Name: 기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 17 s
Description: 학습하세요 고체상 합성법으로 스피로사이클릭 옥심을 합성하고 MTT 분석으로 COS7 세포의 세포독성을 평가하는 방법을. 이 기술은 암 연구와 신약 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 교수 연구위원회에서 K.S.H. (연구 및 보조금 사무소, Azusa Pacific University-USA)에 대한 보조금으로 지원되었습니다. ANG와 JFM은 학술 학부 연구 경험 (SURE) 펠로우십의 수혜자입니다. SKM과 BMR은 STEM Research Fellowship Grants (미국 Azusa Pacific University-Science 연구 센터)의 수혜자입니다. 생물학적 분석에 대한 지침을 주신 Matthew Berezuk 박사와 Philip Cox 박사에게 감사드립니다.

알림: 이 프로토콜에 사용되는 여러 화학 물질 및 생물학적 시약은 독성이 있고 발암성입니다. 사용하기 전에 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 실험을 시작하기 전에 적절한 개인 보호 장비(산업안전보건청에서 승인한 안전 고글, 적절한 장갑, 실험실 코트, 전신 바지 및 발가락이 막힌 신발)를 사용하십시오. 또한 합성을 수행하고 독성 화학 물질 및 시약(흄 후드)을 취급할 때 적절한 안전 관행을 채택하십시오.
1. 스피로 사이 클릭 헤테로 사이클 6 및 7의 고체상 합성
참고 : 합성은 이전에 출판 된 작업11,12를 기반으로했습니다. 업데이트 된 프로토콜은 삼환 헤테로 사이클의 테트라 부틸 암모늄 플루오 라이드 촉매 개환이 필요하지 않았 음을 보여 주므로 제거는 합성 절차를 단축시킵니다.
<ol><li>마이클은 REM 링커에 푸르푸릴아민을 첨가합니다(지속시간: 설정 25분 + 반응 시간 24시간).<ol><li>1 g (1 당량])의 REM 수지, 20 mL (20 당량)의 디메틸포름아미드 (DMF), 및 2.4 mL의 푸르푸릴아민을 25 mL 고체상 반응 용기에 첨가한다. 반응 개시 후 24시간 동안 실온에서 반응 용기를 교반합니다. 알림: 수지가 용기 바닥에 놓이지 않도록 철저히 혼합하십시오.</li>
		<li>반응이 완료된 후 수지를 DMF 1x로 세척한다. 그런 다음 디클로로 메탄 (DCM)과 메탄올을 번갈아 가며 4 회 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>탠덤 마이클 추가/1,3-쌍극자 고리화첨가를 수행합니다(지속시간: 설정 25분 + 반응 시간 48시간).<ol><li>건조 수지에, 1.48 mL (5 당량)의 트리에틸아민 (TEA), 0.637 g (2 당량)의 니트로-올레핀, 및 10 mL의 건조 톨루엔을 반응 용기에 첨가한다.</li>
		<li>그런 다음 1.085mL(4당량)의 트리메틸실릴 클로라이드(TMSCl)를 환기가 잘 되는 흄 후드의 반응 용기에 추가합니다. 알림: 이 반응은 HCl 가스를 생성하므로 가스가 흄 후드 아래에서 방출될 때까지 반응 용기를 덮지 마십시오.</li>
		<li>반응 용기를 단단히 캡핑하고 실온에서 48시간 동안 교반합니다. 알림: 수지와 시약의 완전한 혼합을 확인하십시오.</li>
		<li>5mL의 메탄올을 사용하여 반응을 진정시킵니다.</li>
		<li>용기를 배수하여 용액을 제거한 다음 DCM과 메탄올을 번갈아 가며 4 번 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수지 결합 헤테로사이클의 N-알킬화를 수행하여 4차 아민을 형성합니다(기간: 설정 10분 + 반응 시간 24시간).<ol><li>반응 용기 내의 건조 수지에, 5 mL의 DMF 및 10 당량의 알킬 할라이드를 첨가하고, 실온에서 24 h 동안 교반한다. 알림: 시약과 수지의 철저한 혼합을 확인하십시오.</li>
