개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

곤충 우사회성의 많은 특성은 식민지 내 의사 소통과 노동 분업에 의존합니다. 미세 주입 및 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 통한 개미 배아의 주요 조절 유전자의 유전자 조작은 진사회적 곤충의 이타적 행동의 본질에 대한 통찰력을 제공합니다.

이 프로토콜을 통해 우리는 사회 환경에서 의사 소통 및 행동에서 유전자의 기능을 이해하기 위해 유전자 변형 개미를 생성 할 수 있습니다. 많은 종들이 실험실 환경에서 짝짓기하고 번식하지 않기 때문에 진사회적 곤충의 유전 시스템을 조작하는 것은 어려운 일입니다. 개미 비강 세포 바닥의 현저한 표현형 가소성은 우리가 CRISPR 매개 돌연변이 라인을 확립 할 수있게합니다.

이 절차를 시연하는 것은 실험실의 대학원생 인 Kayli Sieber가 될 것입니다. H.saltator의 야생형 식민지를 섭씨 22도에서 25도 사이의 개미 사육실의 투명한 플라스틱 상자에 보관하고 12 시간 조명, 12 시간 어두운 조명 일정을 유지합니다. 작은 상자를 사용하여 개별 작업자 또는 작은 식민지를 양육하고 중간 또는 큰 상자를 사용하여 더 큰 식민지를 양육하십시오.

둥지 상자를 만들려면 석고를 사용하여 바닥을 만드십시오. 젖은 석고가 중간 및 큰 상자에서 건조되면 거품 블록을 상자 뒤쪽에서 몇 센티미터 깊이와 몇 센티미터 깊이의 석고에 눌러 낮은 둥지 영역을 지정합니다. 석고가 마르면 지정된 둥지 부분을 정사각형 유리 조각으로 덮으십시오.

일주일에 두 번 살아있는 귀뚜라미로 식민지를 먹이고 세척 병을 사용하여 플라스틱 둥지 상자 바닥에 정기적으로 물을 바르십시오. 수유가 발생할 때마다 쓰레기와 죽은 사람을 제거하십시오. 모든 쓰레기와 죽은 개미를 섭씨 영하 30도에서 밤새 얼린 후 이러한 물질을 일반 쓰레기로 폐기하십시오.

주기적으로 말린 톱밥을 식민지에 추가하여 유충이 번데기를 겪을 때 돕고 작업자가 둥지 상자를 깨끗하게 유지하도록 돕습니다. 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 미세 주입 바늘을 당깁니다. 사용 중인 유리가 먼지가 없고 깨끗한 환경에 보관되었는지 확인하십시오.

2단계 프로세스를 사용하여 미세 주입 바늘을 당깁니다. 첫 번째 단계에서 열을 575로, 필라멘트를 3으로, 속도를 35로, 지연을 145로, 당김을 75로 설정합니다. 두 번째 단계에서는 열을 425로, 필라멘트를 0으로, 속도를 15로, 지연을 128로, 당김을 200으로 설정합니다.

결과 바늘에 2mm 테이퍼와 0.5 마이크로 미터의 팁이 있는지 확인하십시오. 바늘을 뽑은 후에는 사용할 때까지 먼지가없고 깨끗한 환경에 보관하십시오. 카제인 단백질과 시험관 내에서 합성된 소형 가이드 RNA의 미세주입 혼합물을 준비합니다.

미세 주사 바늘을 넣을 때까지 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오. 사용하지 않을 때는 미세 주입 혼합물을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 사출 매개변수를 사출 압력 140헥토파스칼, 일정 압력 70헥토파스칼, 시간 0.4초로 설정합니다.

재료가 한 방향으로만 흐르도록 일정한 압력을 조정하고 바늘에서 배아로 물질이 흐르지 않는 경우에만 주입 압력과 시간을 조정합니다. 마이크로 로더 피펫 팁을 사용하여 2 마이크로 리터의 혼합물로 마이크로 주입 바늘을로드합니다. 혼합물에 기포가 형성되지 않도록 천천히 수행하십시오.

좁은 테이퍼가 유지되도록 테이프 가장자리를 따라 바늘 끝 만 부러 뜨립니다. 바늘이 끝이 열릴 정도로 부러졌는지 확인하되 테이퍼가 부러질 정도는 아닙니다. 그런 다음 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하십시오.

