이러스 감염

SCIREQ Inc의 몬트리올, 품질 관리, 현재의 프로토콜은 호흡 역학의 측정​​뿐만 아니라 강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 흡입 메타 콜린에 대한기도 응답의 평가 (flexiVent을 실행하는 데 필요한 절차에 대한 자세한 단계별 설명을 제공합니다 , 캐나다).

강제 진동 기술을 사용하여 마우스의 호흡기 시스템 역학의 평가

내피 내피 / glycocalyx 표면 층은 이상적인 intravital 현미경을 사용하여 공부하고 있습니다. Intravital 현미경은 기술적 같은 폐 등 움직이는 장기에 도전하고 있습니다. 우리는 동시 brightfield 및 형광 현미경은 자유롭게 - 이동에 내피 표면 층의 두께를 추정하는 데 사용할 수 있습니다 방법을...

마우스 폐 내피 표면 층의 생체 측정

기도 섬모 운동과 섬모 생성 흐름을 마우스 기관을 사용하여 시각화 및 정량화를위한​​ 쉽고 안정적​​인 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 요소의 넓은 범위 약리 대리인, 유전 적 요인, 환경 노출 및 / 또는 점액 부하와 같은 기계적 요인 등 섬모 운동성에 영향을 미치는 방법을 결정 수정할 수 있습니다.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

병원균 감염에 대한 숙주 면역 반응은 긴밀하게 규제 과정이다. 생쥐의 리포 다당류 폐 노광 모델을 이용해서, 그 질병 병인과 관련된 복잡한 메커니즘은 고해상도 평가를 수행하는 것이 가능하다.

마우스의 호스트 면역 반응을 평가하기 위해 구인두 기관 내 PAMP 관리 및 폐포의 활용

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

현재 문서의 목적은 더블 챔버 plethysmography 여 의식 쥐에 호흡 기능을 평가 하는 권장된 절차에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것 이다.

더블 챔버 Plethysmography 여 의식 생쥐에 호흡기 기능의 평가

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

여기에서는 비침습적 및 실시간 전신 혈량측정(WBP) 시스템을 사용한 기침 측정과 생쥐의 조직 샘플을 채취하는 규범적 절차를 설명하고 기도 염증을 평가하는 몇 가지 방법을 소개합니다.

마우스에서 기침 및 기도 염증을 감지하는 방법

학습하세요 마우스 기도 점도 클리어런스(MCC) 측정 방법을 SPECT/CT 영상 기술을 활용하여 생체 내에서 정량화하는 기법입니다. 이 프로토콜은 호흡기 질환 연구 및 약물 개발에 활용됩니다.

마우스의 점도 클리어런스의 생체 내 평가

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