		<li>반응이 완료된 후 수지를 DMF 1x로 세척한다. 그런 다음 DCM과 메탄올을 번갈아 사용하여 4x 세척하십시오. 세척 후 반응 용기에서 수지를 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>폴리머 지지체로부터의 절단을 위해 4차 아민의 β 제거를 수행합니다(기간: 설정 15분 + 반응 시간 24시간).<ol><li>반응 용기 내의 건조 수지에, 3 mL의 DCM 및 1.49 mL (5 당량)의 TEA를 첨가하여 중합체 지지체로부터 헤테로사이클을 절단한다.</li>
		<li>반응 혼합물을 24시간 동안 교반하여 수지와 용액이 완전히 혼합되도록 합니다. DCM과 메탄올을 번갈아 가며 4 번 세척하십시오. 모든 세척에서 용리를 수집하고 회전 증발을 통해 농축하십시오.</li>
		<li>메탄올로 분쇄하여 스피로사이클릭 옥심을 정제한다. 세척 후 반응 용기에서 수지를 완전히 건조시켜 향후 실험에서 재사용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MTT 14를 이용한 세포독성 분석
<ol><li>희석제로 멸균 인산염 완충 식염수(PBS, 물 중 0.9% NaCl)를 사용하여 5mg/mL MTT 용액 20mL를 준비합니다. 여과하고 -20 °C에서 보관하십시오. 그런 다음 무혈청 세포 배양 배지(DMEM)에서 2.1단계의 MTT 용액을 1:1 희석하여 준비합니다.</li>
	<li>디메틸설폭사이드(DMSO) 중 100mM, 10mM, 1mM, 100μM, 10μM, 1μM, 1μM, 0.1μM 및 0.01μM의 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 각각 1mL의 저장 용액을 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오. 1.5mL 튜브의 무혈청 배지에서 스톡 농도 1:1000을 희석하여 시험 화합물의 작업 용액 용량당 200μL를 준비합니다.</li>
	<li>조직 배양 후드에서 COS-7 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포, Cercopithecus aethiops 신장)를 완전 배지[10% 소 태아 혈청(FBS)가 포함된 DMEM]에 다중 채널 피펫터를 사용하여 웰당 4 × 103 cells/200 μL의 농도로 평평한 바닥, 조직 배양 처리된 96웰 플레이트에 시드합니다. COS-7 세포는 (1) 세포 독성 분석에 일반적으로 사용되는 세포이고 (2) 기관에서 이미 사용 가능했기 때문에 선택되었습니다.</li>
	<li>COS-7 세포를 5%CO2를 함유하는 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>진공 펌프에 부착 된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 웰에서 상청액을 흡입합니다. 세포를 단계 2.2에서 제조된 작업 용액을 사용하여 시험 화합물과 함께 삼중으로 투여한다(표 1 참조). 단계 2.4에 설명된 대로 세포를 배양합니다.</li>
	<li>우물에서 상청액을 흡인하십시오. 각 웰에 200μL의 MTT 용액을 추가합니다. 5%CO2 를 함유하는 분위기에서 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>보라색 포르 마잔 결정을 방해하지 않고 우물에서 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 각 웰에 200μL의 DMSO를 첨가하여 보라색 포르마잔 결정을 용해시킵니다. 실온에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>96웰 플레이트 리더를 사용하여 각 웰에 대해 590nm14 또는 600nm에서 흡광도를 측정합니다. 세포가 없는 웰을 배경으로 사용하고 흡광도 값을 평균화합니다. 각 처리된 웰의 흡광도 값에서 평균 흡광도 배경값을 뺀다. 데이터를 평균 제로 투여량 값의 백분율로 정규화합니다(3개의 0-투여량 값의 평균). y축에 데이터 플로팅: 선형(% 상대 세포 생존율); x 축 : 로그 (농도). 각 계열을 개별 곡선으로 플로팅합니다(예: 삼중 데이터에는 3개의 곡선이 있어야 함).</li>
</ol>