세포분열 없이 핵이 분열하는 세포융합 단계에서 미세 주입을 위한 배아를 선택합니다. 유리 현미경 슬라이드에 붙인 양면 테이프 판에 배아를 정렬하고 주사 중 움직임을 방지하기 위해 테이프에 잘 고정되었는지 확인합니다. 각 배아의 측면이 테이프의 가장자리에 오도록 배아를 수직 방향으로 놓습니다.

슬라이드와 라이닝된 배아를 지정된 미세 주입 워크스테이션의 현미경 스테이지에 놓습니다. 미세 조작기를 사용하여 주사 할 첫 번째 배아와 바늘을 정렬하고 현미경으로 등쪽 또는 복부 축을 따라 첫 번째 배아를 옆으로 뚫습니다. 미세 주입 혼합물을 주입하고 주입 된 액체로 인한 내부 압력의 증가를 나타내는 배아의 약간의 움직임을 찾으십시오.

또한 배아의 외막에 눈에 보이는 조직이나 지질의 흔적을 포함하는 작은 물방울이 형성되는지 관찰하십시오. 배아에서 바늘을 부드럽게 제거하고 현미경 슬라이드의 위치를 조정하여 다음 배아로 진행합니다. 모든 배아가 주입 될 때까지 반복하십시오.

슬라이드의 모든 배아가 성공적으로 주입되면 슬라이드를 습한 상자에 1시간 동안 옮겨 슬라이드에서 제거하기 전에 배아가 회복될 시간을 줍니다. 배양 후 슬라이드를 에탄올로 씻고 페더 웨이트 겸자를 사용하여 테이프에서 주입 된 배아를 부드럽게 제거하고 소량의 70 % 에탄올로 채워진 튜브로 옮깁니다. 튜브를 여러 번 뒤집습니다.

작고 부드러운 붓을 사용하여 주입 된 모든 배아를 2 % 항생제 항진균제가 함유 된 1 % 한천 플레이트로 옮깁니다. 플레이트를 섭씨 25도에서 약 4 주 동안 배양하여 정기적으로 부화를 확인합니다. 첫 번째 배아가 유충으로 부화하면 모든 배아와 유충을 둥지 상자에 넣고 몇 명의 젊은 간호사와 함께 부화한 새끼를 돌봅니다.

이전에 입증 된 방법에 따라 식민지를 유지하십시오. 이 프로토콜은 Harpegnathos saltator 배아에서 게놈 편집을 성공적으로 수행하는 데 사용되었습니다. 결과는 주입된 배아에서 추출한 DNA의 PCR 및 pGEM 클로닝을 통해 검증되었으며, 이어서 DNA 시퀀싱이 이어졌습니다.

이 프로토콜을 사용한 체세포 돌연변이 유발의 효율은 약 40%F1 돌연변이 수컷을 야생형 암컷과 교배하여 이형접합체 F2 암컷을 생산하고, 짝짓기를 하지 않으면 F3 수컷을 생산했습니다. 돌연변이 F3 수컷은 F4 동형접합체 돌연변이 암컷을 생산하기 위해 이형접합체 암컷과 교배되었다. 성공적인 돌연변이 유발의 결과로, 표적 유전자의 손실과 상관 관계가있는 비정상적인 행동이 관찰되었다.

Orco의 손실은 페로몬 감지의 상실, 먹이를 감지 할 수 없음, 번식력 장애 및 식민지에서 방황하는 것과 관련이 있습니다. 이 프로토콜을 수행 할 때 주사 중 배아 손상을 최소화해야합니다. 이것은 바늘 끝이 너무 넓게 열리지 않도록하고 주사 할 때 바늘을 천천히 움직여서 수행 할 수 있습니다.

유사한 기술을 사용하여 형질 전환 개미를 생성하고 유지할 수 있으며, 이는 신경 활동 및 행동을 조사하기 위한 보다 정교한 도구를 제공할 것입니다. CRISPR 매개 신경 발생은 꿀벌, 클론 침입자 개미 및 불개미와 같은 다른 진사회적 곤충 종에서 사용되었습니다. 유전자 변형은 진사회적 곤충의 발달, 생리학 및 사회적 행동에 대한 기능적 연구를 촉진할 것입니다.