<ol><li>Shangary, S., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+to+reactivate+p53+function%3A+a+novel+approach+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction to reactivate p53 function: a novel approach for cancer therapy.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 49, 223-241 (2009).</li>
<li>Zhao, Y., Aguilar, A., Bernard, D., Wang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+the+MDM2-p53+protein-protein+interaction+%28MDM2+inhibitors%29+in+clinical+trials+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of the MDM2-p53 protein-protein interaction (MDM2 inhibitors) in clinical trials for cancer treatment.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 58 (3), 1038-1052 (2015).</li>
<li>Paolo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+virtual+screening+protocol+to+identify+promising+p53-MDM2+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">An effective virtual screening protocol to identify promising p53-MDM2 inhibitors.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 56 (6), 1216-1227 (2016).</li>
<li>Shieh, S. Y., Ikeda, M., Taya, Y., Prives, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+phosphorylation+of+p53+alleviates+inhibition+by+MDM2%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.</a> Cell. 91 (3), 325-334 (1997).</li>
<li>Hwang, B. J., Ford, J. M., Hanawalt, P. C., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+p48+xeroderma+pigmentosum+gene+is+p53+dependent+and+is+involved+in+global+genomic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Expression of the p48 xeroderma pigmentosum gene is p53 dependent and is involved in global genomic repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 424-428 (1999).</li>
<li>Oliner, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoprotein+MDM2+conceals+the+activation+domain+of+tumor+suppressor+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncoprotein MDM2 conceals the activation domain of tumor suppressor p53.</a> Nature. 362, 857-860 (1993).</li>
<li>Nag, S., Qin, J., Srivenugopal, K. S., Wang, M., Zhang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MDM2-p53+pathway+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">The MDM2-p53 pathway revisited.</a> Journal of Biomedical Research. 27 (4), 254-271 (2013).</li>
<li>Bond, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+nucleotide+polymorphism+in+the+MDM2+promoter+attenuates+the+p53+tumor+suppressor+pathway+and+accelerates+tumor+formation+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single nucleotide polymorphism in the MDM2 promoter attenuates the p53 tumor suppressor pathway and accelerates tumor formation in humans.</a> Cell. 119 (5), 591-602 (2004).</li>
<li>Isobe, M., Emanuel, B. S., Givol, D., Oren, M., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+gene+for+human+p53+tumor+antigen+to+band+17p13%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of gene for human p53 tumor antigen to band 17p13.</a> Nature. 320 (6057), 84-85 (1986).</li>
<li>Gupta, A. K., Bharadwaj, M., Kumar, A., Mehrotra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiro-oxindoles+as+a+promising+class+of+small+molecules+inhibitors+of+p53-MDM2+interaction+useful+in+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Topics+in+Current+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Spiro-oxindoles as a promising class of small molecules inhibitors of p53-MDM2 interaction useful in targeted cancer therapy.</a> Topics in Current Chemistry. 375 (1), 1-25 (2017).</li>
<li>Griffin, S. A., Drisko, C. R., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+heterocycles+as+precursors+to+functionalized+spirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Tetrahedron+Letters%22%5BJournal%5D)">Tricyclic heterocycles as precursors to functionalized spirocyclic oximes.</a> Tetrahedron Letters. 58, 4551-4553 (2017).</li>
<li>Drisko, C. R., Griffin, S. A., Huang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+synthesis+of+%5B4.4%5Dspirocyclic+oximes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Solid-phase synthesis of [4.4]spirocyclic oximes.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58508(2019).</li>
<li>Lawrence, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linked+parallel+synthesis+and+MTT+bioassay+screening+of+substituted+chalcones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Combinatorial+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Linked parallel synthesis and MTT bioassay screening of substituted chalcones.</a> Journal of Combinatorial Chemistry. 3 (5), 421-426 (2001).</li>
<li>MTT assay protocol. , Modified procedure from 
 .
 (2020).</li>
</ol>

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스피로 클릭 화합물의 합성은이 실험실에서 수행 한 이전 연구를 기반으로했지만 일부 수정되었습니다 (그림 1)11,12. 각 반응 단계의 진행을 IR 분광법으로 모니터링하였다. 마이클푸르푸릴아민과 함께 REM 링커 1의 첨가는 중합체 결합 2(IR 1722 cm-1 → 1731 cm-1)를 제공하였다. 이전 보고로부터, ISOC 2는 TMS 기의 검출에 의해 확인된 바와 같이 삼환 헤테로시클릭 화합물 3을 생성하였다(IR 1214 cm-1). 이것은 ISOC가 제품의 필요한 위치 및 입체 선택성을 제공했기 때문에 합성의 중요한 단계입니다....

소분자 E3 유비퀴틴-리가아제 마우스의 이중 분2 동족체(MDM2)와 p53의 상호작용의 억제는 종양 세포 사멸 1,2,3의 p53 매개 유도를 회복시키는 것으로 알려져 있다. MDM2는 p53 경로의 음성 조절자이며 종종 암세포 4,5,6,7,8,9에서 과발현됩니다. 최근의 결정학적 및 생화학적 연구에 따르면 스피로사이클릭 프레임워크를 포함하는 소분자가 MDM2-p53 상호작용을 효과적으로 억제할 수 있음이 밝혀졌습니다10. 스피로사이클릭 프레임워크(그림 1, 파란색으로 음영 처리됨)는 이 단단한 직교 고리 시스템의 유도체화가 새로운 치료 약물의 발견으로 이어짐에 따라 특권적인 모티브로 간주됩니다. 이 흥미로운 아키텍처에 접근하는 것은 전통적인 유기 합성 기술을 사용할 때 어려움을 겪습니다. 생물학적 시스템에서 스피로 사이 클릭 분자의 치료 효과가 조사되었지만 이러한 분자의 합성은 여전히 번거로운 과정입니다. 가혹한 조건을 사용하는 원치 않는 부산물 및 위험한 전이 금속은 종종 문제가됩니다.
약물 개발에서 스피로 사이 클릭 모티프의 잠재적 인 사용은 다른 상호 교환 가능한 작용기11,12 이외에 모티프를 갖는 분자 라이브러리를 생성하기 위해 고체상 합성을 활용하는 프로토콜의 개발로 이어졌다. 단계 간 생성물과 반응물의 분리는 수지 비드와 고체상 필터 용기에 부착된 REM 링커를 간단히 활용하여 달성할 수 있습니다. 이것은 단계를 줄이고 잠재적으로 수율을 증가시킬 것입니다. 이 합성 접근법은 많은 잠재적 인 약물 후보를 생성 할 수 있습니다. 그러나 생물학적 시스템에서 이러한 분자의 효과는 추가 조사가 필요합니다.
이들 스피로사이클릭 화합물의 세포독성을 결정하기 위해, MTT 분석13,14를 사용하였다. 이 방법은 세포 생존율을 측정하고 세포 세포 독성을 간접적으로 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 96웰 플레이트에서 배양된 세포에 다양한 농도의 억제제를 첨가하고, 보라색 포르마잔 화합물에 대한 미토콘드리아 탈수소효소에 의한 노란색 MTT의 감소 정도를 비색 분석으로 비색 분석하여 측정했습니다(그림 2). 활성은 가장 자주 IC 50 값, 즉 세포 성장이 처리되지 않은 대조군에 비해50% 억제되는 농도로 보고됩니다. 이 논문은 MTT 분석의 프로토콜과 이러한 새로운 스피로 사이클릭 분자의 예비 결과를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>CELLS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>COS-7 세포 (ATCC CRL-1651)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>아프리카 녹색 원숭이 신장 세포</td></tr><tr><td>CHEMICALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Bromooctane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152951</td><td>Alkyl-halide</td></tr><tr><td>Allylbromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>337528</td><td>알킬-할라이드</td></tr><tr><td>벤질브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>B17905</td><td>알킬-할라이드</td></tr><tr><td>시스플라틴</td><td>케이맨 화학</td><td>13119</td><td>세포독성 제어</td></tr><tr><td>디클로로메탄(DCM)</td><td>시그마-알드리치</td><td>270997</td><td>용매</td></tr><tr><td>디메틸포름아미드(DMF)</td><td>시그마-알드리치</td><td>227056</td><td>용매</td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>276855</td><td>용매</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, L-글루타민</td><td>포함 Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>FBS (태아 소 혈청)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>세포 배양 매체</td></tr><tr><td>Furfurylamine</td><td>Acros 유기물</td><td>119800050</td><td>시약&nbsp;</td></tr><tr><td>요오도메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>289566</td><td>알킬-할라이드</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34860</td><td>용매</td></tr><tr><td>MTT((3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>Calbiochem 475989-1GM</td><td>시약</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-507</td><td>세포 배양 배지</td></tr><tr><td>REM 수지</td><td>Nova Biochem</td><td>8551010005</td><td>폴리머 지지체; 0.500 mmol/g 로딩</td></tr><tr><td>트랜스-&beta;-니트로스티렌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N26806</td><td>니트로-올레핀 시약</td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td>용매</td></tr><tr><td>트리에틸아민(TEA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0886</td><td>베타 제거</td></tr><tr><td>트리메틸실릴 클로라이드(TMSCl)</td><td>용 시약시그마-알드리치</td><td>386529</td><td>시약; 주의 - 변동성이 높음; HCl gas</td></tr><tr><td>GLASSWARE/INSTRUMENTATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 mL 고체상 반응 용기</td><td>생성 Chemglass</td><td>CG-1861-02</td><td>필터가 있는 유리 제품</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 리더</td><td>Promega (Turner Biosystems)</td><td>9310-011</td><td>기기</td></tr><tr><td>AVANCE III NMR 분광계</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>기기;300MHz를 생성합니다. 용매: CDCl3 및 CD3OH</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nicole iS5</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAADGAAGFAHDMAZA</td><td>기기</td></tr><tr><td>손목 액션 쉐이커</td><td>Burrell Scientific</td><td>757950819</td><td>기기</td></tr></tbody></table>

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

Functionalized Spirocyclic Heterocycle Synthesis and Cytotoxicity Assay

스피로 사이 클릭 헤테로 사이클은 최근 암 치료를위한 잠재적 인 약물로 문헌에서보고되었습니다. 이러한 새로운 직교 고리 시스템의 합성은 어렵습니다. 이들 화합물을 합성하기 위한 효율적인 방법론이 최근에 발표되었는데, 이는 이전에 보고된 5단계가 아닌 4단계로 고체상 합성을 기술하였다. 이 짧은 합성의 장점은 독성 시약의 사용을 제거하는 것입니다. 저로딩 재생 마이클(REM) 링커 기반 수지는 고로딩 버전이 부피가 큰 페닐 및 방향족 측쇄를 포함하는 시약의 첨가를 방지하므로 합성에 중요한 것으로 밝혀졌습니다. 비색 3- (4 ', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT) 분석을 사용하여 시험관 내에서 이러한 새로운 스피로 사이 클릭 분자의 마이크로 몰 농도의 세포 독성을 조사했습니다. MTT는 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며 비교적 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 생성하므로 이 분석은 이러한 스피로사이클릭 헤테로사이클에 이상적입니다. 직교 고리 구조 뿐만 아니라 푸르푸릴아민(유사한 5-원 고리 모티프를 함유하는 합성 방법의 전구체)을 시험하였다.

스피로사이클릭 옥심 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성되었습니다(그림 1). 마이클-푸르푸릴아민을 REM 링커 1b에 첨가하여 중합체-결합된 수지 2를 수득하였다. 반응의 진행은 1722 cm-1에서 α,β- 불포화 에스테르의 소실을 검출함으로써 적외선 (IR) 분광법에 의해 모니터링되었다 (그림 3). 스피로사이클릭 결합 수지 4는 일시적인 중간체 3을 통해 2로부터 형성되었다. 4의 메탄올 가수 분해는 3-[(3E)-(2S, 4R) -2- 페닐 -3- 히드 록시 이미노 4- 히드 록시 메틸 - 피 롤리 딘 -1- 일] - 프로피온산 메틸 에스테르 7을 생성하고, 알킬화 후 β- 제거 (3E) - (2S, 4R) -4- 히드 록시 메틸 -1- 메틸 -2- 페닐 -3- 피 롤리 딘 옥심 6. 스피로 사이 클릭 옥심의...

여기에서는 이전에 합성 된 스피로 사이클릭 옥심을 테스트하기 위해 3- (4', 5'- 디메틸 티아 졸 -2'- 일) -2,5- 디 페닐 테트라 졸륨 브로마이드 (MTT)를 사용하는 생물학적 분석에 대해 설명합니다.

Spirocyclic heterocycles have recently been reported in literature to be potential drugs for cancer therapy. The synthesis of these novel orthogonal ring ...

이 프로토콜은 스피로 클릭 화합물을 생산할 때 재활용 가능하고 변형 된 방법을 사용합니다. MTT 분석은 이러한 새로운 분자의 세포 독성과 관련된 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술은 재생 출발 물질을 사용하여 새로운 변형 가능한 분자를 생산합니다.MTT 분석은 이전에 입증된 바와 같이 스피로사이클릭 헤테로사이클 6 및 7의 고체상 합성을 수행하여 시작하는 비교적 빠르고 쉬운 생물학적 결과를 제공합니다. 희석제로 멸균 PBS를 사용하여 밀리리터당 5밀리그램의 MTT 용액 20밀리리터를 준비합니다. 용액을 여과하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.이어서, DMEM에서 MTT 용액의 일대일 희석액을 준비한다. DMSO에서 테스트 화합물의 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 각각 1 밀리리터의 스톡 용액을 준비하십시오. 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.스톡 농도를 희석하여 시험 화합물의 작업 용액 당 200 마이크로 리터를 준비하십시오. 혈청이없는 배지에서 1에서 1000까지. 조직 배양 종자에서, COS 7 세포를 평평한 바닥 조직 배양 위에 완전한 배지로 웰 당 200 마이크로리터당 4, 000 세포의 농도로 96 웰 플레이트를 처리하였다.다중 채널 파이퍼 사용. 세포를 5%이산화탄소를 포함하는 분위기에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다. 다음날, 진공 펌프에 부착 된 유리 목초지 피펫을 사용하여 우물에서 상청액을 흡인하십시오.이전에 준비된 작업 용액을 사용하여 시험 화합물로 세포를 3 배로 투여하십시오. 그런 다음 세포를 인큐베이터로 되돌립니다. 24 시간 후, 웰에서 상청액을 흡입하고 각 웰에 200 마이크로 리터의 MTT 용액을 첨가한다.플레이트를 4 시간 동안 배양하십시오. 보라색 포르 마잔 결정을 방해하지 않고 우물에서 상청액을 부드럽게 흡인하십시오. 결정을 용해시키기 위해 각 웰에 200 마이크로 리터의 DMSO를 첨가하십시오.그런 다음 플레이트를 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 96웰 플레이트 리더를 사용하여 590 또는 600나노미터에서 각 웰의 흡광도를 측정합니다. 세포가 없는 웰을 배경으로 사용하고 흡광도 값을 평균화합니다.스피로사이클릭 곡스 이음새 6 및 7은 변형된 프로토콜을 사용하여 합성하였다. 반응의 진행은 적외선 분광법을 사용하여 알파 베타 불포화 에스더의 소멸을 검출함으로써 모니터링하였다. MTT 분석을 세포 생존율을 결정하기 위해 사용하였다.고농도에서 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 시스플라틴은 양성 대조군으로 작용했습니다. 예상대로, 시스플라틴의 농도가 높을수록 세포 생존율이 낮아진다. 이어서, MTT 분석을 사용하여 스피로사이클릭 화합물 6 및 7과 푸르푸릴아민을 시험하였다.푸르푸릴아민 및 스피로고사이클릭 심식스는 유사한 세포독성을 나타내었다. 그러나, 스피로 클릭 화합물 7의 독성은 푸르 푸릴 아민 및 6의 독성보다 눈에 띄게 컸다. 이 프로토콜을 시도할 때 부피가 큰 아실 할라이드를 사용하여 수행된 N-알킬화는 베타 제거 속도를 감소시켜 제품 수율을 감소시키는 것으로 나타났습니다.

functionalized-spirocyclic-heterocycle-synthesis-cytotoxicity

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

공기에 민감한 티탄 및 바나듐 항암제의 합성 방법은 MTT 분석에 의해 인간의 암 세포주를 향해 자신의 세포 상해 활성의 평가와 함께 설명한다.

MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

광산 및 브뢴스테드 산 촉매를 사용하여 아닐린을 사용한 C-H 기능화에 의한 제약 활성 인돌 유도체의 합성을 위한 2단계 절차가 설명됩니다.

중간 과산화물을 통해 광화학 및 산 - 촉매 CH 기능화에 의한 항 바이러스 Tetrahydrocarbazole 유도체의 합성 (CHIPS)

여기 선물이 spirocyclic heterocycles의 합성을 위한 효율적인 방법 설명 하는 프로토콜. 5 단계 프로세스 활용 고체 상 합성 및 마이클 링커 전략을 다시 생성 합니다. 일반적으로 합성 하기 어려운, 우리 다른 현대 접근에 그렇지 않으면 액세스할 수 spirocyclic 분자의 합성에 대 한 사용자 정의 방법 제시.

[4.4] Spirocyclic Oximes의 고체 상 합성

Enantiomerically 농축된 bispiro [γ-butyrolactone-pyrrolidin-4, 4'-pyrazolone] 해골 비대칭으로 간단한 organocatalytic 1, 3 배위 cycloaddition 반응을 통해 합성 됩니다.

Α-Imino γ-Lactones의 Organocatalytic Cycloadditions 및 Alkylidene Pyrazolones 통해 마약 같은 Bispirocyclic 장비의 효율적인 건설

클릭 가능한 moieties를 가진 모듈식 케이지 화합물의 광화학적 특성의 합성 및 측정을 위한 프로토콜이 제시된다.

클릭 가능한 케이지 화합물의 설계, 합성 및 광화학적 특성

금속이 없는 광촉매로서 자궁경부포린을 활용한 질소 함유 이종사이클의 합성을 위한 새로운 경로가 개발되었다.

세르코스포린-포토카탈루즈 [4+1]- 및 [4+2]-온화한 조건하에서 아졸케네스의 탄화

Claisen-Schmidt 응축 반응은 메틴 브리지 접합 된 비압 방향족 화합물의 생성을위한 중요한 방법론이다. 알돌 반응의 기저 매개 이체를 활용하면 일반적으로 저렴하고 운영적으로 간단한 합성 접근법을 통해 다양한 형광 및/또는 생물학적 관련 분자에 접근할 수 있습니다.

claisen-슈미트 응축 접근법을 이용한 pH 의존피라졸, 이미다졸, 이소인돌론 디피리네 플루오로포레스의 합성

티오펜설폰아미드 화합물은 Vibrio quorum sensing regulator LuxR/HapR의 강력하고 특이적인 억제제로서 생체 내 활성을 차단하여 독성, 운동성 및 생물막에 대한 유전자의 전사를 방지합니다. 이 프로토콜은 이러한 화합물을 합성하고, 실리코로 모델링하고, LuxR/HapR에 대한 활성을 위해 생체 내에서 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

Vibrio Quorum Sensing Inhibitors의 합성 및 분석

여기서는 신약 개발에 필수적인 Sanglifehrin A와 Cyclophilin A/Ganoderiol-F 간의 단백질-리간드 결합 상호작용을 구조 중심으로 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 리간드-수용체 복합체의 안정성은 분자 역학 시뮬레이션을 통해 평가되었습니다.

새로운 사이클로필린 A 억제제 및 가노데리올-F 유도체의 구조 유도 설계 및 개발: 실리코 내 접근법

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

여기서는 4-아미노퀴놀린 화합물의 화학적 합성, 결핵균에 대한 최소 억제 농도 결정, 포유류 세포주에서의 세포독성 평가를 포함하는 표현형 스크리닝을 통해 잠재적 항결핵 약물 후보를 식별하는 프로토콜을 제시합니다.

잠재적 항결핵 후보 식별: 포유류 세포에서 합성, MIC 결정 및 세포독성 평가에 대한 단계별 가이드

학습하세요 고체상 합성법으로 스피로사이클릭 옥심을 합성하고 MTT 분석으로 COS7 세포의 세포독성을 평가하는 방법을. 이 기술은 암 연구와 신약 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

기능화된 스피로사이클릭 헤테로사이클 합성 및 세포독성 분석

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